Name: 높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: 배우세요 Drosophila 태아와 조직에서 높은 해상도 RNA 현위치 하이브리다이제이션 방법을 Tyramide 신호 증폭과 96웰 플레이트를 사용하여. 이 기법은 세포 및 발달 생물학 연구에 RNA 공간 분포를 저비용으로 정밀하게 검출합니다.

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이 프로젝트에 대 한 지원 자금 건강 연구의 캐나다 학회 (청소 133473 부여)에 의해 HMK에 교부 금에 의해 제공 했다.

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

설명된 프로토콜 고정 초파리 배아 또는 조직에서 대부분 RNAs의 검출에 대 한 매우 민감한, 재현 하 고 경제적인 방법을 제공 한다. 전통적으로 프로브 탐지의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 방법의 사용 하는 더 많은 것 보다 약간 더 복잡 하지만 물고기에 의해 얻은 해상도 훨씬 더 큰 하 고 감도 비교 또는 향상 7,8. 전체 또는 일부 결정 플레이트를 사용 하 여 관심사의 유전자의 대규모 또는 제한 된 분석에 대 한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 프로브 생성 모두를 검색할 수 있습니다 또는 프로브는 좀 더 구체적으로 설계 된 하지 않는 한 여러 성적 결합 형성에 주목 해야 한다 (즉, 단일 exons). 우리는 작은 적당 한 성공 가진 200 뉴클레오티드 프로브 테스트, 비록 작은 프로브 덜 효과적일 하는 경향이 하 고 덜 특정 수 있습니다. 명확 하 게,이 프로토콜 microRNAs 처리 또는 작은 introns, exons의 검출에 적합 하지 않습니다.
이 이렇게 효소 단계를 사용 하 여 신호 강도 향상, 하지만 신호 강도 비례 식 레벨의 비교적 선형이 고 광범위 한 범위에서 대상 유전자 발현 하 것 처럼 보인다. 더 높은 확대, 신호 puncta 또는 얼룩으로 볼은 세포와 조직 내에서. 비교적 드문 성적 증명서에 대 한 몇 가지 작은 puncta 볼 수 있습니다. 사본 풍부 하 게 증가 함에 따라이 수와 크기에서 성장 한다. 단일 분자 물고기 (smFISH), 것과 같이 단일 작은 puncta 단일 RNAs에 해당 또한 수 고 한다 또한 쉽게 측정할 수 이미징 및 정보학 소프트웨어를 사용 하 여. 동일한 대상에 대 한 우리 큐레이터 이미지와 함께 smFISH를 사용 하 여 얻은 게시 된 이미지의 비교 제안이 더 엄격한 비교 하 여 테스트 해야 하지만 전반적으로, 감도 및 해상도 두 가지 방법의 상대적으로 비슷한는. SmFISH의 훨씬 더 높은 비용을 감안할 때, 여기에 제공 된 메서드는 비용의 일부분에서 비슷한 결과 주어 야 한다. 그러나, 목표는 작은 성적표 또는 성적 증명서의 부분을 검출 하는, smFISH 것이 좋습니다.
일부 물고기 프로브 작은 크기 때문에이 메서드는 대형 또는 중요 한 장벽을 관통 조직에서 더 나은 수도 있습니다. 그러나, 높은 세제 수준 및 조직 고정 및 permeabilization 조작의 사용이이 문제를 해결 하려면 나타납니다. 마지막으로, 초파리 조직 개발, 해 부 조직에 대 한 여기에 설명 된 높은 세제 버퍼 초파리 배아로 대부분 다른 유기 체와 조직에 대 한 또한 작동 해야 한다.

