Name: 건설 및 무 균 완화에 CoCrMo 입자에 노출에 의해 Calvarial Osteolysis Murine 모델의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 학습하세요 CoCrMo 나노입자에 노출된 생쥐 두개골 골용해 모델 구축 및 평가 방법을. 이 모델은 인공관절 무균완화의 병태생리 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (81572111), 과학 및 기술 프로젝트 재단의 장쑤 성 (BL2012002), 과학 연구 난징 프로젝트 (201402007), 자연 과학에 의해 지원 되었다 장쑤 성 (BK20161385)의 기초 그리고 중국 의사 협회 (2015COS0810)의 특별 한 기초.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 난징 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. CoCrMo 입자 준비
<ol><li>조작된 높은 진공 3 전극 직류4를 사용 하 여 CoCrMo 입자를 얻을. 10-3 Pa 진공, 0.04 MPa 아르곤 및 수소 3:2 (v/v), 악기에서 장소 CoCrMo 합금 그리고 현재 650 A 음극 선.</li>
	<li>CoCrMo 입자의 직경을 측정 합니다.<ol>
<li>무수 에탄올의 1.5 mL에 CoCrMo 입자의 1 밀리 그램을 추가 합니다.</li>
		<li>무수 에탄올에 초음파 진동 28 kHz, 600 W 5 분에 의해 CoCrMo 입자를 resuspend.</li>
		<li>전송 전자 현미경 (TEM)의 객관적인 테이블에 결과 현 탁 액의 한 방울 (약 20 µ L)를 적용 합니다. 200 kV 가속 전압 및 0.24 nm 해상도에 가장 사진 시리즈를 캡처하십시오.</li>
		<li>TEM 현미경 사진에서 평균 직경 및 입자 크기 분포를 계산 하기 위해 제공 된 소프트웨어를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오염을 부유<ol>
<li>고압 121 ° C와 15 psi에서 15 분 동안 입자의 50 g.</li>
		<li>Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 양적으로 독 검색 (< 0.25 %EU / mL 내 부재를 나타내기 위해 여겨졌다)5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재고 솔루션650 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 입자를 resuspend.</li>
</ol>2입니다. Calvarial Osteolysis 모델의 건설
<ol><li>6 주 된 C57BL/J6 쥐 (그룹 당 6 쥐) withpentobarbital (50 mg/kg) anesthetize 핀치 테스트를 사용 하 여 마 취의 수준을 평가 하기 위해. 일반적인 염 분으로 눈의 건조를 방지 합니다.</li>
	<li>경향이 위치에서 마우스를 놓습니다. 두개골에 모피는 면도기로 제거 하 고 75%의 에탄올을 포함 하는 의료 면봉을 사용 하 여 피부를 소독.</li>
	<li>포인트 지역화, 각각 두 눈과 귀 사이의 중간점을 포함 하 여 2 포인트를 식별 합니다. 다음, 포인트, 위의 두 사이의 라인을 확인 하 고가 위 (그림 1A)와 위의 라인을 따라 피부를 incise.</li>
	<li>메스 (그림 1B)6calvaria에서 두개골과 제거 합니다.</li>
	<li>간단한 중단된 봉합으로 양쪽 끝에 봉합 피부.</li>
	<li>노팅 없이 절 개의 중간을 통해 봉합 라인을 확인 합니다. 봉합 선의 두 끝을 잡으십시오.</li>
	<li>Calvarias (그림 1C)2의 한가운데에 CoCrMo 입자 현 탁 액 (PBS에 50 mg/mL)의 50 µ L를 포함 합니다.</li>
	<li>간단한 중단된 봉합 (그림 1D) 내 마지막 스티치 매듭</li>
	<li>또 다른 2 주 동안 마우스를 유지.</li>
</ol>3. 마이크로-CT 스캔 하 여 Calvarial Osteolysis 모델의 평가
<ol><li>이산화탄소와 쥐를 희생. 수평 평면에 쥐 목을 벨. 뇌 조직 내부, 그리고 피부를 제거 하 고 밖에 서 모피. 추가 실험을 위한 calvarias을 수확.</li>
	<li>부드럽게 핀셋으로는 calvaria에 모든 연 조직 정리. 마이크로-CT 검사 전에 PBS 24 h calvarias 24 h. 담가 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 지운된 calvarias을 수정.</li>
	<li>마우스 calvarias 18 µ m의 아이소메트릭 해상도 및 45의 x 선 에너지 설정에서 고해상도 마이크로-CT 분석 kV 및 550 mA.</li>
	<li>소프트웨어와 마이크로-CT 데이터의 3 차원 재구성을 수행 합니다.</li>
	<li>정성 및 정량 분석입니다.<ol>
<li>먼저, 관심의 영역으로 중간 봉합 사 주위의 사각형 영역을 선택 합니다.</li>
		<li>둘째, 뼈 미네랄 밀도 (BMD)를 측정, 볼륨/총 뼈 볼륨 (BV/TV), 배수 수 (Tb.N), 배수 두께 (Tb.Th), 배수 분리/간격 (Tb.Sp), 그리고 마이크로-코네티컷에 대 한 제공 된 소프트웨어와 함께 총 다공성의 비율</li>
		<li>셋째, 일방통행 ANOVA에 의해 다양 한 측정을 위한 3 개 그룹을 비교할 수 있습니다. 포스트 hoc 분산 분석 적용 Bonferroni 방법2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Calvarial Osteolysis 모델 H & E 염색 법의 평가
<ol><li>15% 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA) calvaria 샘플을 알려줍니다-4 ° c.에서 PBS 3 주 동안 매일 decalcification 솔루션을 변경 합니다.</li>
	<li>2 cm x 1 cm x 1 cm 큐브, 파라핀에 석된 샘플을 포함 하 고 입자 증 착의 영역에서 2 µ m 섹션으로 그들을 슬라이스.</li>
	<li>되며 섹션 얼룩 하 고 오신 앞7에서 설명한.</li>
