인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

이 방법의 전반적인 목표는 만능 줄기 세포의 분화를 균질한 층의 망막 색소 상피 세포로 효과적으로 유도하는 것입니다. 이 방법은 망막이 어떻게 발달하는지, 줄기 세포 질환 모델을 확립하는 방법과 같은 망막 및 안과 연구 분야의 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 즉흥적인 방법보다 빠르고 효율적이라는 것입니다.

이 방법은 성장 인자와 작은 분자의 조합을 사용하여 줄기세포의 분화가 14일 이내에 미성숙 RPE가 되고 3개월 후에 성숙한 기능적 RPE가 되도록 지시합니다. UC 산타바바라(UC Santa Barbara)의 줄기세포 생물학 및 공학 연구소(Laboratory for stem cell biology and engineering)의 부소장인 캐시디 아놀드(Cassidy Arnold)가 시연할 예정이다. 이 절차를 시작하려면 배양하기 전에 feeder-free, serum-free 조건에서 줄기세포 콜로니를 약 80%confluence까지 성장시킵니다.

그런 다음 제조업체 권장 사항에 따라 12웰 플레이트를 세포 외 매트릭스 기반 하이드로겔로 코팅하고 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 굳힙니다. 그 후, 0일차에 필요한 칼슘이나 마그네슘이 없는 망막 분화 매체와 PBS의 부피를 분취하고 수조에서 섭씨 37도까지 데웁니다. 다음으로 가열된 RDM에 성장 인자를 추가하고 EDTA를 실온으로 가져옵니다.

필요한 경우, 분화를 위해 계대측정될 줄기세포의 형태에 따라 P10 피펫 팁을 사용하여 분화된 모든 콜로니를 제거합니다. 콜로니 사이의 섬유아세포 세포와 콜로니 내의 불투명한 세포는 제거되어야 할 분화된 세포를 나타냅니다. 세포를 수동으로 제거하는 것은 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나인데, 완전히 분화되지 않은 줄기세포 집단으로 시작하면 보다 효율적인 농축이 가능하기 때문입니다.

다음으로, 줄기 세포에서 배지를 흡인하고 2ml의 예열된 PBS로 웰을 한 번 세척하여 6웰 플레이트의 단일 웰을 12웰 플레이트의 4웰로 만듭니다. 그런 다음 PBS를 흡인하고 웰당 1ml의 EDTA로 각 웰을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 플레이트를 부드럽게 기울이고 EDTA를 흡인합니다.

세포를 조기에 들어 올리는 것을 피하기 위해 어떤 식으로든 플레이트를 흔들지 마십시오. 세 번째 세척 후 EDTA 1ml를 다시 넣고 후드에서 실온에서 3-5분 동안 플레이트를 배양합니다. 이 배양 중에 플레이트를 방해하지 마십시오.

그런 다음 EDTA를 흡인하고 안착될 웰당 1ml의 RDM과 0.5ml의 추가 매체를 추가합니다. 예를 들어, 6웰 플레이트의 1웰을 4.5밀리리터의 RDM으로 세척하여 12웰 플레이트의 4웰에 플레이트를 만듭니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 분리합니다.

웰에서 위아래로 5회 피펫팅하여 RDM의 세포를 분쇄하고 이 단계를 신속하게 완료하여 플레이트에 다시 부착되지 않도록 합니다. 원뿔형 튜브에 넣습니다. 큰 세포 덩어리를 해리하되 단일 세포 현탁액으로 분해하지 않습니다.

피펫에 세포를 고르게 분포시키고 이 단계를 신속하게 완료하여 플레이트에 다시 부착되지 않도록 합니다. 원하는 경우 광학 현미경을 사용하여 세포 덩어리의 크기를 관찰합니다. 그런 다음 ECM 코팅된 12웰 플레이트에 세포를 파종합니다.

플레이트를 앞뒤로 기울여 웰 전체에 세포를 고르게 분포시키고 다음 배지가 바뀔 때까지 섭씨 37도, 5%CO2의 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다. 이 절차에서는 제조업체 권장 사항에 따라 성장 인자 감소 ECM으로 6웰 플레이트를 코팅합니다. 섭씨 4도에서 밤새 실온에서 1시간 동안 설정하십시오.