RNA-seq 같은 새로운 RNA 게놈 넓은 탐지 방법 우리의 지식과, 유전자 표현는 언제, 어디의 무슨 레벨1에서 크게 확대. 그러나,이 상대적으로 가난한 시간적, 공간적 해상도 제공합니다. RNA 제자리 교 잡에 따라서 세포 및 subcellular 지 방화2의 세부 사항을 공개 고정 조직, 시각적으로 관찰 기록의 공간 배급을 허용 한다. 형광 성 제자리 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 더 많은 공간 해상도를 confocal 빛 시트 현미경3같은 강력한 현미경 검사 법 기술의 사용을 허용 수 있습니다. DAPI 같은 형광 마커 subcellular 관계4설정에 사용할 수 있습니다. 물고기는 또한 subcellular 수준에서 중복의 명확한 표시와 동시에 여러 개의 RNAs 단백질의 관측을 촉진 한다. 독특한 시 약 및 더블 라벨에 필요한 단계는 다음 참조3,5에서 찾을 수 있습니다.
여기에 설명 된 절차 96 잘 결정 플레이트 cDNA 템플릿 생산 (식민지 PCR), RNA 프로브 생산 (T7, T3 또는 SP6 중 합 효소 종속 실행 전사 사용) 에서 제자리 교 잡를 포함 하 여 모든 단계에 대 한 활용 및 형광 신호 개발입니다. 충분 한 수의 배아 또는 조직 각각에 추가 됩니다 수 있도록 일관성과 다양성의 평가 96 잘 접시의 잘. 각 그럼 다른 조사를 받습니다. 신호 개발 후 배아 또는 각 우물에서 조직 현미경 분석에 대 한 개별 현미경 슬라이드에 짓고 있다.
프로브 탐지를 위한 tyramide 신호 증폭 (TSA)를 사용 하 여 뛰어난 subcellular 해상도 5,6,,78강력한 신호를 생성합니다. RNAs의 subcellular 지 방화 발생 하는 거의 모든 RNAs 4,,1011에 표시 되는 중요 한 규제 메커니즘 9 입니다. 이 분석에서는 RNA-seq에 의해 검색 되지 않은 많은 성적은 쉽게 물고기 8에서 검색도 나타났습니다. RNA 교 잡 제자리에서 96 잘 접시에 적응 한 번에 (추가 하는 경우 더 많은 접시를 사용), 큰 데이터 집합의 분석을 가능 하 게 관심의 최대 96 유전자의 분석을 수 있습니다. 작은 섹션으로 번호판을 절단 하 여 메서드는 단지 몇 가지 샘플을 쉽게 적응 됩니다. 제공 하는 프로토콜은 대부분의 유형의 조직에서 RNA 배포판의 분석에 적합 합니다. 표시 되지 않습니다, 그것은 비-초파리 조직으로 잘 적응할 수 있는입니다.

<table><tbody><tr><td>15ml 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>인증 DNase 및 RNase free</td></tr><tr><td>2x PCR 마스터 믹스(염료(Ambiogene)포함)</td><td>Biomart(캐나다)</td><td>141106-1K</td><td>인증 DNase 및 RNase 무료</td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>인증 DNase 및 RNase 무료</td></tr><tr><td>96웰 여과판(1.2um, 친수성 PVDF 멤브레인</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>플로팅 티슈로 플레이트 바닥의 liguid를 제거하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>96-well PCR 플레이트(200 &mu; l)</td><td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 주사기 필터(0.2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 주사기 필터(0.45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>박테리아 글리세롤 스톡을 저장하기 위해</td></tr><tr><td>AXYGEN Aluminum을 사용합니다. 플레이트 씰</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>플레이트 밀봉</td></tr><tr><td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>To transfer samples</td></tr><tr><td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &mu; g/ml 또는 1/400 희석.