건설 및 무 균 완화에 CoCrMo 입자에 노출에 의해 Calvarial Osteolysis Murine 모델의 평가

이 프로시저의 전반적인 목표는 코발트-크롬-몰리브덴 나노입자에 노출시켜 마우스 두개골 골용해 모델을 구축하고 평가하는 것입니다. 마모 입자로 유발된 골용해는 인공관절 치환술 실패 시 무균성 이완의 주요 원인이 되지만, 이에 대한 기저 메커니즘은 명확하지 않습니다. 긴 추적 관찰 시간과 드문 발생 빈도로 인해, 임상 사례에서 무균성 이완의 병태생리를 탐구하는 것은 어렵습니다.

따라서 추가 연구를 위해 마모 동물 모델이 필요합니다. 본 연구실에서는 코발트 합금 입자로 구축한 생쥐 두개골 골흡수 모델을 무균성 이완의 병인론을 연구하는 효율적인 모델로 사용하고 있습니다. 이는 먼저 코발트 합금 보철물로부터 나노 크기의 코발트 크롬 몰리브덴 입자를 생성한 후, 이를 15 mg/mL 농도의 phosphate buffer saline에 재현탁시켜 수행합니다.

다음 단계는 양쪽 눈 사이의 중간 지점과 양쪽 귀 사이의 중간 지점을 잇는 선상에서 절개 위치를 확인하는 것입니다. 그 다음, 충격 박리를 통해 두개골에서 두개골막을 제거합니다. 이어서 50 µL의 코발트 합금 나노입자 스톡을 취해 두개골의 정중봉합선에 매립합니다.

2주간의 유지 기간 후, 일부 마우스를 희생시키고 골용해 평가를 위해 두개골(calvaria)을 수집합니다. 코발트 합금 나노입자로 처리된 마우스에서는 micro-CT 및 H and E 염색 이미지 모두에서 골용해가 뚜렷하게 나타납니다. 코발트 합금 인공관절에서 코발트 크롬 몰리브덴 합금을 얻고, 제작된 고진공 3전극 직류 장치를 통해 코발트 크롬 몰리브덴 합금으로부터 코발트 크롬 몰리브덴 입자를 얻습니다.

코발트 크롬 몰리브덴 입자의 평균 직경을 정량화하기 위해, 1 mg의 입자를 1.5 mL의 무수 에탄올에 넣고 초음파 분쇄기로 현탁시킵니다. 이 현탁액 약 20 µL 한 방울을 투과 전자 현미경의 시료대에 도포하고 일련의 이미지를 획득합니다. 제공된 소프트웨어를 사용하여 TEM 이미지에서 평균 직경과 입자 크기 분포를 계산합니다.

왼쪽 패널은 대표적인 TEM 이미지이며, 오른쪽 패널은 상용 소프트웨어를 통해 계산한 코발트-크롬-몰리브덴 합금 나노입자 크기의 분포를 보여줍니다. 평균 직경은 약 50 nanometers입니다. 내독소를 제거하기 위해 입자를 15분 동안 오토클레이브하십시오.

그 다음, 이를 인산염 완충 식염수(PBS)에 15 mg/mL 농도로 재현탁하여 스톡 용액으로 준비합니다. 다음은 두개골 골흡수 모델의 구축 단계입니다. 6주령의 마우스를 그룹당 6마리씩 선택하여 마취합니다.

동물을 기본 위치에 배치합니다. 털을 제거하고 두개골의 피부를 75% ethanol로 소독합니다. 절개를 위해 양 눈 사이의 중간 지점과 양 귀 사이의 중간 지점을 각각 확인하고, 이 두 지점을 연결하는 선을 따라 피부를 절개합니다.

충격 박리법(shock dissection)을 이용하여 두개골의 골막을 조심스럽게 완전히 제거합니다. 골막을 깨끗하게 박리하면 두개골 내 입자 간의 상호작용이 강화됩니다. 절개 부위의 양 끝은 단순 단속 봉합법(simple interrupted suture)으로 조심스럽게 봉합합니다.

