Name: 장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 장기 이식에서 맞춤형 항원 배열을 이용한 HLA 동종항체 검출 방법을. 이 기술은 개별 기증자의 HLA 서열을 반영한 개인화된 항원 세트를 활용하여 면역 반응을 정확히 분석하고 이식 거부 반응의 핵심 표위를 식별하는 데 활용됩니다.

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우리 박사 숀 리를 감사 하 고 자리와 그들의 친절 한 도움에 대 한 캐나다의 웨스턴 대학교의 싱 리 생산 배열. 우리는 샘플 서비스를 제공 하기 위한 조직 적합성 코어와 포괄적인 이식 센터의 노스웨스턴 대학 직원에 감사. 이 작품 보조 보드 노스웨스턴 메모리얼 병원, 그리고 노스웨스턴 대학에서 제공 하는 제이를 교수 시작 기금에 의해 부분적으로 지원 되었습니다.

여기 설명 된 모든 방법을 노스웨스턴 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다 (IRB 프로토콜 #: STU00104680). 프로토콜의 전반적인 흐름은 그림 1에 나와.
 1. 기증자와 받는 사람 HLA 시퀀스 Bioinformatic 분석 <ol><li>IMGT/HLA 데이터베이스에서 시퀀스 검색 15.
	<li>장기 기증자와의 받는 사람 모두의 얻을 HLA 타이핑 보고서 <ol>. 
		참고: 기밀 의료 기록 보호 하기 위해 적절 한 절차를 활용 해야 합니다. 일반적으로, 연구 프로토콜 또는 실험 테스트의 기관 평가 위원회 (IRB) 승인이 기관 IRB 지침 당 필요 합니다. PCR 기반 입력 (높은 또는 낮은 해상도) 또는 시퀀싱 기반 입력 (SBT)에서 HLA 보고서 라면 1.1.3 단계로 직접 이동 합니다. 시퀀스/HLA 게놈 시퀀싱에서 가져온 그리고 그들은 완벽 한 이러한 시퀀스 직접 대신 사용 합니다. 때때로, 단지 불완전 한 입력 또는 시퀀싱 결과 사용할 수 있는 추가 단계 1.1.2 따라. 할당 하는 &#34; 누락 된 &#34; 단계 1.1.2에서에서 설명한 웹 도구를 통해 대립.</li>
		<li>오픈 웹을 다음과 같은 모호한 대립 유전자 조합 링크-http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, 및 사용 하 여 검색 된 &#8220; 모호한 대립 유전자 조합 검색 도구 &#8221; 가상 대립 유전자를 검색 하는 기능. 그런 다음, 1.1.3 단계를 진행 합니다. 대립 유전자 이름을 입력 하려면.</li>
		<li>다음 IMGT/HLA 대립 유전자 쿼리 양식을 열고 웹 링크-http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html, 및 입력된 제목 &#8217; s 대립 유전자 이름 (각각 개별적으로, 그림 2와 같이)에 &#8220; 검색 대 한 &#8221; 상자. 클릭은 &#8220; 지금 대립 유전자에 대 한 검색 &#8221; 단추. HLA 대립 유전자 이름이 표준 명명 시스템을 사용 해야 합니다 (즉, A *, A * 01, A * 01:01:01:01, 및 A * 01010101 같은 어떤 이전 지정).</li>
		<li>찾을 일치 하는 대립 유전자 이름을 화면에 표시. 대립 유전자 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>복사는 &#34; 단백질 시퀀스 &#34;, 헤더 줄의 아래 텍스트 문서에 붙여 넣습니다 그리고 &#34; &#62; 대립 유전자 이름 &#34;. 효과적으로, 텍스트 문서는 대립 유전자 이름 및 시퀀스의 FASTA (빠른-모든) 형식.</li>
	</ol></li> <li>유전자 기반 다중 수행 기증자와 받는 사람/환자 대립 유전자의 정렬.