</td></tr><tr><td>브랜드 8채널 매니폴드(오토클레이브 가능)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>96-웰 PCR 플레이트의 상단에서 액체를 제거하기 위해</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>재고 농도 34 mg/ml 용해 및 0.2&mu; m 100 % EtOH (1/1000으로 사용)</td></tr> <tr><td>시아닌 3 티라미드 (Cy3-TSA)</td> <td>집에서 만든</td><td></td><td>Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Antifade 시약 장착 매체</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-uridine-5'-triphosphate</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>배아 수집 케이지</td><td>홈 제작</td><td>N/A</td><td>크기: 75cm X 75cm X 75cm 폴리메틸메타크릴레이트로 제작</td></tr><tr><td>Eppendorf 원심분리기 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5804</td><td>A-Z-DWP 로터의 96웰 플레이트용 원심분리기</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>재고: 50 mg/ml. 작업 농도 1 mg/ml in Hybridization solution</td></tr><tr><td>Lab Armor Beads</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Fill in heating unit</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Sample mixing</td></tr><tr><td>Mesh - 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>배아 수집용</td></tr><tr><td>Mesh - 800 microns</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>느슨한 조직을 잡기 위해 / 그림 4의 특수 튜브에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로 커버 안경</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>크기 : 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>마이크로 슬라이드, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>크기 : 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>멀티 웰 플레이트 진공 매니 폴드</td><td>Pall Corporation</td><td>P / N 5017</td><td>96 웰 필터 플레이트 바닥에서 액체 제거</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드 (PFA)</td> <td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>고정</td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>Bio-Rad</td><td>모델 : DNA Engine PTC-200</td><td>96웰 플레이트 PCR 및 프로브 변성</td></tr><tr><td>피크르산 용액</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>조직 고정용 I 용액</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트용 PP 뚜껑, 100/케이스</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>플레이트 보관용 뚜껑</td></tr><tr><td>Progene 일회용 시약 저장용기(50ml, 멸균)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>액체 취급</td></tr><tr><td>Progene 피어싱 가능한 알루미늄 호일</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Seal 96-well plate, DNase 및 RNase free</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>배아 투과화</td></tr><tr><td>RiboLock Ribonuclease 억제제</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Unit/ul</td></tr><tr><td>Ribonucleoside Triphosphate(NTP) 세트</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td>RNA 프로브 sythesis</td></tr><tr><td>RNase free water</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>RNA 프로브 sythesis</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>RNase 오염 제거</td></tr><tr><td>연어 고환에서 단일 가닥 DNA</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>혼성화 용액</td></tr><tr><td>용 