건설 및 무 균 완화에 CoCrMo 입자에 노출에 의해 Calvarial Osteolysis Murine 모델의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 코발트-크롬-몰리브덴 나노 입자에 노출하여 쥐 칼바리아 골용해 모델을 구성하고 평가하는 것입니다. 마모 입자에 의한 골용해는 관절 치환술 실패에서 무균 이완의 주요 원인이지만 이것의 기본 역학은 명확하지 않습니다. 추적 관찰 시간이 길고 산발적으로 발생하기 때문에 임상 사례에서 무균 이완의 파토제네시스를 조사하는 것은 어렵습니다.

따라서 추가 연구를 위해 착용 동물 모델이 필요합니다. 우리 연구실에서는 코발트 합금 입자로 구성된 벽화 칼바리 골용해 모델은 무균 풀림의 parthogenesis를 연구하는 데 효과적인 모델입니다. 이것은 먼저 코발트 합금 보철물에서 나노 스케일 코발트 크롬 몰리브덴 입자를 생성하고 밀리리터당 15밀리그램의 농도로 인산염 완충 식염수에 다시 현탁시켜 수행됩니다.

다음 단계는 각각 두 눈과 귀 사이의 두 중간 지점 사이의 선에서 절개 위치를 확인하는 것입니다. 그런 다음 충격 해부로 칼바륨에서 두개골 골막을 제거합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 코발트 합금 나노 입자 스톡을 취하여 칼바리아의 중간 봉합사에 삽입합니다.

2주간의 유지 관리 후 일부 마우스를 희생하고 골용해 평가를 위해 칼바리아를 수집합니다. 골용해는 코발트 합금 나노입자 처리된 마우스에서 명백하며, 마이크로 CT와 H 및 E 염색 이미지 모두에서 나타납니다. 코발트 합금 보철물에서 코발트 크롬 몰리브덴 합금을 얻고, 제작된 고진공 3전극 직류에 의해 코발트 크롬 몰리브덴 합금에서 코발트 크롬 몰리브덴 입자를 얻습니다.

코발트 크롬 몰리브덴 입자의 평균 직경을 정량화하려면 1mg의 입자를 1.5 밀리리터의 무수 에탄올에 넣고 초음파 진탕으로 현탁시킵니다. 투과 전자 현미경의 대물렌즈 테이블에 약 20마이크로리터의 현탁액을 한 방울 떨어뜨리고 일련의 이미지를 획득합니다. 제공된 소프트웨어를 사용하여 TEM 이미지의 평균 직경과 입자 크기 분포를 계산합니다.

다음은 왼쪽 패널의 대표적인 TEM 이미지이며, 오른쪽 패널은 상용 소프트웨어로 계산 한 코발트 크롬 몰리브덴 합금의 나노 입자 크기 분포를 보여줍니다. 평균 직경은 약 50나노미터입니다. 입자를 15분 동안 오토클레이브하여 내독소를 제거합니다.

그런 다음 인산염 완충 식염수에 15 밀리리터 당 15 밀리그램의 농도로 원액으로 다시 현탁시킵니다. 다음은 calvarial osteolysis model의 구축입니다. 6 주 된 마우스를 선택하고 마취하십시오 : 그룹 당 6 마리의 마우스.

동물을 주요 위치에 놓습니다. 털을 제거하고 75% 에탄올로 두개골 피부를 소독합니다. 절개의 경우 두 눈과 귀 사이의 두 중간점을 각각 식별하고 이들을 연결하는 선을 따라 피부를 절개합니다.

충격 박리를 통해 칼바리움에서 두개골 골막을 조심스럽게 완전히 제거합니다. 골막의 명확한 해부는 calvaria의 입자 간의 상호 작용을 강화합니다. 봉합사는 절개 부위의 양쪽 끝에서 간단한 단속 봉합사로 조심스럽게 수행됩니다.

일반적으로 완전한 봉합을 위해서는 세 바늘을 꿰매야 합니다. 마지막 단계에서는 봉합선의 양쪽 끝을 잡고 매듭을 짓지 않고 절개 부위를 통해 봉합선을 통과시킵니다. 15 마이크로 리터의 코발트 합금 원액 나노 입자를 가져 와서 칼바리아의 중간 봉합사에 삽입하십시오.