	<li>하나 <ol>유전자 (즉, DQB1 * 03:01:01:01) 한 번에 복사 하 고 텍스트 문서에 기증자와 환자 FASTA 시퀀스 (기증자에서 2)와 두 개의 환자에서의 모든 4 개의 대립 유전자를 붙여 넣습니다. 이 시점에서, 그것은 차동 환자 대립 유전자 이름에서 기증자 대립 유전자 이름을 표시 하는 것이 중요 (옵션 차동 사용 낮은 경우; 대 위를 포함 하거나 별도로 기증자 대 표시 각 대립 유전자 이름에 구별 접두사 또는 접미사 확장을 만듭니다. 환자 대립 유전자)입니다. 정렬 순서는 순서의 어떤 쌍 든 지 사이 유사성 수준에 따라 단행 될 것입니다 다음 때문에 시퀀스의 입력된 순서가 중요 하지 않습니다.</li>
		<li>복사 및 붙여넣기 FASTA에 시퀀스 형식으로 위에서 (로 그림 3에서 본)는 &#8220; 입력된 시퀀스를 입력 &#8221; 클러스터 오메가 웹사이트에 상자: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.</li>
		<li>클릭 &#34; 작업을 제출 &#34; 매개 변수의 표준 설정을 사용 하 여:와 같은 &#34; PROTEINŔ 및 &#34; 숫자 승 Clustal &#34;. 클릭 하 여 정렬 수행 &#34; 제출 &#34;. 4 시퀀스의 정렬 화면 ( 그림 4)에 표시 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>기증자 전용 불일치 표시. 
	참고: 그것은 특별히 지적 한다 여기에서 주어진 유전자 시퀀스 시퀀싱 하지를 HLA 입력의 결과에 근거 했다 그. 따라서, 특정 기증자 받는 쌍에서 관련 시퀀스 변화를 놓칠 수 있습니다 위험이 있다. 이 잠재적인 문제 이상으로 완화 될 것 이다 더 많은 이식 센터 정확한 고해상도 입력을 채택 하 고 DNA 시퀀싱을 직접.
	<ol><li>복사 맞춤 텍스트를 텍스트 문서에 붙여 하 고 새 문서를 만듭니다. 정렬 된 파일의 포맷을 방해 하는 경우 글꼴 스타일과 크기를 변경 하 여 형식을 수정: 항상 사용 &#34; Courier New &#34; 행에 맞게 작은 종류 크기에 글꼴. 서식 문제를 해결 한 후 문서를 저장.</li>
		<li>수동으로 고유 기증자에 게 속해 있는 모든 일치 하지 않는 잔류물을 식별 하는 정렬 된 시퀀스를 검사 합니다. 각 구별 글꼴 색을 사용 하 여 이러한 기증자 특정 잔류물의 표시.</li>
		<li>기증자에 있는 모든 문자를 밑줄 &#39; s 시퀀스는 14 잔류물 모두 최대-확장 및 표시 된 기증자 전용 불일치의 다운스트림 (계산 불일치의 1 잔류물 마이너스 15 아미노산 펩타이드로).</li>
	</ol></li> <li>겹치는 시리즈 15-메 르 펩 티 드 순서 파생. 
	참고: 15-메 르 펩 티 드를 선택 하는 이유는 전형적인 epitopes 되 고 길이 4-9 아미노산의 일반적인 지식에 근거 했다. 따라서, 적용 될 때 우리는 &#34; 이동 창 &#34; 프로시저 4 아미노산 ( 그림 1), 15 아미노산 길이 우리의 선택의 스텝 크기를 왼쪽으로 15-4 = 11 아미노산 겹치는 어떤 이웃 펩 티 드 시리즈에서. 이론,이 11 아미노산 오버랩은 길이, 최대 9 아미노산의 모든 면역 epitopes를 커버 하기에 충분 아니 epitope 실수로 수 있도록 &#34; 분할 &#34; 배열에만 부분 시퀀스 반.
	<ol><li>밑줄이 시퀀스를 사용 하 여 서식 파일을 순차적으로 파생 짧은 시리즈에서 시리즈에서 어떤 두 개의 인접 한 시퀀스 간의 4 잔류물에 의해 중복 15 아미노산 시퀀스.</li>
		<li>복사 및 붙여넣기 스프레드시트 ( 그림 5)는 열 형식에서에 이러한 15 아미노산 시퀀스 기증자 대립 유전자의 해당 이름을 포함 하는 표기법 열 동반. Aa 잔류물 위치를 포함 하는 추가 열이 유용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>1.1.3에서 단계를 반복. 1.3. 각 HLA 대립 유전자 (즉, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1, DP) 기증자의 15 aa 짧은 시퀀스를 파생 하는 기증자와 받는 사람 쌍의에 대 한.</li>