	<li>가벼운 현미경 검사 법에 의해 전체 pathomorphism의 현미경을 캡처하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+targeting+TNF-alpha+can+suppress+Co-Cr-Mo+particle-induced+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis.</a> J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT1+protects+osteoblasts+against+particle-induced+inflammatory+responses+and+apoptosis+in+aseptic+prosthesis+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening.</a> Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).</li>
<li>Langlois, J., Hamadouche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+of+wear-particle+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">New animal models of wear-particle osteolysis.</a> Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).</li>
<li>Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287666498_Preparation_of_ultrafine_silver_powders_by_DC_arc_plasma">Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method.</a> Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fibroblast+expression+of+RANKL+in+CoCrMo-particle-induced+osteolysis+is+mediated+by+ER+stress+and+XBP1s%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s.</a> Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediated+CoCrMo+particle-induced+peri-implant+osteolysis+by+promoting+osteoblast+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis.</a> Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-induced+osteolysis+mediated+by+endoplasmic+reticulum+stress+in+prosthesis+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening.</a> Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).</li>
<li>Yang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+osteoprotegerin+gene+transfer+protects+against+particulate+polyethylene-induced+osteolysis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model.</a> Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediated+TiAl%286%29V%284%29+particle-induced+peri-implant+osteolysis+by+promoting+expression+of+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha.</a> Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+Stress+Mediates+TiAl6V4+Particle-Induced+Peri-Implant+Osteolysis+by+Promoting+RANKL+Expression+in+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiAl6V4+particles+promote+osteoclast+formation+via+autophagy-mediated+downregulation+of+interferon-beta+in+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes.</a> Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycorine+suppresses+RANKL-induced+osteoclastogenesis+in+vitro+and+prevents+ovariectomy-induced+osteoporosis+and+titanium+particle-induced+osteolysis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo.</a> Sci Rep. 5, 12853(2015).</li>
<li>Neuerburg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcitonin+receptor+signalling+in+polyethylene+particle-induced+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis.</a> Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).</li>
<li>Catelas, I., Jacobs, J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20415362">Biologic activity of wear particles.</a> Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+response+to+nanometre-sized+polymer+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The biological response to nanometre-sized polymer particles.</a> Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