마지막 스티치를 간단한 중단 봉합사로 매듭지습니다. 생쥐를 2주 더 유지하십시오. 2주 후, 그 동물을 제물로 바치고 칼바리아를 수확한다.

핀셋으로 칼바리아 샘플의 모든 연조직을 부드럽게 닦아내고 섭씨 4도에서 4% 파라포름알데히드로 조직을 부착합니다. 코발트 크롬 몰리브덴 나노입자 유도 모델에서 골용해 평가를 위해 마이크로 CT 스캔 24시간 전에 고해상도 마이크로 CT를 수행합니다. 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로부터 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline)로 칼바리아 시료를 이송합니다.

마이크로 CT 스캔 당일에는 인산염 완충 식염수에서 칼바리아 검체를 채취하여 기기와 연결된 홀더에 고정합니다. 마이크로 CT 기기에서 칼바리아를 스캔합니다. 다양한 소프트웨어로 3차원 재구성을 수행합니다.

H 및 E 염색은 나노 입자 유도 모델에서 골용해 평가를 위한 또 다른 도구입니다. 섭씨 4도에서 3주 동안 15%의 에힐렌디아민테트라아세트산을 함유한 인산염 완충 식염수에서 칼바리아 샘플을 석회화합니다. 석회질 처리된 칼바리아를 파라핀에 삽입하고 입자 증착 영역에서 두 개의 마이크로미터 섹션으로 자릅니다.

헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 단면을 염색합니다. 형태와 광학 현미경을 통해 전체 통과를 관찰하고 현미경 사진을 획득합니다. 대표적인 마이크로 CT 영상입니다.

마이크로 CT 데이터의 3차원 재구성 이미지가 왼쪽 패널에 표시됩니다. 대조군, 가짜 작동 및 나노 입자 처리된 마우스의 단면 이미지가 오른쪽 패널에 표시되어 있습니다. 골용해는 나노입자 처리군에서 명백합니다.

다음은 기기 관련 소프트웨어에 의한 마이크로 CT 사진의 정량적 분석입니다. 측정에는 뼈 미네랄 밀도, 뼈 부피 또는 총 부피 비율, 총 다공성 비율, 섬유주 수, 섬유주 두께, 섬유주 분리 또는 간격이 포함됩니다. 코발트 합금 나노 입자로 처리된 마우스는 대조 동물에 비해 뼈 밀도와 뼈 부피가 현저히 낮으며 총 다공성 비율이 더 높습니다.

다음은 대조군, 가짜 작업 및 나노 입자 처리된 마우스의 칼바리아 샘플에 대한 대표적인 H 및 E 염색 이미지입니다. 골용해는 나노입자 치료군에서도 뚜렷하게 나타납니다. 코발트 합금 나노 입자로 구성된 쥐 calvarial osteolysis 모델은 마모 입자 유도 골 분해 모델링에서 높은 성공률을 보입니다.

다음은 몇 가지 핵심 요소입니다. 첫째, 코발트 합금 나노 입자는 마모 입자와 칼바리아 사이의 상호 작용을 향상시킵니다. 둘째, 칼바리아에 대한 적절한 노출과 골막의 명확한 해부는 입자와 칼바리아 사이의 상호 작용을 더욱 집중적으로 만듭니다.

셋째, 마이크로 CT에 의한 골 손실의 정량적 측정은 다양한 치료법 간의 뼈 손실의 차이에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하여 기존의 뼈 조직 형성법과 비교하여 골용해에 대한 확실한 증거를 제공합니다. 코발트 합금 입자로 구성된 마모 칼바리아 골분해 모델은 무균 풀림에서 마모 입자와 다른 세포 간의 상호 작용을 조사하는 데 이상적인 모델입니다. 예를 들어 microphage, fibroblasts, osteoclasts 및 osteoblasts와 같은.

우리는 우리의 모델이 향후 무균 이완에 대한 연구에 도움이 되기를 바랍니다.