	<li>복사 열을 만드는 긴 연속의 모든 15 aa 시퀀스는 기증자의 모든 대립 유전자에서 마스터 스프레드 시트에 모든 열을 붙여 넣습니다. 문서에서 (펩 티 드 순서)에 대 한 행의 총 수를 적어 둡니다.</li>
</ol> 2. 사용자 지정 배열 레이아웃 및 생산의 디자인 <ol><li>생성 해당 대립 유전자와 펩 티 드 순서의 스프레드시트 부름. 배열 20 행 및 30 열 및 20 x 30 = 600까지 저장할 수 있는 펩 티 드에 대 한 명소. 펩 티 드에 기록의 총 수에 따라 하나의 특정 기증자 로부터 1.5 단계 그리고 우리 류 외에 시도 했다 두 예제와 함께 우리의 과거의 경험을 기반으로. 17, 600 자리 배열 ~ 2 별도 이식 케이스에서 생성 된 모든 시퀀스를 저장할 수 있습니다.
	<ol><li>합리적으로 가장 e 계획600-자리 형식의 배열 내에서 펩 티 드의 세트에 맞게 fficient 방법.</li>
		<li>하나 이상의 주제는 하나의 전체 배열에 넣을 수 있는, 첫 번째 기증 후 빈 행을 삽입 &#39; 30 (배열에 있는 행에 관광 명소의 수)로 나눈 수 있는 행의 총 수에 맞게 s 시퀀스.</li>
		<li>즉시 다음 시퀀스의 첫 번째 집합에 대 한 마지막 빈 행, 두 번째 이식 사건에서 시퀀스 내용의 전체 열에 붙여 넣습니다.</li>
		<li>는 배열의 가득 아니 더 많은 경우 600 관광 명소를 초과 하지 않고 추가할 수 있습니다 때까지 이러한 단계를 반복 합니다. 전체 빈 행 하단에 작성 하는 경우 &#34; 이동 &#34; 두 기증자 세트 사이 위치를 빈 행. 이 넓은 공간을 경우 사이 왼쪽 게 3.2 단계 쉽게-다음 종합의 완료 후 막의 절단. 아래.</li>
	</ol></li> <li>배열 레이아웃의 맥락에서 펩 티 드 순서를 프로그램. 자리 합성기의 프로그램은의 시퀀스 (한 행 한 펩 티 드 순서), (대립 유전자 이름, aa에 대 한 추가 열 없이 간단한 텍스트 문서로 2.1.4 단계에서 결과 스프레드시트를 저장 하 여 직접 얻을 수 있는 텍스트 형식 위치 등).</li>
	<li>실행 자동화 된 펩 티 드 배열 합성 자리 합성기를 통해. 종합의 전체 작업은 Kudithipudi 외. 21에 상세 하다. 참고 두 배열의 Fmoc 합성 걸립니다 ~ 4-5 일.</li>
</ol> 3. 프로브 및 개인의 시간 시리즈에서 Reprobe Antisera 이식 받는.
 참고: 600-자리 막 배열 크기 ~ 7 cm x 13 cm는. 합성, 후 배열은 저장할 수 있습니다 실 온에서 건조 막으로 적어도 2 년 때 직접 빛 으로부터 차폐 된. 반복된 사용에 대 한 그의 장 수를 유지 하기 위해 막의 과도 한 접는 방지.
<ol><li>Rehydrate 에탄올 막 배열 및 펩 티 드 명소 Ponceau S.로 얼룩진 시각화
	<ol>막 rehydrate <li>배열 단계적 절차 리 외에 최적화 된 펩 티 드를 들고 24. <ol><li>100% 에탄올 20 mL에 배열 막 몰입할.</li>
			<li>추가 20 mL 증류수 50% 에탄올으로 솔루션을 희석 하 여 15 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
			<li>세 번 100% 물 40 mL를 집중 솔루션을 변경 하 고 각 시간 15 분을 품 어.</li>
			<li>예를 들어, 5 분에 대 한 세 번 20ml (Tris 버퍼 염 0.1%), TBST의 적절 한 작업 버퍼에서 세척.</li>
		</ol></li> <li>Ponceau S 합성 펩 티 드를 시각화 하는 배열의 얼룩 <ol><li>수산화 배열에 직접 사전 공식화 Ponceau S 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 ~ 30 품 어 떨고 s.</li>
			<li>실행 증 류 물 지속적으로 드 배경 Ponceau S 색 얼룩을 막. 과정에서 펩 티 드 명소 붉은 색의 표시 될 수 있습니다.</li>