마모 입자 유도 osteolysis 쥐에 대 한 두 가지 주요 방법이 있다: 공기 주머니 모델과 calvarial osteolysis 모델. 공기 주머니 모델에서 피하 생성 된 공기 주머니는 처음 설립, 마모 입자 소개 및 이식 뼈 조직8에 이어서. 주머니 벽 무 균 완화에 모방합니다. 그러나, 뼈 이식이 이다 nonvascular 생물 학적 활동 없이, 입자와 뼈 조직 간의 직접적인 상호 작용을 평가 하기 어렵습니다. Calvarial osteolysis 모델 공기 주머니 대응 이상의 몇 가지 이점이 있다. 첫째, 마모 입자는 직접 노출 calvaria, 마모 입자 간의 상호 작용을 평가 하 고 항상성, 뼈 재흡수, 그리고 osteoblast, osteoclast 및 대 식 세포 활동9,10 포함 하 여 뼈를 가능 하 게 하 . 둘째, 뼈 손실의 양적 측정 뼈 손실 예방<sup c...

가장 일반적인 원인은 이다 무 균을 풀면 총 엉덩이 관절 (THA) 교체 및 총 무릎 관절 (TKA) 교체 실패의 개정 수술1필요. 그러나, 기본 메커니즘 불분명2남아 있습니다. 긴 후속 입자 유도 osteolysis, 그 발생은 드문; 검색 하는 데 필요한 따라서, 그것은 임상의 경우에서 자사의 pathogenesis 탐험 도전 이다. 따라서, 복잡 한 세포와 조직 메커니즘에 초점을 맞추고 더 연구에 실험 비보에 모두 착용 입자 유도 osteolysis 모델 및 분석 실험 체 외에 세포 항상성3뼈에 관련 된 필요 합니다. 유효한 동물 모델 더 세포질 분석 실험에 대 한 증거를 제공 하는 뼈 손실에 마모 입자의 효과 드러내는에서 중요 하다.
CoCrMo 입자에 노출에 의해 건설 murine calvarial osteolysis 모델 입자와 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 효과적이 고 유효한 방법입니다. 이 모델에서 CoCrMo 입자 발생할 calvarial osteolysis 유도 하는 대 식 세포에서 염증 성 cytokines, osteoclasts 활성화, osteoblast 확산 억제 및 osteoblast apoptosis를 홍보.
그것은이 모델을 설정 하려면 2 주 걸립니다. Osteolysis 수 수 시각 hematoxylin와 오신 (H & E) 얼룩 계량 및 마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT)2. 또한,이 모델은 상대적으로 저렴 한 비용, 그리고 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 모델 다양 한 복용량3화합물의 많은 화면을 사용할 수 있습니다.
설정 하 고이 모델을 평가 절차는 간단 합니다. 첫째, CoCrMo 입자 높은 진공 3 전극 직류 여 되었고 50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 resuspended. 다음, 후 분리 하 여 두개골과 날카로운 해 부 결과 서 스 펜 션의 50 µ L murine calvaria의 중간에 적용 되었습니다. 쥐 2 주 후, 희생 했다 및 calvaria 샘플 수확 했다; 질적 및 양적 분석 H & E andmicro-코네티컷 얼룩에 의해 수행 되었다
CoCrMo 입자에 노출에 의해 건설 murine calvarial osteolysis 모델 CoCrMo 입자와 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts, osteoclasts에 무 균 완화 등 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>보철물의 CoCrMo 합금</td><td>Waldemar Link GmbH & Co</td><td>GEMINI MK II</td><td>CoCrMo 나노 입자를 얻기 위한 원료</td></tr><tr><td>날조된 고진공 3전극 직류</td><td>재료 과학 대학 및 공학, 난징 공과</td><td></td> 대학 <td>자체 설계 기계</td></tr><tr><td>6 주 된 남성 C57BL / 6J 마우스</td><td>모델 난징 대학의 동물 연구 센터</td><td>N000013</td><td></td></tr><tr><td>100 % 에탄올</td><td>난징 시약</td><td>C0691514023</td><td>투과 전자 현미경 스캐닝 용 CoCrMo 나노 입자 용매</td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD</td><td>W603</td><td></td></tr><tr><td>미세 분석 저울</td><td>심천 Qun 긴 악기 장비 CO,. LTD</td><td>EX125DZH</td><td></td></tr><tr><td>초음파 쉐이커</td><td>상하이 Yuhao 과학 기기 co., LTD</td><td>YH-200DH</td><td>CoCrMo 나노 입자</td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>FEI</td><td>Tecnai G20</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI 소프트웨어</td><td>Compix Inc.를</td> 중단합니다.<td>6.6 버전</td><td>: 평균 직경 및 입자 크기 분포를 계산합니다.</td></tr><tr><td>고용량 살균 팬</td><td>QIULONGYIQI</td><td>KYQL-100DS</td><td>오염 제거 엔도톡신</td></tr><tr><td>Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 분석</td><td>Charles River</td><td>R13025</td><td>엔도톡신을 감지하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>Taizhou Suyi Medical</td><td>B122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Boster Biological Technology</td><td>AR0030</td><td>CoCrMo 나노 입자 원액</td></tr><tr><td>용매 Pentobarbital 나트륨</td><td>시그마</td><td>P3761</td><td>마우스 마취</td></tr><tr><td>일반 식염수</td><td>SACKLER</td><td>SR8572EP-15</td><td>마우스 눈의 건조를 방지하기 위해</td></tr><tr><td>75 % 에탄올</td><td>난징 시약</td><td>C0691560275</td><td>소독</td></tr><tr><td>의료 면봉</td><td>Shuitao</td><td>1278298933</td><td>소독</td></tr><tr><td>면도기</td><td>Kemei</td><td>KM-3018</td><td>모피 면</td></tr>도 <tr>가<td>위</td><td>RWD 생명 과학</td><td>S12005-10</td><td>피부</td></tr><tr><td>봉합</td>사 <td>RWD 생명 과학</td><td>F34001-01</td><td>피부 봉합</td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F33001-01</td><td>피부 봉합</td></tr><tr><td>바늘</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>R14003-12</td><td>피부</td></tr><tr><td>봉합 혈관 집게</td><td>RWD 생명 과학</td><td>F22003-09</td><td>피부 봉합</td></tr><tr><td>메스</td><td>RWD 생명 과학</td><td>S31010-01</td><td>calvaria</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>RWD 생명 과학</td><td>F12006-10</td><td>calvaria</td></tr><tr><td>100 &micro를 봉합하려면; L 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000240</td> calvatias 100 &micro<td>에 입자 현탁액을 삽입하려면</td></tr><tr><td>; L 피펫 팁</td><td>AXYGEN</td><td>T-200-Y</td><td>칼바티아스 5 ml 마이크로튜브에 입자 현탁액을 삽입하려면</td></tr><tr><td></td><td>Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD</td><td>W621</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>고정</td></tr><tr><td>마이크로 컴퓨터 단층 촬영&nbsp;</td><td>SkyScan</td><td>SkyScan1176</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라아세트산</td><td>서비스bio</td><td>G1105</td><td>석회질</td></tr><tr><td>제거 파라핀</td><td>서비스bio</td><td>#0001</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 슬라이싱 머신</td><td>라이카</td><td>RM2125RTS</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>서비스bio</td><td>G6004</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>서비스bio</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>HE 염색 키트</td><td>Servicebio</td><td>#1-5</td><td>HE 염색</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>니콘</td><td>E200</td><td></td></tr></tbody></table>

