Name: 인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 배우세요 인간 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 성장 인자와 소분자를 이용해 망막 안료 상피 세포로의 신속하고 효율적인 감독 차별화 방법을. 이 프로토콜은 14일 만에 미성숙 RPE를 생성하고 세 달 후 성숙한 기능성 세포를 얻어 망막 질환 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품 재생 의학 (CIRM; DR1 01444, CL1 00521, TB1-01177, FA1 00616 및 TG2-01151 보조금), 버몬트 커뮤니티 재단, Breaux 재단, 비전, 캘리포니아 연구소에 대 한 화 환 이니셔티브에 의해 지원 되었다 그리고 기초 싸우는 장 님 윈 Gund 변환 연구 가속 프로그램.

1. 프로토콜의 하루 14 일 0 시 약 준비 <ol><li>다음 중간 구성 요소 준비: 100 x N2 보충의 2 개 mL의 1 mL을 추가 하 여 <ol><li>망막 차별화의 만들 100 mL 매체 (RDM) 50 x B27 보충, 및 비 본질적인 아미노산 (NEAA) Dulbecco의 96 mL에 x 100의 1 mL &#39; s 수정 필수 매체/영양소 혼합 F12 9 (DMEM/F12).</li>
		<li>게 10 mL의 멸 균 물, vortexing, 볼륨 살 균 물 10 mL에 8 mL에 NIC의 녹이는 1.221 g 1 M 니코틴 (NIC)의. 멸 균 필터 솔루션.</li>
	</ol></li> <li>다음 성장 요인 및 작은 분자 준비: <ol><li>Reconstitute 재조합 마우스 머리, 인간 dickkopf WNT 신호 통로 억제제 1 (DKK-1), 100 µ g/ml 각 0.1% 소 혈 청 알 부 민에 IGF-1 (BSA) 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS). 필요에 따라 약 수와 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 저장소.</li>
		<li>다시 10 µ g/mL 및 재조합 형 인간/마우스/쥐 Activin A를 100 µ g/mL 각 PBS에 0.1 %BSA FGF-기본 구성. 필요에 따라 약 수와 최대 1 년-80 ° C에서 저장소.</li>
		<li>Reconstitute 수 5402 (FGF 수용 체 특정 티로신 키 니 아 제 억제 물) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase 키 3, GSK-3β, 억제제) 10 m m 각 디 메 틸 sulfoxide (DMSO). 약 수와 최대 1 년 또는 6 개월,-20 ° C에 게 각각.</li>
	</ol></li> <li>하루 0 / 하루 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (EDTA PBS의 1 L 당 0.2 g), 1 X PBS-/-다음을 얻기 없이 칼슘 또는 마그네슘, pH 7.4 (PBS), 1 x 트립 신 같은 분리 효소 (TDE) DPBS (Dulbecco &#39; s PBS), RPE 지원 매체 (RSM), 및 Y-27632 dihydrochloride (10 µ M에서 사용).</li>
</ol> 2. : 0 하루 차별화 Pluripotent 줄기 세포 통로의 뿌리고 전에 약 80% 합류 급지대, 혈 청 없는 조건에서 <ol><li>성장 줄기 세포 식민지. 
	참고:이 단계를 최적화에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>코트 12 잘 플레이트 세포 외 매트릭스 기반 하이드로 겔 (ECMH) 제조 업체의 권장 사항에 따라와. 또는 하룻밤 4 실 온에서 1 h에 대 한 설정 하려면 허용 ° c.</li>
	<li>RDM와 PBS-/-성장 요소를 추가 하기 전에 하루에 0 하 고 37 ° C에 물 욕조에 따뜻한 필요한 양의 약 수. 실내 온도에 EDTA를 가져올.</li>
	<li>는 10mm NIC, 50 ng/mL 머리, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1으로 따뜻하게 RDM 0 하루에 필요한 성장 인자를 추가합니다. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가 NIC의 100 µ L, 머리의 5 µ l, 1 µ L DKK-1, 그리고 IGF-1의 1 µ L RDM의 10 mL.</li>
	<li>모든 차별화 된 식민지에서 차별 화를 위한 passaged 줄기 세포 형태에 따라 제거를 선택 합니다. P10 피펫으로 팁을 사용 하 여 수동으로 제거 하는 차별화 된 셀. 
	참고: 식민지 내의 불투명 셀 뿐만 아니라 식민지 사이 Fibroblastic 셀 제거할 차별화 된 셀을 나타냅니다. 차별화 된 셀에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>12-잘 접시 (1:4)의 4 우물으로 6 잘 플레이트의 단일 잘 통과. 