			<li>개별 사례에 대 한 배열의 섹션 사이 신중 하 게 절단 하 여 각 기증자에 대 한 배열 부분을 구분 합니다. 각 배열의 방향을 표시.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>사전 블록 배열.
	<ol><li>블록 5%의 20 mL에 막 비-지방 우유 TBST 버퍼에 녹아. 이 우유 기반 솔루션 Ponceau S 컬러 드 얼룩 추가 됩니다. 깨끗 한 펩 티 드 이미지를 달성 하기 위해 여러 번 우유 버퍼를 교체.</li>
		<li>기록 유지 목적을 위해 휴대용 카메라 (예를 들어 그림 6 참조)를 사용 하 여 배열의 Ponceau S 이미지의 사진의 찍을.</li>
		<li>계속 5% 비-지방 우유 또는 락 2 h에 대 한 실 온에서 하룻밤에 4 ° C에서에 막의 차단.</li>
	</ol></li> <li>이식 원으로 품 배열. 
	참고: 그것은 이어야 한다 현상 prozone 라고 주의 또는 후크 효과 혈 청 항 체 분석에서 보완-종속 간섭에서 발생할 수 있습니다. 이 문제를 우회 하는 선택적 세럼 전처리 단계 혈 청 샘플의 EDTA 또는 열 비활성화로 여겨질 수 있다.
	<ol><li>블로킹 버퍼를 제거 하 고 세척 TBST의 20 mL와 함께 막 세 번 다음 날 5 분 동안 각 시간.</li>
		<li>2.5%의 20 mL를 받는 조 혈 청의 추가 20 µ L TBST 버퍼에 우유와 실 온에서 2-3 h에 대 한 막으로 품 어. 그의이 초기 라운드에서 것이 좋습니다 마지막 포스트 이식 혈 청 (또는 가능성이 가장 민감하게 혈 청) 시계열에서 사용 첫째 note. 이 사전 이식 시간 포인트에서 특히 시리즈에서 이전 표본 적은 다양 한 alloantibodies 시간이 지남에 개발 하는 경향이 있다고 가정 기반으로 합니다. 이 이렇게에서 신호 방해의 어떤 가능성 든 지 &#34; 이성 &#34; 라운드 프로브 사이 이식에 대 한 면역 반응으로 인해 진정으로 개발 된 alloantibody 반응에서 명확 하 게 구분할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>TBST의 20 mL를 사용 하 여 array를 세척 하 고 2 차 항 체로 품 어.
	<ol><li>씻어 3 시간 10 분 동안 막 때마다.</li>
		<li>또 다른 2 헤에 대 한 1% 우유와 함께 보충 TBST 버퍼에 1:10,000 희석에 염소 안티 인간 IgG-HRP (양 고추냉이 과산화 효소) 이차 항 체와 품</li>
	</ol></li> <li>세척 하 고 오 점 개발.
	<ol><li>씻어 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막 때마다.</li>
		<li>갓 luminol 솔루션의 5 mL을 사용 하 여 수행 향상 된 화학 (ECL) 과산화 수소 솔루션 개발 (1 분)에 대 한 막의 5 mL와 혼합.</li>
		<li>시각화 ECL 적합 한 영상 (즉, ChemiDoc 이미징 시스템이 나 Azure C600)를 사용 하 여 신호.</li>
	</ol></li> <li>스캔 및 오 점 계량.
	<ol><li>개발된 이미지 ( 그림 7, 낮은 이미지)를 저장 하 고 자리 강도의 정량화를 수행.</li>
	</ol></li></ol> 4. 임상 시계열 원으로 반응성 비교.
<ol><li>스트립 배열.
	<ol><li>이 시점에서 계속 항상 젖은 막.</li>
		<li>20 분 동안 37 ° C에서 상업 스트립 버퍼의 20 mL와 함께 배양 하 여 멤브레인을 제거 하 고 10 분에 대 한 세 번 TBST 가진 막 씻어. 다음 차단 (4.2 단계)와 다른 시간에 찍은 환자의 다른 혈 청을 사용 하 여 검색 (4.3 단계) 단계를 반복.</li>
	</ol></li> <li>블록 제거 막. 
	참고: 다음 스트립, 막의 시간 시리즈에서 동일한 환자에서 다른 혈 청의 또 다른 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다.
	<ol><li>이전 5% 우유 버퍼를 사용 하 여 막 차단 (단계 3.2 참조).</li>