건설 및 무 균 완화에 cocrmo 입자에 노출에 의해 calvarial osteolysis murine 모델의 평가

Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening

마모 입자 유도 osteolysis 관절 교체 실패, 무 균 완화의 주요 원인 이지만 기본 메커니즘 불분명 남아. 검색 및 산발적 발생에 필요한 긴 후속 인 그것 병 인 ofparticle 유도 osteolysis 임상의 경우에서 평가 하기 위해 도전적 이다. 따라서, 최적의 동물 모델은 추가 연구 필요. CoCrMo 입자에 노출에 의해 설립 calvarial osteolysis murine 모델은 입자와 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 효과적이 고 유효한 도구. 이 모델에서 CoCrMo 입자 처음 높은 진공 3 전극 직류 여 되었고 50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 분에 resuspended. 다음, 후 분리 하 여 두개골과 날카로운 해 부 결과 서 스 펜 션의 50 µ L murine calvaria의 중간에 적용 되었습니다. 2 주 후, 생쥐 희생 했다, 및 calvaria 표본 수확 했다; 질적 및 양적 평가 되며 고 오신 얼룩 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 수행 되었습니다. 이 모델의 장점 절차 단순, 뼈 손실의 양적 평가, osteolysis 개발, 잠재적인 사용 유전자 변형 또는 녹아웃 모델, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용의 속도 포함 한다. 그러나,이 모델은 기계적인 힘 및 입자 무 균 완화의 만성 효과 평가 하는 데 사용할 수 없습니다. Calvarial osteolysis murine 모델 CoCrMo 입자에 노출에 의해 생성 된 마모 입자 및 다양 한 셀, 예를 들면, 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts 및 osteoclasts, 무 균 완화에 사이 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 도구입니다.