	참고:이 단계에서 줄기 세포를 뿌리고에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
	<ol><li>줄기 세포에서 줄기 세포 중간 발음 하 고 씻어 미리 데워 공영-/-의 2 개 mL를 한번 우물.</li>
		<li>발음 PBS-/-와 린스 각 세 번 잘 6 잘 플레이트의 당 EDTA의 1 mL.</li>
		<li>부드럽게 접시를 기울기 고 EDTA를 발음. 중간 셀 리프팅 피하기 위해 어떤 식으로든에서 접시를 선동 하지 마십시오.</li>
		<li>3 세척 후 EDTA의 1 mL을 추가 하 고 3-5 분에 대 한 후드에 실 온에서 품 어. 이 잠복기 동안 접시를 방해 하지 마십시오.</li>
		<li>는 EDTA를 발음 하 고 여분의 매체의 0.5 mL와 함께 시드 것입니다 잘 당 RDM의 1 mL를 추가 합니다. 예를 들어 12-잘 접시의 4 우물에 접시를 RDM의 4.5 mL 6 잘 플레이트의 1 세척.</li>
		<li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 부드럽게 세포를 분리. 원뿔 튜브에 있는 모든 셀을 수집 하 고 5 번 위아래로 pipetting으로 RDM 셀 triturate. 셀의 큰 덩어리를 분리 하지만 단일 세포 현 탁 액을 triturate 하지 마십시오. 셀에 피펫으로에 균등 하 게 배포 합니다. 접시에 뚝을 방지 하기 위해 신속 하 게이 단계를 완료.</li>
		<li>ECM 코팅 12-잘 접시 (잘 당 세포 현 탁 액 1 mL)에 셀 씨.</li>
		<li>우물에 걸쳐 균등 하 게 셀을 앞뒤로 접시 기울기. 부드럽게 장소에서 37 ° C, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 다음 중간 변경까지.</li>
		<li>참고 정확한 시간. 매일 같은 시간에 변경 중간.</li>
	</ol></li></ol> 3. 하루 1 ~ 14: 추가의 성장 요인 <ol><li>1 일: 모든 우물 (우물 당 1 mL)에 매체 변경 RDM을 사용 하 여 0 (단계 2.4 참조)에 대 한 성장 인자 성분과.</li>
	<li>주 2: 10 mm NIC RDM (우물 당 1 mL), 5 ng/mL FGF-기본, 10 ng/mL 머리, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가 NIC, FGF-기본 5 µ L, 머리의 1 µ L, DKK1의 1 µ L 및 i g f 1의 1 µ L의 100 µ L RDM의 10 mL.</li>
	<li>주 4: 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1 RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가할 activin A, DKK1의 1 µ L 및 IGF-1의 1 µ L의 10 µ L RDM의 10 mL. 
	참고:이 단계에서 세포는 confluent 관찰.</li>
	<li>주 6: 5402 100 ng/mL activin A와 10 µ M 수 RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 activin A의 10 µ L 및 10 µ L의 수 5402 ~ 10 mL RDM 추가.</li>
	<li>일 8, 10, 12: 3 µ M와 100 ng/mL activin A, 10 µ M 수 5402, RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경 CHIR99021. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가할 activin A, 10 µ L의 수 5402, 및 CHIR99021의 3 µ L의 10 µ L RDM의 10 mL.</li>
</ol> 4. RPE의 통로 0에 농축 하루 <ol><li>코트 6 잘 플레이트 성장 인자와 제조 업체의 권장 사항에 따라 ECMH를 감소. 또는 하룻밤 4 실 온에서 1 h에 대 한 설정 하려면 허용 ° c.</li>
	<li>약 수 필요한 DPBS의 볼륨과 RDM의 농축 및 37 물 욕조에 따뜻한 음 당 1 mL ° C. 가져와 37의 실내 온도 따뜻한 필요한 볼륨 RSM, 항균 약, 및 Y-27632의 TDE ° c.</li>
	<li>추가 항균 성 시 약 그리고 Y-27632 0.5 x 및 RSM 각각 10 µ M 작곡. 첫 번째 4-7 일 동안이 매체를 사용 하 여 첨부 파일을 개선.</li>
	<li>Aspirate 지출된 매체에서 우물 및 미리 따뜻하게 RDM (성장 인자 필요)의 당 1 mL을 추가.</li>
	<li>해 현미경을 사용 하 여 수동으로 해 부와 P10 피펫으로 팁을 사용 하 여 모든 비 RPE 세포 떨어져 다쳤어요. 