일반적으로 완전한 봉합을 위해서는 세 번의 바느질이 필요합니다. 마지막 단계에서는 봉합사의 양 끝을 잡은 상태에서 매듭을 짓지 않고 절개창을 통해 봉합선을 통과시킵니다. 15 µL의 코발트 합금 표준 용액 나노입자를 취하여 두개골의 중앙 봉합 부위에 매립합니다.

단순 결절 봉합의 마지막 스티치를 묶습니다. 생쥐를 2주 더 유지합니다. 2주 후, 동물을 희생시키고 두개골(calvaria)을 채취합니다.

핀셋을 사용하여 두개골 샘플의 모든 연조직을 조심스럽게 제거하고, 조직을 4% 파라포름알데히드에 넣어 4°C에서 고정합니다. 코발트 크롬 몰리브덴 나노입자 유도 모델의 골용해 평가를 위해, micro-CT 스캔 24시간 전에 고해상도 micro-CT를 수행합니다. 파라포름알데히드에서 두개골 샘플을 인산염 완충 식염수로 옮깁니다.

micro-CT 스캔 당일에 인산완충식염수에서 두개골 표본을 수집하여 장치에 연결된 홀더에 고정합니다. micro-CT 장치로 두개골을 스캔합니다. 다양한 소프트웨어를 사용하여 3차원 재구성을 수행합니다.

H and E 염색은 나노입자 유도 모델에서 골용해를 평가하는 또 다른 도구입니다. 15%의 ehylenediaminetetraacetic이 포함된 인산염 완충 식염수에서 4 °C로 3주 동안 두개골 샘플을 탈회시킵니다. 탈회된 두개골을 파라핀에 매립하고 입자가 침착된 부위를 2 µm 두께로 절편합니다.

절편을 hematoxylin 및 eosin으로 염색합니다. 광학 현미경을 통해 전반적인 형태 변화를 관찰하고 마이크로그래프를 획득합니다. 다음은 대표적인 micro-CT 이미지입니다.

왼쪽 패널에 micro-CT 데이터의 3차원 재구성 이미지가 나와 있습니다. 오른쪽 패널에는 대조군, 가짜 수술군 및 나노입자 처리 쥐의 단면 이미지가 나와 있습니다. 나노입자 처리군에서 골용해(osteolysis)가 뚜렷하게 나타납니다.

다음은 기기 관련 소프트웨어를 이용한 micro-CT 사진의 정량적 분석 결과입니다. 측정 항목에는 골밀도, 골 부피 또는 총 부피 비율, 총 공극률 백분율, 골소주 수, 골소주 두께 및 골소주 분리 또는 간격이 포함됩니다. 코발트 합금 나노입자를 처리한 생쥐는 대조군 동물에 비해 골밀도와 골 부피가 유의하게 낮고 총 공극률 백분율은 더 높게 나타납니다.

대조군, 가짜 수술군 및 나노입자 처리군 마우스의 두개골 샘플에 대한 대표적인 H and E 염색 이미지입니다. 나노입자 처리군에서도 골용해가 뚜렷하게 나타납니다. 코발트 합금 나노입자로 구축된 마우스 두개골 골용해 모델은 마모 입자로 유도된 골용해 모델링에서 높은 성공률을 보입니다.

다음은 몇 가지 주요 요인들입니다. 첫째, 코발트 합금 나노입자는 마모 입자와 두개골 사이의 상호작용을 강화합니다. 둘째, 두개골을 충분히 노출시키고 골막을 명확하게 박리함으로써 입자와 두개골 사이의 상호작용을 더욱 심화시킬 수 있습니다.

셋째, micro-CT를 이용한 골 손실의 정량적 측정은 다양한 처리군 간의 골 손실 차이를 더 쉽게 파악할 수 있게 하며, 기존의 골 조직 형태 분석법과 비교하여 골용해에 대한 확실한 근거를 제공합니다. 코발트 합금 입자로 구축된 마모 두개골 골용해 모델은 무균성 해이 과정에서 마모 입자와 대식세포, 섬유아세포, 파골세포 및 조골세포와 같은 다양한 세포들 사이의 상호작용을 조사하는 데 이상적인 모델입니다.

우리의 모델이 향후 무균성 이완 연구에 도움이 되기를 바랍니다.