탈지유 (무지방 전력)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>작업 농도는 차단 시약으로 1 X PBT 또는 PBTT에서 1 %입니다</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 (NaOAc) 3 M, pH = 5.2 (RNase 없음)</td> <td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>작업 농도는 DNA 또는 RNA 침전의 경우 10 % (v / v)입니다</td></tr><tr><td>SP6 RNA 중합 효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Unit / ul</td></tr><tr><td>Stainless Steel Shot for Sand Bath VWR</td><td></td><td>13259-274.</td><td>난방 장치를 채우려면</td></tr><tr><td>실체현미경 및 구즈넥 광원</td><td>Leica</td><td>모델: MZ6</td><td>조직 해부 및 장착</td></tr><tr><td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>S911</td><td>2차 항체 재고: 1 mg/ml, 1/1000 희석(1 &mu; g/ml)를 사용합니다.</td></tr><tr><td>T3 RNA 중합효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>Tip station (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>인증 DNase 및 RNase free</td></tr><tr><td>팁 스테이션 (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>인증 DNase 및 RNase free</td></tr><tr><td>팁 ( 1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>인증 DNase 및 RNase free</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>작업 농도는 in situ</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>배아의 경우 1 X PBT에서 0.3%입니다</td></tr>. <tr><td>Whatman 정성 여과지, Grade 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td>Preparation</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) 글리세롤 퇴색 방지 마운팅 미디어</td><td></td><td></td><td>DABCO (1.25 g), 글리세롤 (35 ml 또는 v/v 70 %) 및 1 X PBS (15 ml 또는 v/v 30 %). 어두운 곳에 두어 차가운 방에 있는 바위를 두십시오. -20 &deg에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td></tr>1 <tr><td>X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS 1 ml Tween 20 (0.1 %) 및 3 ml Triton-X-100 (0.3 %)1</td></tr> <tr><td>X PBTB (1L)</td><td></td><td></td>1 <td>X PBT 1</td></tr><tr><td>X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td>1 <td>% 탈지유 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

표현의 패턴 및 초파리 게놈 넓은 기준 RNAs의 subcellular 지 방화를 결정 하기 위해 노력 하 고 다양 한 조직에에서, 우리 우리의 원래 형광 현장에 수많은 수정 및 향상 된 개발 했습니다. 교 잡 (물고기) 프로토콜. 처리량 및 비용 효율성을 촉진 하기 위하여 신호 검출 프로브 세대에서 모든 단계는 exon 결정 96 잘 접시를 사용 하 여 수행 됩니다. Digoxygenin (파)-이라는 antisense RNA 프로브 템플릿으로 게놈 DNA 또는 cDNA 클론을 사용 하 여 생산 됩니다. 조직 고정 permeabilization 후에, 프로브는 성적 관심에 때 교배 하 고 biotin, streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 활용 하 고 붙일 활용에 활용 된 안티 발굴 항 체의 승계를 사용 하 여 검색 tyramide, HRP, 존재는 즉시 인접 한 단백질의 전자 밀도가 지역에는 반응성이 매우 높은 중급. 이러한 증폭 및 지역화 단계 두 세포 및 subcellular 사본 지역화를 용이 하 게 하는 강력 하 고 매우 지역화 된 신호를 생성 합니다. 제공 하는 프로토콜은 다양 한 조직 및 발달 단계에서에서 매우 구체적인 신호를 생산 하기 위해 최적화 되었습니다. 참조 또한 동시에 여러 성적 증명서 또는 성적 증명서 및 단백질의 동시 탐지를 허용 하는 추가 변이 대 한 제공 됩니다.