	참고: 예의 대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오.</li>
	<li>RDM 발음 해 부, 후와 모든 파편 세포. 잘 당 미리 따뜻하게 DPBS의 1 mL로 두 번 세척.</li>
	<li>12-잘 접시의 당 TDE의 0.5 mL을 추가 하 고 5 분 부드럽게 접시에서 셀을 제거 하려면 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 37 ° C에서 품 어. P1000 피펫으로 부드럽게 셀/TDE 정지를 3-4 회를 위아래로 pipetting으로 triturate를 사용 하 여 균일 한 현 탁 액을 만듭니다.</li>
	<li>셀/TDE 정지 Y-27632 없이 미리 따뜻하게 RSM에 1시 10분 희석. 실 온에서 5 분 동안 173 x g에 세포 현 탁 액을 원심.</li>
	<li>발음 셀 펠 릿에서 매체와 10 µ M와 RSM에 셀 resuspend Y-27632 (1 mL 당 잘 농축).</li>
	<li>변형 40 µ m 모와 나일론 메쉬 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀. hemocytometer를 사용 하 여 지정 된 볼륨에 있는 셀의 수를 계산 하 고 긴장 된 솔루션에 있는 세포의 농도 계산.</li>
	<li>씨 셀 성장 인자 감소 ECM 코팅 플레이트 1 x 10 5 셀/cm 2 10 µ M와 RSM의 4 mL Y-27632.</li>
	<li>10 µ M는 RSM 바꿉니다 Y-27632 셀 시드 후 48 h 대체 미디어 (예: 월요일과 목요일에) 매 3-4 일을 계속. 10 µ M를 교체 하지 마십시오 4-7 일 후 Y-27632.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO 2 28 ~ 35 일 동안 성숙 하기 위하여 셀 수 있습니다. 대체는 RSM 매 3-4 일 (예: 월요일과 목요일에) 계속.</li>
</ol> 5. 성숙: 통로 1과 2의 RPE 참고: 괄호로 표시 된 볼륨의 6 잘 플레이트 또는 T75 플라스 크 1에 대 한 표시 됩니다.
<ol><li>통로 0의 28 ~ 35 일 사이 코트 제조 업체의 권장 사항에 따라 ECMH와 6 잘 플레이트 (T75 플라스 크).</li>
	<li>약 수 DPBS 볼륨 RSM 필요 하 고 37 물 욕조에 따뜻한 실내 온도에 ° C.가지고 TDE.</li>
	<li>Aspirate 우물에서 매체와 세척 잘 두 번와 함께 보낸 미리 따뜻하게 DPBS의 2ml (10 mL). 
	참고: 10 µ M를 사용 하지 마십시오 Y-27632.</li>
	<li>발음 DPBS TDE의 1 mL (5 mL)을 추가 하 고. 5 분 동안 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 넣습니다. 부 화, 후 보기 세포 세포를 확인 하는 거꾸로 한 현미경에 계약 하 분리.</li>
	<li>부드럽게 잘 또는 플라스 크의 밑면에서 셀을 제거는 적절 한 크기의 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여.</li>
	<li>P1000 팁 (10 mL 혈 청 학적인 피펫으로)를 사용 하 여 부드럽게 triturate 셀/TDE 정지 아래로 3-4 회를 균일 한 현 탁 액을 만듭니다.</li>
	<li>는 RSM에 셀 서 스 펜 션 1시 10분 희석. 린스 잘/플라스 크 희석된 세포 현 탁 액에 추가 하는 RSM의 2 mL (5 mL)을 예약. 
	참고: 초과 25 분 효소 노출 시간을 허용 하지 않습니다</li>
	<li>173 x g 실 온에서 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심.</li>
	<li>셀 펠 릿에서 매체를 발음 하 고 RSM의 1 mL (5 mL)에 셀 resuspend</li>
	<li>변형 40 µ m 모와 나일론 메쉬 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀. hemocytometer를 사용 하 여 지정 된 볼륨에 있는 셀의 수를 계산 하 고 긴장 된 솔루션에 있는 세포의 농도 계산.</li>
	<li>1 x 10 5 셀/cm 2 4 mL (15 mL) RSM의 ECMH 코팅 접시에 셀 씨.</li>
	<li>30 일 동안 성숙 하기 위하여 셀 수 있습니다. 변화는 RSM 3-4 일 마다 계속.</li>
	<li>하루 30 구절 구절 1 ~ 2에서에서 셀에 위의 절차 (단계 5.2-5.11)을 반복.</li>
</ol> 6. 중간 셀 은행 만들기:의 Cryopreservation 통로 2 일 3-5 RPE 참고: subconfluent (50%) 이며, 안료를 회복 하지는 하는 동안 셀 Cryopreserve.
<ol><li>Cryopreservation 매체의 볼륨 10% DMSO 3 x 10 6 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend 하는 데 필요한 계산 셀의 수에 따라,.</li>
	<li>수행 단계 5.2 5.8입니다. 3 x 10 6 셀/mL에 10 %DMSO cryopreservation 매체에 셀 펠 릿 resuspend 고 1.2 mL 극저온 튜브에 세포 현 탁 액 1 mL.</li>
	<li>-1 ° C/min에서 멋진 하룻밤-80 ° C에서 배치 하는 설계 된 냉동 컨테이너에 극저온 튜브를 배치 합니다. 장기 저장을 위한 액체 질소에 전송. 