	</ol></li> <li>같은 시계열 (3.3-3.6에서 반복 단계, 그림 7, 위 이미지에서에서 예제)에서 다른 원으로 reprobe. 
	참고: 제거 배열 다음 다른 혈 청 견본 reprobe를 사용할 수 있습니다. 이후는 펩 티 드 covalently 막의 지원 매트릭스를 활용은, 우리 배열 스트립과 그 perfo를 잃지 않고 사이클 reprobing의 최대 20 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다 보였다rmance.</li>
	<li>배열의 장기 저장.
	<ol><li>저장소 TBS 버퍼에 막 부식으로 0.02 %w / w 나트륨 아 지 드와 함께 보충. 봉인된 된 비닐 봉투를 사용 하 여 장기 보관을 위해. 직접적인 빛에서 보호에서 4 ° C에서 젖은 막 적어도 2 년 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 5. 데이터 수집 및 분석 <ol><li>수동으로 주석을 긍정적인 항 원 펩 티 드.
	<ol><li>긍정적인 항 체 신호를 보여주는 관광 명소를 찾아서 각 그들의 격자 위치 결정.</li>
		<li>긍정적인 펩 티 드에 대 한 마스터 워크시트에서 해당 행을 강조.</li>
	</ol></li> <li>검색 마스터 워크시트 ( 그림 7, 하단 목록)에 나열 된 펩 티 드 순서. 단계 1.4.1에서에서 설명 하는 디자인 원리에 따르면., 크게 겹치는 순서를 공유 하는 인접 직렬 명소 (15-4 = 11), 따라서 반응 epitopes 공유할 수 펩 티 드 연속 시리즈에서.
	<ol><li>연속적으로 발생 하는 어떤 긍정적인 반점 든 지 강조.</li>
	</ol></li> <li>일련 있는 각 펩 티 드에 대 한 최소 epitope 길이 결정.
	<ol><li>어떤 잠재적으로 공유 피토 프 시퀀스 세그먼트 반응 펩 티 드의 중복에 따라 하이라이트.</li>
	</ol></li> <li>구조적 모델 항 원 epitopes.
	<ol><li>얻을 프로토 타입 HLA 크리스탈 구조 단백질 데이터 은행에서 다음에 발견 웹 링크: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.</li>
		<li>Pymol (www.pymol.org에서 다운로드)에 HLA 구조 프로토 타입을 표시.</li>
		<li>지도 &#34; 또는 모델 반응 펩 티 드 순서 ( 그림 8)를 강조 표시 하 여 프로토 타입 HLA 분자의 3D 구조에 반대로 기증자 epitopes를 발견. 클릭 &#34; 표시 &#34;, 다음 &#34; 배경 &#34;, 선택 하 고 &#34; 화이트 &#34;. 이미지를 저장 하려면 &#34; 파일 &#34; 및 &#34; 다른 이름으로 이미지 저장 &#34; 파일 포맷을 선택 &#34; png &#34;.</li>
	</ol></li> <li>결과 보고 하 고 해당 대립 유전자에 반응 epitopes를 할당할.</li>
	<li>비교 가능한 경우 단일 원 구슬 (SAB) 결과 결과 배열. 
	참고: SAB 테스트 사용 하 여 단일 유전자 항 원 HLA 단백질의 고정된 패널 쪽으로 항 체 반응을 측정 합니다. 개별 펩 티 드 항 체 반응을 보여 주는 또한 SAB 패널에 포함 된 경우 배열와 SAB 결과 사이의 직접 비교를 허용 하는 특정 HLA 대립 유전자에 속한다. 우리의 이전 연구 17 펩 티 드 epitopes SAB.의 전반적인 반응에 크게 기여 하는 것을 건의 결과 간의 상관 관계의 높은 수준을 보였다 또한, 배열 결과 또한 아미노산-특이성의 레벨을 공개.
	여부에 대 한 정보를 제공 하 고 어떤 기증자 대립 후 이식 환자의 혈 청을 반응 <ol><li>얻기 SAB HLA 실험실에서 결과. 단계 5.5에서에서 결과입니다. 배열에 따라 분석 또한 alloantibody 반응성에 대 한 긍정적인 해당 기증자 대립 유전자에 대 한 정보를 제공.</li>
		<li>비교 SAB 및 배열 결과.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