그림 6 은이 절차를 사용 하 여 얻은 결과의 예를 보여줍니다. 상위 3 패널 패널 표시 예제 늦게 신호 초파리 배아 (amnioserosa, 근육 및 중앙 신경 조직, 다른 조직에 초기 초파리 배아 (그림 6, 패널 A-C), 다음 3의 예를 보여 각각 (그림 6, 패널 D-F). 다음은 예제 3 탈피에서 애벌레 조직 (그림 6, 패널 G J)입니다. 성인 생식 기에서 대표 이미지를 표시 하는 패널 K와 L (난소와 고환, 각각). 수백 개의 이미지는 업로드 하 고 우리의 검색에서 주석 '형광 제자리에 과일 파리 데이터베이스' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 프로토콜 및 키 장비 개요. CDNA의의 (A) PCR 증폭 (B) 녹음 방송 생체 외에서 생성 유전자 특정 센스 발굴-96 잘 접시 (b에서 표시 판의 사진)에서 RNA 프로브 표시. (C) 와 (D): 성인 (여성: 남성 비율 2:1. 300-400 파리/병) 파리 3-4 일 동안 친구를 사용할 수 있습니다. 25 ° C에서 표준 cornmeal 음식에 하룻밤 컬렉션에서 배아 통풍이 잘 플라스틱 상자에 전송 됩니다 (컨테이너 크기에 cornmeal 음식의 1 L: 8 "X 8" X 3"LWH) 또는 적절 한 애벌레의 밀도 유지 하는 새로운 병. 조직 컬렉션에 대 한 활성 효 모 분말, 계란 (AEL) 누워 후 48 h 24 음식 위에 뿌리고 해야 합니다. (H E): 교 잡 실험 형광 제자리에서 3 일 연속 수행. 사진 b 8 채널 흡 인기 (사진 c)와 같이 배아 또는 부동 하지 않는 조직, 96-잘 PCR 플레이트를 사용 합니다. 대부분 애벌레 조직 처럼 떠 조직에 대 한 필터 바닥 플레이트 d에서 (사진)를 사용 하 고 낮은 압력 (e에서 사진)를 사용 하는 매니폴드 흡 인기와 바닥에서 액체를 제거 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
그림 2입니다. RNA 프로브 수익률의 결정입니다. 새로 합성 antisense RNA 프로브 1 %agarose 젤 (5 µ L/레인)에 관찰. 수익률 (밴드의 강도에 따라) 분류 될 수 있다 '낮은 수익률' 3, 10 차선에서 1, 4, 5, 6, 8, 차선에 ' 전형적인 항복' 또는 '고수익' 차선 2, 7, 9, 11 및 12에서에서. '전형적인 수익률' 샘플에 대 한 조사 각 현장에서 실험에 대 한 교 잡 솔루션의 100 µ L에 희석의 10-15 µ L을 사용 합니다. '높은 수익률' 프로브 '전형적인 프로브' 강도 기준으로 밴드 강도 따라 추가 교 잡 솔루션 샘플을 희석. 각 우물에서 대략 동일한 최종 프로브 농도를 목표로 합니다. 화살표 'RNA 프로브', 중 하나를 가리키는 각 차선에 더 높은 악대는 원래 DNA 템플렛 이다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
그림 3입니다. 주요 대규모 배아 수집 및 고정에 대 한 단계. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
그림 4입니다. 애벌레 또는 부동 조직에서 액체를 제거 하기 위한 수 제 튜브. 일부 애벌레와 성인 조직 고정 중 솔루션에서 부동. 나일론 메쉬 1 mL 팁으로는 흡 인기에 연결 하는 어댑터 뒤 끝을 잘라 200 µ L에 의해 개최이 간단한 도구에 의하여 이루어져 있다. 액체는 어떤 조직을 잃지 않고 안전 하 게 제거할 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
그림 5입니다. Tyramide 신호 증폭. (RNA 생 감각과 센스 RNA 프로브 1) 파기 표시 된 hybridizes. (Biotin 활용 된 1 차적인 항 체 발굴 UTP 사이 2) 면역-선호도 바인딩. (3) HRP streptavidin 바인딩 biotin 활용. (4) HRP catalyzes 단명 cyanine 3 tyramide 래 디 칼 형성 하 cyanine 3 tyramide와 과산화 수소 반응. (5) cyanine 3 tyramide 래 디 칼에 가까운 단백질 티로신 잔류물에 바인딩합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
그림 6입니다. 교 잡 이미지 대표 제자리에 . 각 패널 (녹청에 표시 된) 다른 RNA와 핵 DAPI (빨간색으로 표시)으로 물에의 한 예를 보여 줍니다. (A-C) 초기 초파리 배아의 예입니다. (D, F) 늦은 초파리 배아의 예입니다. (G-J) 예제 3의 탈피 초파리 애벌레 조직 (malphigian tubules, midgut, 침 샘과 근육 각각). (K) 성인 난소입니다. (L) 성인 고환입니다. 각 패널 조사를 교배 시키기 유전자의 이름을 표시 합니다. 스케일 바 = 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