	참고: 이러한 셀 녹고 시 통로 3 될 것입니다. 셀을 특성화 하기 전에 30 일에 대 한 문화. 씨앗 통로 3 RPE 1.5 x 10에서 5 cm 2 녹고 시 당. 2 , 4 , 6 , 7</li></ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Making+Stem+Cells+Retinal%3A+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell-Based+Therapies+in+Combination+with+Substrate+for+the+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).</li>
<li>Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4020-8502-4_1">Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).</li>
<li>Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canonical%2F%CE%B2-catenin+Wnt+pathway+activation+improves+retinal+pigmented+epithelium+derivation+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+xeno-free+derivation+of+retinal+pigmented+epithelial+cells+on+a+novel%2C+synthetic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate.</a> Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).</li>
<li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium%3A+A+Comparative+Study+Between+Cell+Lines+and+Differentiation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).</li>
<li>Choudhary, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+Toward+Retinal+Pigment+Epithelium+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-directed%2C+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li>
<li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+efficient+retinal+pigment+epithelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), New York, N.Y. 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+spontaneous+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).</li>
<li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li>
<li>Croze, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibition+Extends+Passage+of+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).</li>
</ol>

박사 Clegg 재생 패치 기술 LLC의 공동 설립자 이다.

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드는 피더, 혈 청 없는 문화 메서드에서 두 인간의 배아 및 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 최적화 되었다. 1998 년에 인간 배아 줄기 세포의 초기 절연 하 고 2007 년에 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 파생, 이후 다양 한 줄기 세포 배양 방법 되었습니다14,,1516, 개발 17. 이러한 메서드는이 차별화에 취약 줄기 세포 식민지 생산 충분 해야 한다. 제대로 파생 하 고 유지 pluripotent 줄기 세포를이 방법의 적용에 알려진된 제한이 있다.
가장 중요 한 단계는 차별화 (2.5 단계)의 0에 줄기 세포와 수동의 해 부 하루 14 (4.5 단계) 과정에 대 한 잠재적인 필요성의 뿌리고. 줄기 세포 식민지에서 차별화 된 세포를 제거 하 때, 켄트18에서 이미지를 참조 하십시오. 같이, 식민지와 식민지 내의 불투명 셀 사이 fibroblastic 셀18이 프로토콜 시작 하기 전에 제거 해야 하는 차별화 된 셀을 나타냅니다. 정의 된 가장자리와만 undifferentiated, 단단히 포장 식민지 차별 화를 위한 passaged 해야 합니다.
잘 (단계 2.6.7) 당 시드 줄기 세포 수가 줄기 세포 통과 따라 단일 셀 서 스 펜 션에 triturated 수 없습니다 고 수 없습니다 정확 하 게 계산 된 hemocytometer를 사용 하 여 사실에 의해 복잡 합니다. 80 %confluent 줄기 세포의 근사는 12-잘 접시의 4 우물에 뿌리고 1 6 잘 플레이트의 잘 표시 됩니다. 성장 율 등 줄기 세포 라인의 차이점 미숙한 RPE 일 0 ~ 4 사이의 합류를 도달 하는 얼마나 빨리 발생할 수 있습니다. 줄기 세포는 정확한 합류에 RPE를 생산할 예정 이다 하지만 셀 수확량 부정적인 영향을 세포가이 단계에서 너무 부족 하는 경우. 미 숙 RPE 세포 하루 4 주 1에 거의 100% 합칠 약 40-50% 합칠 이어야 한다. 셀 4 또는 6 일까 confluent 단층을 생산 하지는 경우 0에서 프로토콜 높은 시드 밀도에서 반복 한다. 예를 들어 6 잘 플레이트의 1은 0에서 12-잘 접시의 4 우물에 passaged 미 숙 RPE의 하루 4에서 100% 합칠을 하지 않는 경우 0에 1:3 또는 1:2 통로에 시드 줄이거나 더 confluent 될 줄기 세포 허용 전에 뿌리고. 여러 셀 라인 비교 일관 된 시드 밀도 설정 하는 것이 중요 하다.
하루 14에 수동 절 개 단계가입니다 비 RPE 세포는 문화 (그림 2C)에 존재 하는 경우에 필요. 프로토콜에 CHIR99021의 추가, 이후 많은 pluripotent 줄기 세포 라인에 작은 수동 절 개가 필요합니다. 일부 준비 신경 패치의 높은 발병 률을가지고 그리고 그 세포를 제거 하는 것이 중요. RPE 0 통과 통로 3에서 가능한 경우, 모든 비 RPE 세포를 제거 하는 충분 한 시간을가지고 차별화 프로토콜 반복 가능 하다. 이 자주 발생 하지 않습니다 하지만 그것은 필요할 때 하루에 14에 있는 해 부 단계를 최적화할 수 있습니다 참고로 여기 언급.