사내 생산된 nanoscale CoCrMo 입자 했다 약 50 nm (3.56의 표준 오차) 직경, 가장 (그림 2)에 의해 정량으로. 마우스 calvarias의 CoCrMo 입자, 동물에 노출 된 후 (n = 그룹 당 6) 또 다른 2 주 동안 유지 되었다. 2 주 이내에 calvarial 절 개는 완전 하 게 치유 하 고 봉합 떨어질 수 있습니다. 모든 로컬 감염 또는 뼈 손실 평가 영향을 없앤 5 월. 마우스 희생 후 calvaria 샘플 수확 했다. 그리고, 모든 부드러운 조직을 부드럽게 정돈 했다 마이크로 CT 뼈 손실을 측정 하는 데 사용 되었다. 3 차원 재구성 이미지와 횡단면에 대표적인 코로나 사진에서 중요 한 뼈 손실은 CoCrMo 입자 (그림 3)으로 치료 하는 쥐에서 관찰 되었다. 뼈 미네랄 밀도 (BMD), 뼈 볼륨/총 볼륨 (BV/TV), 배...

이 원고는 마모 입자 및 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 동물 모델을 구성 하는 CoCrMo 입자에 노출에 의해 calvarial osteolysis murine 모델을 설명 합니다.

건설 및 무 균 완화에 CoCrMo 입자에 노출에 의해 Calvarial Osteolysis Murine 모델의 평가

Wear particle-induced osteolysis is a major cause of aseptic loosening in arthroplasty failure, but the underlying mechanism remains unclear. Due to long ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 코발트-크롬-몰리브덴 나노입자에 노출시켜 마우스 두개골 골용해 모델을 구축하고 평가하는 것입니다. 마모 입자로 유발된 골용해는 인공관절 치환술 실패 시 무균성 이완의 주요 원인이 되지만, 이에 대한 기저 메커니즘은 명확하지 않습니다. 긴 추적 관찰 시간과 드문 발생 빈도로 인해, 임상 사례에서 무균성 이완의 병태생리를 탐구하는 것은 어렵습니다.따라서 추가 연구를 위해 마모 동물 모델이 필요합니다. 본 연구실에서는 코발트 합금 입자로 구축한 생쥐 두개골 골흡수 모델을 무균성 이완의 병인론을 연구하는 효율적인 모델로 사용하고 있습니다. 이는 먼저 코발트 합금 보철물로부터 나노 크기의 코발트 크롬 몰리브덴 입자를 생성한 후, 이를 15 mg/mL 농도의 phosphate buffer saline에 재현탁시켜 수행합니다.다음 단계는 양쪽 눈 사이의 중간 지점과 양쪽 귀 사이의 중간 지점을 잇는 선상에서 절개 위치를 확인하는 것입니다. 그 다음, 충격 박리를 통해 두개골에서 두개골막을 제거합니다. 이어서 50 µL의 코발트 합금 나노입자 스톡을 취해 두개골의 정중봉합선에 매립합니다.2주간의 유지 기간 후, 일부 마우스를 희생시키고 골용해 평가를 위해 두개골(calvaria)을 수집합니다. 코발트 합금 나노입자로 처리된 마우스에서는 micro-CT 및 H and E 염색 이미지 모두에서 골용해가 뚜렷하게 나타납니다. 코발트 합금 인공관절에서 코발트 크롬 몰리브덴 합금을 얻고, 제작된 고진공 3전극 직류 장치를 통해 코발트 크롬 몰리브덴 합금으로부터 코발트 크롬 몰리브덴 입자를 얻습니다.코발트 크롬 몰리브덴 입자의 평균 직경을 정량화하기 위해, 1 mg의 입자를 1.5 mL의 무수 에탄올에 넣고 초음파 분쇄기로 현탁시킵니다. 이 현탁액 약 20 µL 한 방울을 투과 전자 현미경의 시료대에 도포하고 일련의 이미지를 획득합니다. 제공된 소프트웨어를 사용하여 TEM 이미지에서 평균 직경과 입자 크기 분포를 계산합니다.왼쪽 패널은 대표적인 TEM 이미지이며, 오른쪽 패널은 상용 소프트웨어를 통해 계산한 코발트-크롬-몰리브덴 합금 나노입자 크기의 분포를 보여줍니다. 평균 직경은 약 50 nanometers입니다. 내독소를 제거하기 위해 입자를 15분 동안 오토클레이브하십시오.그 다음, 이를 인산염 완충 식염수(PBS)에 15 mg/mL 농도로 재현탁하여 스톡 용액으로 준비합니다. 다음은 두개골 골흡수 모델의 구축 단계입니다. 