그런 다음 필요한 DPBS의 양과 농축 웰당 RDM 1ml를 분취하고 수조에서 섭씨 37도까지 가열합니다. 트립신과 같은 효소를 실온에 놓고 필요한 양의 RPE를 지지하는 매체를 섭씨 37도까지 가열합니다. 그 후, RSM에 항균 시약과 ROCK 억제제를 첨가하여 0.5x 항균 및 10 마이크로몰 ROCK 억제제의 최종 농도를 달성합니다.

애착을 개선하기 위해 처음 4-7일 동안 이 매체를 사용하십시오. 다음으로, 모든 웰에서 사용된 배지를 흡인하고 성장 인자 없이 예열된 RDM을 웰당 1밀리리터를 추가합니다. 필요한 경우 해부 현미경으로 P10 피펫 팁을 사용하여 모든 비 RPE 세포를 해부하고 긁어냅니다.

해부 후 RDM과 모든 세포 파편을 흡인하고 웰당 1ml의 예열된 DPBS로 두 번 세척합니다. 그런 다음 12웰 플레이트의 웰당 0.5ml의 TDE를 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 부드럽게 제거합니다.

세포 효소 현탁액을 3-4회 위아래로 피펫팅하여 균일한 현탁액을 만듭니다. 다음으로, ROCK 억제제 없이 예열된 RSM에서 세포 효소 현탁액을 1:10의 비율로 희석합니다. 173g의 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.

5분 후, 세포 펠릿에서 배지를 흡인하고 10 micromolar ROCK inhibitor로 RSM에서 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 40마이크로미터 기공이 있는 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 사용하여 세포를 변형시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 변형된 용액의 세포 농도를 계산합니다.

그 후, 성장 인자를 감소시킨 ECM 코팅 플레이트에 세포를 10 마이크로 몰 ROCK 억제제가 함유 된 RSM 4 밀리리터의 평방 센티미터당 5 개의 세포에 한 번에 10 배로 파종합니다. 세포 파종 후 48시간 후에 RSM을 10 micromolar ROCK inhibitor로 교체하고 3-4일마다 배지를 계속 교체합니다. 4-7일 후에 RSM에 ROCK 억제제 추가를 중단합니다.

세포가 섭씨 37도, CO2 5%에서 28-35일 동안 성숙할 때까지 기다렸다가 3-4일마다 RSM을 계속 교체합니다. 여기에 표시된 것은 분화를 위한 계대 배양 직전에 유도된 만능 줄기 세포입니다. 줄기세포는 작고 군집 내에 조밀하게 밀집되어 있으며, 이는 군체 내의 섬유아세포 또는 불투명한 통로와 같은 분화된 세포를 포함하지 않는 것으로 보입니다.

다음은 2일차의 미성숙 RPE 세포입니다. 이 단계의 셀은 여전히 subconfluent 상태여야 하며 셀 사이의 빈 공간으로 돌출부를 확장해야 합니다. 이 세포는 14일째에 농축을 제거하기 위해 선택하기 전입니다.

비 RPE 셀은 패치 또는 불투명한 리본으로 나타납니다. 둥근 패치는 섬유아세포 형태를 가진 세포를 포함하는 반면 불투명한 패치는 신경 망막으로 생각됩니다. 이 이미지는 30일째 0회, 1회, 3일차의 RPE를 보여줍니다.

각 통로에서 세포는 합류해야 하며 phasebright 경계와 다각형 모양을 포함하여 망막 색소 상피 형태의 특징을 가지고 있는 것처럼 보여야 합니다. 일단 숙달되면 계류 및 농축 기술은 세포 배양의 규모에 따라 1-2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 유전자 또는 단백질 정량화 및 기능 분석과 같은 기술을 사용하여 성장 인자 또는 식세포작용 외부 분절을 분비하는 RPE의 능력에 대한 질문에 답할 수 있습니다.

2013년 Dave Buchholz와 2015년 Lindsay Leach가 발표한 논문에서는 이 방법의 개발 및 최적화에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 해당 분야의 연구자들이 쉽게 사용할 수 있도록 절차의 각 단계에 대한 상세하고 철저한 시연을 제공했습니다. 즐거운 실험이 되시길 바랍니다.