비용 뿐 아니라 문화 방법, 효율, 정량화에서 변화 하는 RPE 분화 프로토콜의 다양 한 고 기능성 평가, 후자는 되었습니다 검토 철저 하 게2. 우리는 14 일 방법의 효능, 적응성, 및 셀 라인4,,78의 넓은 범위에 적용 여기서 설명 선호 합니다. 이 프로토콜에서 cryopreservation 단계는 또한 나중에 사용, 실험에 많은 많은 변화를 피하는 중간 셀 은행을 만드는 주요 이점을 제공 합니다. 12-잘 접시의만 4 우물에서 시작 해 서, 그것이 통로 0에서 6-잘 접시와 통로 1과 2에 T75 플라스 크로 확장 가능 합니다. 통로 2 일 3-5에 셀 여전히 subconfluent 그리고 안료, 회복 하지는 가능 하다 cryopreserve 세포의 수백만의 수만 하 고 성숙한 RPE, 지정 통로 3 일간 30을 해 동 하, RNA 식, 단백질 표정, 성장 인자를 확인 하기 분 비, 식 균 작용, 등등입니다. 우리는 또한 최대 13 구절 19RPE 확장 프로토콜을 설립 했다.
앞으로 봐서,이 방법은 iPSC 눈 질병의 모델링 및 생성 RPE 세포 치료에 대 한 유용 있을 것입니다. IPSC 질병 모델링에 관해서는이 프로토콜 RPE CRISPR 수정 같은 환자에서 수정 되지 않은 컨트롤 라인에서 생산 하는 실험실에서 사용 현재 됩니다. 또한,이 프로토콜은 합성 기판 및 세포 치료에 필요한 좋은 제조 관행을 준수 하는 데 유용 이종 무료 조건에 적응할 수 있습니다.

망막 색소 상피 대뇌에 대 한 중요 한 지원을 제공 하는 색소 세포의 단층 이다. 망막 색소 상피 세포 (RPE) 비전, 빛을 흡수, 영양소와 이온 수송, retinoid 사이클링, 포토 리셉터 외부 세그먼트 먹어서에 있는 수많은 기능 그리고 성장 인자 분 비1. 망막 dystrophies RPE 및 비전, 연령 관련 황 반 변성, 망막 화 등의 손실에 결과의 기능에 영향을 주는 다양 한이 있다. RPE의 만능 줄기 세포에서 생성 수 있습니다 이러한 눈 질병을 이해 하는 연구 하며 셀 요법2RPE의 무제한 소스를 제공할 수 있습니다. 사실, 여러 임상 시험 진행 RPE pluripotent 줄기 세포3에서 파생 된 사용 하는.
이 분화 프로토콜 Buchholz4 에 의해 원래 기술 되었다 고 Clegg5에서 이전에 게시 방법에 근거 했다. 절차 정상적인 vivo에서 발달 과정 조작 인슐린 성장 인자 (IGF), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF-2; 통해 RPE 운명 향해 undifferentiated pluripotent 줄기 세포를 직접 모방 FGF-basic), 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 및 WNT 통로4,5. 프로토콜은 크게 나왔고 97.77% ± 0.1% pre melanosome 단백질 (PMEL) 긍정적인 세포, 그리고 이종 무료 조건6,7에 적응 되어 프로토콜에 늦게 WNT 통로 주 작동 근의 추가 의해 향상 됩니다. 결과 RPE 사본 및 단백질 수준 적절 한 극성으로 알려진된 RPE 성장 인자를 분 비 하는 포토 리셉터 외부 세그먼트8먹어서 수행 RPE 마커를 표현 하기 위해 표시 되었습니다. 이 프로토콜은 더 신속 하 고 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자8의 간단한 제거를 포함 하는 차별화의 "자발적인" 프로토콜 보다 안정적입니다. 또한, RNA 시퀀싱 데이터 표시 RPE이이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 그 얻은 일반적인 자발적인 방법8을 사용 하 여 매우 유사 하다. 14 일 메서드 Mazzoni9 (안료, 편광, phagocytic, 포스트 mitotic, 다각형)9에 의해 언급 "5 P의" 맞는 RPE 생성 합니다. 이 절차는 여러 실험실에서 재현할 것을 입증 했다, 그러나 최근 몇 년 동안10,,1112 에 게시 된 몇 가지 추가 감독된 차별화 방법을 인정 하 길 , 13.