6주령의 마우스를 그룹당 6마리씩 선택하여 마취합니다.동물을 기본 위치에 배치합니다. 털을 제거하고 두개골의 피부를 75% ethanol로 소독합니다. 절개를 위해 양 눈 사이의 중간 지점과 양 귀 사이의 중간 지점을 각각 확인하고, 이 두 지점을 연결하는 선을 따라 피부를 절개합니다.충격 박리법(shock dissection)을 이용하여 두개골의 골막을 조심스럽게 완전히 제거합니다. 골막을 깨끗하게 박리하면 두개골 내 입자 간의 상호작용이 강화됩니다. 절개 부위의 양 끝은 단순 단속 봉합법(simple interrupted suture)으로 조심스럽게 봉합합니다.일반적으로 완전한 봉합을 위해서는 세 번의 바느질이 필요합니다. 마지막 단계에서는 봉합사의 양 끝을 잡은 상태에서 매듭을 짓지 않고 절개창을 통해 봉합선을 통과시킵니다. 15 µL의 코발트 합금 표준 용액 나노입자를 취하여 두개골의 중앙 봉합 부위에 매립합니다.단순 결절 봉합의 마지막 스티치를 묶습니다. 생쥐를 2주 더 유지합니다. 2주 후, 동물을 희생시키고 두개골(calvaria)을 채취합니다.핀셋을 사용하여 두개골 샘플의 모든 연조직을 조심스럽게 제거하고, 조직을 4% 파라포름알데히드에 넣어 4°C에서 고정합니다. 코발트 크롬 몰리브덴 나노입자 유도 모델의 골용해 평가를 위해, micro-CT 스캔 24시간 전에 고해상도 micro-CT를 수행합니다. 파라포름알데히드에서 두개골 샘플을 인산염 완충 식염수로 옮깁니다.micro-CT 스캔 당일에 인산완충식염수에서 두개골 표본을 수집하여 장치에 연결된 홀더에 고정합니다. micro-CT 장치로 두개골을 스캔합니다. 다양한 소프트웨어를 사용하여 3차원 재구성을 수행합니다.H and E 염색은 나노입자 유도 모델에서 골용해를 평가하는 또 다른 도구입니다. 15%의 ehylenediaminetetraacetic이 포함된 인산염 완충 식염수에서 4 °C로 3주 동안 두개골 샘플을 탈회시킵니다. 탈회된 두개골을 파라핀에 매립하고 입자가 침착된 부위를 2 µm 두께로 절편합니다.절편을 hematoxylin 및 eosin으로 염색합니다. 광학 현미경을 통해 전반적인 형태 변화를 관찰하고 마이크로그래프를 획득합니다. 다음은 대표적인 micro-CT 이미지입니다.왼쪽 패널에 micro-CT 데이터의 3차원 재구성 이미지가 나와 있습니다. 오른쪽 패널에는 대조군, 가짜 수술군 및 나노입자 처리 쥐의 단면 이미지가 나와 있습니다. 나노입자 처리군에서 골용해(osteolysis)가 뚜렷하게 나타납니다.다음은 기기 관련 소프트웨어를 이용한 micro-CT 사진의 정량적 분석 결과입니다. 측정 항목에는 골밀도, 골 부피 또는 총 부피 비율, 총 공극률 백분율, 골소주 수, 골소주 두께 및 골소주 분리 또는 간격이 포함됩니다. 코발트 합금 나노입자를 처리한 생쥐는 대조군 동물에 비해 골밀도와 골 부피가 유의하게 낮고 총 공극률 백분율은 더 높게 나타납니다.대조군, 가짜 수술군 및 나노입자 처리군 마우스의 두개골 샘플에 대한 대표적인 H and E 염색 이미지입니다. 나노입자 처리군에서도 골용해가 뚜렷하게 나타납니다. 코발트 합금 나노입자로 구축된 마우스 두개골 골용해 모델은 마모 입자로 유도된 골용해 모델링에서 높은 성공률을 보입니다.다음은 몇 가지 주요 요인들입니다. 첫째, 코발트 합금 나노입자는 마모 입자와 두개골 사이의 상호작용을 강화합니다. 둘째, 두개골을 충분히 노출시키고 골막을 명확하게 박리함으로써 입자와 두개골 사이의 상호작용을 더욱 심화시킬 수 있습니다.셋째, micro-CT를 이용한 골 손실의 정량적 측정은 다양한 처리군 간의 골 손실 차이를 더 쉽게 파악할 수 있게 하며, 기존의 골 조직 형태 분석법과 비교하여 골용해에 대한 확실한 근거를 제공합니다. 코발트 합금 입자로 구축된 마모 두개골 골용해 모델은 무균성 해이 과정에서 마모 입자와 대식세포, 섬유아세포, 파골세포 및 조골세포와 같은 다양한 세포들 사이의 상호작용을 조사하는 데 이상적인 모델입니다.우리의 모델이 향후 무균성 이완 연구에 도움이 되기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