여기서 설명 하는 자리 배열의 디자인은 이식 한 장기 기증자의 HLA 항 원에 대 한 alloantibody 특이성의 실험 연구입니다. 기존 SAB 클리닉에서 광범위 하 게 사용 분석 결과, 달리 항 배열 메서드는 개별 기증자의 진정한 HLA 시퀀스를 수용할 수 있는 유연한 디자인에 주요 이점이 있다. 곧 모호성16,27 없이 정확한 HLA 유전자 시퀀스 판독을 생산할 수 있을 것입니다 빠르게 전진 DNA 시퀀싱 기술의 잠재력 및 지정 된 데이터베이스의 잠재력을 악용 하는 새로운 플랫폼 저장소에 대 한 HLA15 세계 인구에서 시퀀스. 우리의 현재 배열 검사 프로토콜 이식 세라의 여러 파일럿 연구의 성공에 따라 개발 되었다. 여기 우리는이 단계에서 우리의 프로토 타입 배열 건설 하지 임상 연습에서 진단 응용 프로그램에 대 한 연구 사용에 대해서만 강조 해야 한다.
<p cla...

전 세계에 걸쳐 정기적으로 실시 하는 기관 대체 요법 수백만의 목숨을 저장 하고있다. 동안 큰 번호 아직도 대기에 기증자 기관 (기관에 의해 제공 된 정보에 따르면 공급의 심각한 부족으로 인해 받을 수 단단한 장기 이식, 매년 미국에서 백만 명 당 약 100 환자에서 발생 조달과 이식 네트워크-OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). 장기 이식 기관 낭비 하 고, 생명을 구할 높은 규제는 하지만 이러한 규정을 알려 하는 데 사용 하는 과학적인 도구 효과에서 제한 됩니다. 예를 들어, 과학계는 완전히 HLA 분자의 높은 다형 상태를 인식 하 고 고해상도 입력 하 고 (SBT) 입력 시퀀스 기반을 사용 하 여 DNA의 정확한 유전 테스트 최근 몇 년 동안1, 에서 개발 되었습니다 그러나 2., alloantibody 검사 방법 아직 되지 않은 항 원 조사로 개별 HLA 시퀀스의 광대 한 다양 한 생산할 수 있게. 현재는 불변 패널을 사용 하는 표준 시험 ~ 100 유전자 항 원 HLA의 일반적인 이체의 구성 하는의 A, B, C, DQ, DP와 박사는 인구3,4,,56시퀀스. 자주, 실제 기증자의 HLA 시퀀스에에서 포함 되지 않은 강제 이식 의사와 외과 기증자의 실제 시퀀스와 해당 "표준" 사이의 공유 유사성에 따라 기증자 특정 반응성 추론 테스트 패널에는 테스트 설정7,8. 따라서, 그것은 때로는 거부 위험 항 체 테스트 결과9,10,,1112에 따라 신뢰할 수 있는 평가 하도록 도전. 따라서, 새로운 개인적으로 alloantibodies에 대 한 사용자 정의 테스트는 긴급 하 게 필요한13,14.
HLA 유전자는 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 수용 체를 면역 반응6에 있는 주요 기능을 인코딩합니다. HLA 유전자 인간 게놈6의 가장 다형성 유전자 알려져 있습니다. DNA의 급속 한 발전으로 인해 시퀀싱 HLA 유전자의 새로운 유전자 변형에 대 한 전략 (또는 단순히 대립 유전자 라고 합니다)는 폭발적인 속도15,16에서 발견 되 고 있다. 3 월 2017 년까지 16,755 검증된 대립 했다 입금 되었습니다 IMGT/HLA 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html)에 12,351의 클래스의 했다 내가 하 고 4,404 클래스 II 그룹의 했다. 강한 대조에서는,만 조금 100 가지 대립 유전자는 일상적으로 장기 이식에서 alloantibodies를 검색 하는 데 사용 되는 표준 단일 원 구슬 (SAB) 분석 결과에 표시 됩니다. SAB 메서드 cytometry 사용 Luminex 플랫폼을 기반으로 합니다. 이후 분석 결과 활용 생산, 작은 일괄 처리에 배치 variabilities 외 항, 불변 집합 개인 및 실험실5를 통해 튼튼하게 원으로 테스트 표준화 수 있다. 그러나,이 테스트는 특히 기증자 시퀀스는 결 석 하는 경우 기증자 대립 유전자에 대 한 구체적으로 개발 하는 모든 alloantibodies를 캡처할 수는 SAB에서 설정. 진정한 시퀀스에 따라 기증자의 항 원의 사용자 지정 생산 하는 데 필요한, 하지만 필요한 생산을 합리화 하 고 테스트 절차에 기술적도 전에 남아 있다.
우리는 최근 신장 이식 과목17의 타당성 조사에서 다른 방법론을 설명합니다. 메서드와 사전 조사에 대 한 펩 티 드 항 원은 배열 형식에 사용 후 세라 개별 과목의 이식. 각 배열이 했다 자리 합성 방법18,19,20,21,22,23 펩 티 드 항 원, 각 15 생산을 사용 하 여 사용자 지정 길이, 아미노산 완전히 기반으로 각 장기 기증자의 HLA 대립 유전자 a, B, C, DQA1, DQB1, DRB1. 자리 합성 표준 Fmoc 화학22 를 사용 하 여 셀 루 로스 멤브레인에 운영 되 고 완전 자동화 된 로봇 시스템19,21병행에서 사용자 지정 펩 티 드의 수백을 생산할 수 있다. 막 배열 스트립 및 사이클 reprobing의 여러 라운드를 견딜 수 있습니다. 우리의 회고전 연구17, 우리는 저장된 이식 antisera (즉, 이식 전후) 시계열에서 수집 된 항 원 패턴의 변화를 감지. 여기 우리는 제조, 원으로 조사 및 결과 분석 배열 디자인을 포함 하 여 워크플로에 대 한 기술 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 특정 선형 epitopes 이식 기증자의 HLA 분자에 대 한 alloantibodies를 감지 하는 위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>펩타이드 어레이</td><td>INTAVIS 바이오분석 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>무지방 우유</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1706404</td><td></td></tr><tr><td>TBST</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>10711454001</td><td></td></tr><tr><td>염소 반인간 IgG&ndash; 인사&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A18811</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>복원 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼</td><td>Thermo Scientifics</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 젤 이미징 시스템</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1708265&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