<table><tbody><tr><td>SterilGARD III 층류 생물 안전 캐비닛</td><td>베이커</td><td>모델 : SG603A-HE, 유형 : A2, 클래스 : 2</td><td>6 '베이커 층류 생물 안전 캐비닛</td></tr><tr><td>해부 후드</td><td>Labconco</td><td>모델 3970405</td><td>층류 벤치 탑</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td>가열 스테이지</td></tr><tr><td>에어 재킷 CO2 인큐베이터</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td>37 oC 및 5 % CO2</td></tr><tr><td>도립 위상차 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Growth Factors and Reagents </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 노긴</td><td>R& D 시스템</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 DKK-1</td><td>R & D 체계</td><td>5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>재조합형 IGF-1</td><td>R& ; D 시스템</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간/마우스/쥐 Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 FGF 억제제</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-204308</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>댓글</td></tr><tr><td>Substrates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>growth factor reduced ECMH</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>기타 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (칼슘 없음, 마그네슘 없음)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (트립신 유사 해리) 효소, TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (RPE 지지 배지)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102</td><td>cryopreservation medium</td></tr><tr><td>1.2 mL Cryogenic Vial</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (냉동 용기)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>냉동 용기</td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td>항균 시약</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>기타 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>12웰 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td>차별화 과정에서 사용됩니다.</td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>RPE 성숙 과정에서 사용됩니다.</td></tr><tr><td>6웰 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>CLS3513</td><td>RPE 성숙 중에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>통로 중에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>세포 여과</td>기 <td>Falcon</td><td>352340</td><td>세포 계수 전 통로 중에 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

만능 줄기 세포의 감 별 법으로 망막 안료 상피 세포 (RPE)를 직접 하는 강력한 방법을 설명 합니다. 제공 하는 상세 하 고 철저 한 프로토콜의 목적은 각 단계를 명확 하 게 설명 하 고이 분야에서 연구원에 게 쉽게 사용할 수 있도록. 이 프로토콜 필요 최소한의 또는 더 수동 해 부와 RPE의 동종 계층에서 발생 합니다. 여기에 제시 된 방법을 위해 효과적 이기 위하여 보였다 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 인간 배아 줄기 세포. 또한, 우리 cryopreservation 중간 셀 은행의 장기 저장을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 RPE iPSC 접시에 질병 모델링 또는 임상 응용 프로그램에 유용할 수 있습니다.