마우스 모델은 뼈 조직 공학에 매우 유용한 도구이지만, 긴 뼈 결함 모델은 드뭅니다. 이러한 필요성은 4개의 나사가 있는 잠금 플레이트와 전용 지그를 사용하여 이환율이 낮고 재현 가능한 대퇴골 임계 크기 결함을 수행하고 안정화하는 현재 프로토콜의 개발에 동기를 부여했습니다.

마우스의 분절 대퇴 임계 크기 결함 모델의 설립은 플레이트 고정술에 의해 안정화

지방 유래 기질 세포는 환자 자신의 세포에서 새로운 조직을 엔지니어링하는 데 유용할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 인간 지방 유래 기질 세포(ASC)의 하위 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시한 다음 in vivo calvarial healing assay에서 세포를 적용합니다.

BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

뼈 이식의 ex vivo 문화 뼈 생리학 및 뼈 리모델링 및 뼈 질환에서 약물의 잠재적인 평가의 연구에 대 한 귀중 한 도구가 될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 신생아 마우스 두개골에서 분리 된 calvarias의 준비 및 문화뿐만 아니라 그 응용 프로그램을 설명합니다.

Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

여기에서 우리는 뼈 재생 능력의 관점에서 뼈 치환 물질을 평가하는 것을 목표로 토끼에 있는 외과 프로토콜을 제시합니다. 토끼 두개골에 고정된 PEEK 실린더를 사용하여, 골전도, 골연, 골형성 및 물질에 의해 유도된 혈관발생은 살아있는 동물 또는 안락사된 동물상에서 평가될 수 있다.

뼈 치환 재료의 뼈 성장 및 혈관 혈관 의 평가를 위한 토끼에 있는 뼈 증강의 Calvarial 모형

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

여기에서 우리는 Wistar 흰둥이 쥐의 대퇴골 축을 의원 발생 적으로 파괴하고 굳은 살의 발달에 대한 후속 조치를 취하는 프로토콜을 제시합니다. 이 대퇴골 절골술 모델은 연구자들이 골절 치유 과정을 평가하고 약물이 골절 치유에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Wistar 알비노 쥐에서 대퇴골 절골술 모델을 개발하기 위한 프로토콜

이 프로토콜은 마우스에서 하악 제1대구치를 추출하는 방법에 대한 단계별 세부 사항을 보여줍니다. 턱뼈 치유 및 재생에 중점을 둔 연구자들에게 대안적인 방법을 제공합니다.

쥐 하악 어금니 추출 소켓 치유 모델 구축

여기에서는 쥐의 대퇴골 이형성증 조직에서 box-cavity 결손을 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 모델은 생체역학적 스트레스 하에서 생체재료 성능을 평가하고 막내 골형성과 관련된 뼈 재생 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

Rat Fetora의 피질 뼈에서 Box-Cavity Defect 모델 생성

쥐 골수 손상 모델은 막내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 단순화된 수술 프로토콜은 새로운 뼈 형성 및 손상 후 세포 반응의 다운스트림 평가를 위한 골수 절제 절차를 설명합니다.

쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

학습하세요 CoCrMo 나노입자에 노출된 생쥐 두개골 골용해 모델 구축 및 평가 방법을. 이 모델은 인공관절 무균완화의 병태생리 메커니즘 연구에 활용됩니다.

건설 및 무 균 완화에 CoCrMo 입자에 노출에 의해 Calvarial Osteolysis Murine 모델의 평가

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