장기 이식에서 hla alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

장기 이식, 기능 및 장 수는 이식의 비판적으로 의존 인간 백혈구 항 원 (HLA)에 대 한 면역 거부 반응 제어 성공. 실험실 테스트 안티-HLA 면제, 기존으로 선물의 기반으로하는 조직 적합성 지침 또는 드 노 보 주요 이식 장벽을 구성 하는 HLA 항 체를 생성. 현재 테스트 ~ 100 미리 재조합 HLA 항 원에 대 한 고정된 된 이식 세라 프로브를 사용 하 여 단일 원 구슬 (SAB) 플랫폼을 기반으로 합니다. 그러나, 인 간에 있는 HLA 종류, 쌍둥이 이외의 HLA 시퀀스의 동일한 조합을 공유 하는 수 없이 두 개인의 훨씬 더 큰 다양 한을 존재 한다. HLA 타이핑과 직접 시퀀싱 기술 DNA 순서는 기증자의 사이 어떤 불일치를 정확 하 게 캡처할 수 있습니다 받는 사람의 HLA, SAB 분석 결과 시퀀스 표시에서 그것의 한정 된 다양성 때문이 정확 하 게 감지할 수 있는 동안 기증자의 HLA 불일치에 대 한 구체적으로 alloantibodies입니다. 우리가 감지 하 고 개인으로 반대로 기증자 HLA 항 체의 특성 다른 기술을 사용 하 여 보완 방법을 개발 하고자 했다. 검사 도구는 주문 펩 티 드 항 체 중재 거절에 대 한 위험을 평가 하기 위해 기관 수령인의 포스트 이식 세라 프로 빙에 대 한 기증자 HLA 파생 된 시퀀스의. 한 기증자 받는 쌍에 대 한 단일 배열에 600 독특한 펩 티 드까지 만들어집니다 기반으로 기증자의 HLA 단백질 시퀀스에 15-아미노 산 성 순서로 하나 이상 일치 하지 않는 찌 꺼 기를 들고 각 펩 티 드. 사전 및 사후 식을 세라가이 배열에 대 한 항 원 패턴을 비교를 우리의 파일럿 실험, 또한 관련 된 면역 epitopes를 정확 하 게 우리를 허용 하는 해상도와 안티-HLA 신호 수 있었습니다. 이러한 맞춤 항 배열 장기 이식 기증자 특정 HLA epitopes의 고해상도 검출 허용.

원래 연구 방법17상영 하는 배열을 사용 하 여, 우리는 신장 이식 과목 5 과목의 총 등록. 우리는 입력 결과 우리의 코 호트의 및 그들의 각각 기증자의 HLA를 얻은. 그들의 병력 및 유전자 항 체 titers SAB 테스트에서 우리에 게 제공 했다. 이 5 환자의 우리의 파일럿 연구에서 두 개의 다른 방법론 고안: 각 기증자와 받는 사람 쌍에 대 한 사용자 지정 된 펩 티 드 및 맞춤의 고정된 패널의 구성 표준 배열 만든. 이 후자의 방법에 대 한 맞춤된 프로토콜이 기사와 의도 비디오에서 설명 하는 첫 번째 방법은 기술적으로 개별 이식에 특이성의 높은 수준을 달성 배열 플랫폼의 성능을 확인 하기 위해 우리를 허용 했다, 기증자 특정 항 체 (DSA)의 포괄적인 검사는 종종 가난한 이식 결과5,,25<...