이 메서드는 RPE의 균질, 안료, 및 cuboidal 단층의 생산에 결과. 그림 1 에 타임 라인 이미지 그림2에 해당 합니다. 그림 2A같이 줄기 세포 식민지 식민지 또는 식민지 내의 불투명 셀 사이 fibroblastic 셀 정의 된 가장자리와 밀접 하 게 포장 된다. 그림 2B 에 subconfluent는 미숙한 RPE의 표현을 제공 합니다. 만약 셀 이미 confluent이 단계에서 그들은 차별화 과정에 중요 한 계획을 확장할 수 없습니다. 심각 하 게 subconfluent 셀 수 설정 하는 단층 고 단단한 접속점, 상피의 형성 됩니다. 이 합류를 최적화 하는 방법에 대 한 내용은 토론 섹션에 설명 되어 있습니다. 그림 2C 표시 비-RPE이 분화 과정 중 발생할 수 있는 두 가지 가장 일반적인 유형의 형태: 신경 또는 fibroblastic 패치. 그것은 정의 fibroblastic 같은 패치는 거의 해 현미경에 반투명 반면 이러한 신경 패치 해 현미경에 특히 불투명 표시 해야 합니다. 그것은 더 쉽게 합성 가벼운 현미경과 해 현미경에 그들을 식별 하는 에탄올 증거 실험실 펜 조직 문화 접시에 이러한 영역을 표시 하려면 유용할 수 있습니다. 그림 2D-F 특성 밝은 테두리, 조약돌 형태학 및 RPE의 건강 하 고 성숙한 문화를 나타내는 착 색을 표시 합니다. 그림 3 은 단계 대조와 밝은 분야 현미경 검사 법에 의해 묘사 하는 완전히 성숙한 RPE의 다른 모습을 보여 더 높은 확대 이미지입니다. 통로 3 일간 30, 세포는 RNA, 단백질 표정, 성장 인자 분 비, 표현과 먹어서2,4,6 등 이전 출판물에서 설명 된 특성에 대 한 ,7. 이러한 characterizations 이러한 이미지에 표시 하는 셀은 뿐만 아니라 안료 cuboidal, 하지만 또한 phagocytic, 포스트 mitotic 그리고 편광 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
그림 1:. 성장 요인의 추가 및 RPE의 성숙에 대 한 타임 라인. 성장 인자는 하루 0-14에서에서 12-잘 접시에 추가 됩니다. RPE 성숙은 6 잘 플레이트 또는 30 일 후 재개 (통로 3 일간 30)에 농축의 날부터 T75 플라스 크에서 경작 된 화살표는 효소 셀 뿌리고 나타냅니다. (A-E) 아래 그림 2에 이미지에 해당 하는 타임 라인. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
그림 2: 대표적인 형태 및 RPE 성숙의 합류. 유도 만능 줄기 세포 감 별 법 (A)에 뿌리고 직전. 하루 2 (B)에서 일 14;에 선택 제거 농축 전에 미 숙 RPE 세포 subconfluent 비 RPE 패치 (흰색 화살표 표시) 패치 또는 불투명 "리본" (C)으로 표시 됩니다. RPE 통로 0, 1 및 3 일 30에에 (D, E 및 F). 눈금 막대 = 200 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
그림 3: RPE 통로 3에 성숙: 하루 30 Cuboidal 형태학 단계 대조 (A)에 묘사 된 고 밝은 필드 (B)에 묘사 된 착 색. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

이 방법의 전반적인 목표는 다능성 줄기세포가 균질한 층의 망막 색소 상피 세포로 효과적으로 분화하도록 유도하는 것입니다. 본 방법은 망막이 어떻게 발달하는지, 그리고 줄기세포 질환 모델을 어떻게 구축하는지와 같은 망막 및 안구 연구 분야의 질문들에 답하는 데 도움을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 자연 발생적 방법보다 더 빠르고 효율적이라는 점입니다.이 방법은 성장 인자와 저분자 화합물을 조합하여 줄기세포를 14일 만에 미성숙 RPE로, 3개월 후에는 성숙한 기능성 RPE로 분화시키는 방법입니다. UC Santa Barbara의 줄기세포 생물학 및 공학 연구실 부소장인 Cassidy Arnold가 절차의 일부를 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 계대 배양 전까지 공급세포가 없고 혈청이 없는 조건에서 줄기세포 콜로니를 약 80% 밀도로 배양하십시오.그런 다음 제조사의 권장 사항에 따라 12-well 플레이트에 세포외 기질 기반 하이드로젤을 코팅하고, 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 굳힙니다. 그 후 0일 차에 필요한 망막 분화 배지와 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS를 정량하여 워터배스에서 37°C로 가온합니다. 다음으로 가온된 RDM에 성장 인자를 첨가하고 EDTA를 실온으로 맞춥니다.필요한 경우, 분화용으로 계대 배양할 줄기세포에서 형태학적 특징을 바탕으로 분화된 콜로니를 P10 피펫 팁을 사용하여 모두 제거하십시오. 콜로니 사이의 섬유아세포 형태의 세포와 콜로니 내부의 불투명한 세포들은 제거해야 할 분화된 세포임을 나타냅니다. 세포를 수동으로 제거하는 것은 본 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나인데, 완전히 분화되지 않은 줄기세포 집단으로 시작해야 더욱 효율적인 농축이 가능하기 때문입니다.줄기세포의 배지를 흡입하고 2 mL의 예열된 PBS로 웰을 한 번 세척하여, 6-웰 플레이트의 단일 웰을 12-웰 플레이트의 4개 웰로 계대 배양합니다. 그 후 PBS를 흡입하고 웰당 1 mL의 EDTA로 각 웰을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 플레이트를 조심스럽게 기울여 EDTA를 흡입합니다.세포가 조기에 떨어지는 것을 방지하기 위해 플레이트를 어떤 방식으로든 흔들지 마십시오. 세 번째 세척 후, EDTA 1 mL를 다시 첨가하고 후드 내 실온에서 3~5분 동안 플레이트를 배양합니다. 이 배양 과정 동안 플레이트를 건드리지 마십시오.그 다음, EDTA를 흡입하여 제거하고, 세포를 분주할 웰 수에 맞춰 웰당 1 mL의 RDM과 추가 배지 0.5 mL를 첨가합니다. 예를 들어, 12-웰 플레이트의 4개 웰에 분주하기 위해 6-웰 플레이트의 웰 하나를 4.5 mL의 RDM으로 세척합니다. 그런 다음, 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 떼어냅니다.웰 내에서 피펫팅을 다섯 번 반복하여 RDM 내의 세포를 분쇄하며, 플레이트에 다시 부착되는 것을 방지하기 위해 이 단계를 신속하게 완료하십시오. 원추형 튜브에 옮깁니다. 큰 세포 덩어리를 분리하되, 단일 세포 현탁액이 될 때까지 분쇄하지는 마십시오.세포를 피펫에 고르게 분배하고, 플레이트에 다시 부착되는 것을 방지하기 위해 이 단계를 신속하게 완료하십시오. 필요한 경우, 광학 현미경을 사용하여 세포 덩어리의 크기를 관찰하십시오. 그 후, ECM이 코팅된 12-well 플레이트에 세포를 파종하십시오.플레이트를 앞뒤로 기울여 세포가 웰 전체에 고르게 분포되도록 한 뒤, 다음 배지 교체 시점까지 37 °C, 5% CO2 조건의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 이 과정에서 6-웰 플레이트를 제조사 권장 사항에 따라 성장 인자가 감소된 ECM으로 코팅합니다. 이를 실온에서 1시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 굳힙니다.그 다음, 농축 웰당 필요한 양의 DPBS와 1 mL의 RDM을 분주하여 항온수조에서 37 °C로 가온합니다. 트립신 유사 효소를 실온으로 가져오고, 필요한 양의 RPE 지지 배지를 37 °C로 가온합니다. 그 후, RSM에 항미생물 시약과 ROCK 억제제를 첨가하여 최종 농도가 0.5x 항미생물 시약 및 10 µM ROCK 억제제가 되도록 합니다.부착력을 높이기 위해 처음 4~7일 동안 이 배지를 사용하십시오. 그 다음, 모든 웰에서 사용한 배지를 흡입하여 제거하고, 성장 인자가 포함되지 않은 미리 데워진 RDM을 웰당 1 mL씩 첨가하십시오. 필요한 경우, 실체 현미경 하에서 P10 피펫 팁을 사용하여 RPE 세포가 아닌 모든 세포를 분리하여 긁어내십시오.박리 후, RDM과 모든 세포 잔해를 흡입하여 제거하고, 웰당 1 mL의 예열된 DPBS로 2회 세척합니다. 이어서 12-웰 플레이트의 각 웰에 0.5 mL의 TDE를 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 그 후, 세포 스크래퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 부드럽게 떼어냅니다.세포 효소 현탁액을 피펫으로 3~4회 상하로 가볍게 혼합하여 균일한 현탁액을 만듭니다. 다음으로, ROCK 억제제가 포함되지 않은 예열된 RSM에 세포 효소 현탁액을 1:10 비율로 희석합니다. 세포 현탁액을 실온에서 173g로 5분 동안 원심분리합니다.5분 후, 세포 펠릿에서 배지를 흡입하여 제거하고 10 µM ROCK 억제제가 포함된 RSM에 세포를 재부유시킵니다. 그다음, 40 µm 공극의 나일론 메쉬 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 걸러줍니다. 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하고, 여과된 용액 내의 세포 농도를 계산합니다.그 후, 10 µM ROCK inhibitor가 포함된 4 mL의 RSM을 사용하여 세포를 성장 인자가 감소된 ECM 코팅 플레이트에 1 × 10⁵ cells/cm² 밀도로 분주합니다. 세포 분주 48시간 후에 10 µM ROCK inhibitor가 포함된 RSM으로 교체하고, 3~4일마다 배지를 계속 교체합니다. 4~7일 후에 RSM에 ROCK inhibitor 첨가를 중단합니다.세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 28~35일 동안 성숙시키고, 3~4일마다 RSM을 지속적으로 교체합니다. 여기에 표시된 것은 분화를 위해 계대 배양하기 직전의 유도만능줄기세포입니다. 줄기세포는 크기가 작고 콜로니 내에 조밀하게 밀집되어 있으며, 콜로니 사이나 내부에서 섬유아세포와 같은 분화된 세포 또는 불투명한 구획이 관찰되지 않습니다.다음은 2일 차의 미성숙 RPE 세포입니다. 이 단계의 세포들은 여전히 subconfluent 상태여야 하며, 세포 사이의 빈 공간으로 돌기를 뻗고 있어야 합니다. 이 세포들은 14일 차에 농축물을 제거하기 위해 picking 작업을 수행하기 전의 상태입니다.RPE가 아닌 세포들은 패치 형태나 불투명한 리본 모양으로 나타납니다. 둥근 패치는 섬유아세포 모양의 세포들을 포함하고 있으며, 불투명한 패치는 신경 망막으로 생각됩니다. 이 이미지들은 30일 차의 계대 배양 0대, 1대 및 3대의 RPE를 보여줍니다.매 계대배양 시, 세포는 합쳐져야(confluent) 하며, 위상차 현미경 상의 밝은 경계와 다각형 모양을 포함한 망막 색소 상피(retinal pigmented epithelial) 형태의 특징을 나타내야 합니다. 숙련되면 계대배양 및 농축 기술은 세포 배양 규모에 따라 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 유전자 또는 단백질 정량화 및 기능 분석과 같은 기술을 사용하여 성장 인자를 분비하거나 외절을 식세포 작용으로 제거하는 RPE의 능력에 관한 질문에 답할 수 있습니다.2013년 Dave Buchholz와 2015년 Lindsay Leach가 발표한 논문들에 이 방법의 개발 및 최적화 과정이 상세히 기술되어 있습니다. 본 영상에서는 해당 분야의 연구자들이 쉽게 활용할 수 있도록 절차의 각 단계에 대해 상세하고 철저한 시연을 제공합니다. 유익한 실험이 되시길 바랍니다.

rapid-directed-differentiation-retinal-pigment-epithelial-cells-from

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하​​였다.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

본 프로토콜은 높은 반복성과 효율성으로 망막 오가노이드의 접착 및 융합을 감소시키는 최적화된 3D 신경 망막 유도 시스템을 설명합니다.

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

배우세요 인간 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 성장 인자와 소분자를 이용해 망막 안료 상피 세포로의 신속하고 효율적인 감독 차별화 방법을. 이 프로토콜은 14일 만에 미성숙 RPE를 생성하고 세 달 후 성숙한 기능성 세포를 얻어 망막 질환 연구에 활용됩니다.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

더 많은 동영상 탐색