장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

동종항체 검출을 위한 이 맞춤형 어레이 방법의 전반적인 목표는 장기 이식에서 인도적 백혈구 항원 또는 HLA 항원결정기를 묘사하는 것입니다. 이 방법은 이식 거부 반응과 관련된 특정 면역 항원결정기에 대한 장기 이식 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 완전히 사용자 정의할 수 있어 개별 장기 기증자의 HLA 염기서열을 반영할 수 있는 맞춤형 항원 세트를 통합할 수 있다는 것입니다.이 기술은 동종항체에 대한 특정 HLA 항원결정기를 검출할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. International Immunogenetics Project human leukocyte antigen project 데이터베이스에서 염기서열을 검색하려면 ambiguous allele combinations 페이지에서 데이터베이스 대립유전자 쿼리 양식을 열고 검색 대상 상자에 피험자의 첫 번째 대립유전자 이름을 입력합니다. Search for Alleles Now(대립유전자 지금 검색)를 클릭하고 화면에 표시된 일치하는 대립유전자 이름을 찾습니다.대립유전자(Allele)를 클릭하고 단백질 염기서열을 복사하여 텍스트 문서의 대립유전자 이름 헤더 줄 아래에 붙여넣어 대립유전자 이름을 FASTA 형식으로 배열합니다. 모든 염기서열이 식별되면 FASTA 형식의 염기서열을 복사하여 Cluster Omega 웹 사이트의 입력 염기서열 입력 상자에 붙여넣고 표준 매개 변수 설정을 사용하여 작업 제출을 클릭합니다. 그런 다음 제출을 클릭합니다.시퀀스의 정렬이 표시됩니다. 기증자별 불일치를 표시하려면 정렬 텍스트를 복사하여 새 텍스트 문서에 붙여넣고 구별되는 글꼴 색상을 사용하여 기증자에게 고유하게 속하는 정렬된 염기서열 내에서 일치하지 않는 각 기증자별 잔여물을 표시합니다. 표시된 공여체 특이적 불일치의 상류 및 하류로 14개의 잔기를 확장하는 공여체 염기서열의 모든 문자에 밑줄을 긋고, 밑줄이 그어진 염기서열을 템플릿으로 사용하여 계열에서 바로 인접한 두 서열 사이에 4개의 잔기로 겹치는 일련의 짧은 15개 아미노산 서열을 순차적으로 파생합니다.이 15개의 아미노산 염기서열을 복사하여 열 형식의 스프레드시트에 붙여넣고, 공여 대립유전자의 해당 이름을 포함하는 표기법 열을 함께 붙여넣습니다. 사용자 정의 배열 레이아웃을 설계하려면 20개의 행과 30개의 열이 있는 해당 대립유전자 호출이 있는 펩타이드 염기서

personalized-peptide-arrays-for-detection-hla-alloantibodies-organ

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

유도 및 항원에 특정한 T 세포의 확장을위한 새로운 DC 독립적인 방법을 설명합니다. HLA A2 - IG 기반의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)을 효율적으로 다양한 항원 특이성의 CTL 확장 HLA - A2 제한 펩티드와 함께로드됩니다. 이 기술은 CTL 기반 입양 immunotherapy에 대한 잠재력을 보유하고 있습니다.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

이 비디오는 장기 수혜자에서 항기증자 HLA 동종항체를 검출하는 분석을 보여줍니다. 펩타이드 어레이는 항체 매개 장기 거부 반응에 대한 잠재적인 에피토프를 나타내기 위해 합성됩니다. 어레이는 표적 항원결정기에 결합하는 동종항체를 포함하는 수용체의 혈청과 함께 배양됩니다. 항체 결합은 동종 항체 반응을 유발하는 donor specific HLA epitope를 식별하기 위해 chemiluminescence를 사용하여 검출됩니다.

장기 수혜자에서 항공여자 HLA 동종항체의 펩타이드 어레이 기반 검출

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

그대로 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 암 관련 잠재적 바이오 마커를 나타내는 암세포 흘린된다. 모노클로 날 항체, 쉐드 MIF / HLA-A의 검출을 흉내 라벨없는 센서 기술 및 T 세포 수용체를 활용 * 02 : MDA-MB-231 세포 상청액 01 착물은, 인간 혈청 아군 및 환자 혈장의 개발을 가능하게 입증된다 새로운 암 진단 플랫폼입니다.

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

이 논문은 정의된 동종항원에 특이적으로 반응하는 인간 T 세포 클론의 생성 및 증식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 펩타이드-MHC 리간드에 특이적인 인간 T 세포를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

여기서, 우리는 고품질 면역 펩티도믹스 데이터를 제공하는 마우스 및 인간 세포주로부터 MHC 급 I 및 클래스 II 펩티드 복합체의 정화를 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 시판되는 항체를 사용하여 샘플 준비에 중점을 둡니다.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

배우세요 장기 이식에서 맞춤형 항원 배열을 이용한 HLA 동종항체 검출 방법을. 이 기술은 개별 기증자의 HLA 서열을 반영한 개인화된 항원 세트를 활용하여 면역 반응을 정확히 분석하고 이식 거부 반응의 핵심 표위를 식별하는 데 활용됩니다.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

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