이 절차의 전반적인 목적은 세포 및 조직 내에서 RNA 전사체를 제자리에서 검출하는 것입니다. 이 방법은 RNA가 세포, 조직 또는 배아 내의 어디에 위치하는지와 같이 세포 및 발생 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 방법들에 비해 낮은 비용으로 높은 해상도와 민감도를 통해 RNA의 공간적 분포를 검출할 수 있다는 점입니다.우리는 가능한 한 많은 초파리(Drosophila) RNA의 세포 내 분포를 연구하기 위해 이 프로토콜을 처음 개발했습니다. 이는 세포 내 분포의 범위와 다양성을 결정하기 위함이었습니다. 우리는 배아를 대상으로 프로젝트를 시작했으나, 이후 유충과 성체 파리에서 분리한 조직을 사용하여 고처리량(high throughput)으로 작업할 수 있도록 프로토콜을 수정하고 최적화했습니다.이 절차에서 가장 어려운 점은 단계가 많아 그에 따른 오류 발생 가능성이 크다는 점과 프로브 제작 과정에서 RNA가 없음을 보장해야 한다는 것입니다. 처리량과 비용 효율성을 높이기 위해, 이 비디오에서 시연하는 절차는 모든 단계에 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 사용합니다. 또한 플레이트를 8-웰 또는 12-웰 스트립으로 잘라 샘플 수가 적은 경우에 맞게 이 방법을 쉽게 조정할 수 있습니다.새 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 오토클레이브한 2중 증류수 90 µL와 하룻밤 동안 배양한 박테리아 배양액 10 µL를 넣어 희석하는 것으로 시작합니다. 서모사이클러를 사용하여 95 °C에서 5분 동안 DNA를 변성시킵니다. 그 즉시 플레이트를 얼음 위에 올려 최소 5분 동안 유지합니다.새로운 96-well PCR 플레이트에 PCR 반응액을 준비합니다. 적절한 범용 프라이머를 사용하고 각 웰에 PCR 마스터 믹스 48 µL를 분주합니다. 각 웰에 변성된 플라스미드 DNA 템플릿 2 µL를 첨가합니다.96-웰 PCR 기기에서 증폭을 수행합니다. 증폭이 완료되면 에탄올-아세트산나트륨 혼합물로 PCR 산물을 침전시킵니다. 샘플을 -80 °C에서 30분 동안 보관합니다.96-웰 플레이트를 4°C에서 2,250 ×g로 45~60분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 흡입할 때 팁이 웰 바닥에 닿지 않도록 설계된 8채널 진공 매니폴드 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 차가운 70% 에탄올 160 µL로 한 번 세척합니다.4°C에서 2,250 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 96-웰 플레이트를 종이 타월 위에 조심스럽게 뒤집어 각 웰의 남은 액체 방울을 제거하고, 실온에서 1시간 동안 DNA 펠렛을 자연 건조합니다. 침전된 DNA를 25 µL의 RNase-free water에 재현탁합니다.아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 산물의 크기와 수율을 확인합니다. 새로운 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 적절한 성분을 첨가하여 인비트로(in vitro) 전사 반응을 준비합니다. 각 해당 웰에 7.5 µL의 DNA 템플릿을 첨가합니다.플레이트를 밀봉 테이프로 덮습니다. 플레이트를 37 °C에서 3.5~4시간 동안 배양합니다. 다음으로, DEPC 처리된 2중 증류수, 100% ethanol 및 3 M sodium acetate로 구성된 마스터 믹스를 각 웰에 첨가합니다.-80°C에서 30분 동안 보관하십시오. 플레이트를 원심분리하고 이전에 설명한 대로 웰을 세척하십시오. 침전된 프로브를 25 µL의 DEPC 처리된 2중 증류수에 다시 현탁하십시오.새로 합성한 antisense RNA 프로브의 온전성과 수율을 확인하기 위해 1% agarose 겔 전기영동을 수행하였습니다. 밴드의 강도에 따라 수율을 저수율, 일반 수율 또는 고수율로 구분할 수 있습니다. 각 프로브 5 µL를 사용하여 agarose 겔 전기영동을 마친 후, 남은 20 µL를 hybridization solution 100 µL와 혼합하여 필요할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.이 절차를 시작하려면, 20~30마리의 유충을 fix one 용액이 포함된 차가운 PBS가 들어있는 페트리 접시에 넣고 얼음 위에서 2분 동안 냉각시켜 유충의 운동성을 감소시킵니다. 해부 현미경 아래에서 유충을 해부합니다. 날카로운 핀셋을 사용하여 앞부분을 조심스럽게 열고 후방에서 전방 방향으로 조직을 짜냅니다.최대 15분 후에 분리한 조직을 고정을 위해 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 얼음에 둡니다. PBS를 제거하고 800 microliters의 fix one solution을 추가합니다. 이전에 수집하여 고정 중인 다른 조직들과 함께 벤치탑 믹서에서 30분 동안 배양합니다.조직을 800 µL의 PBTT로 한 번 헹구고, 추가 조직을 수집하고 고정하는 동안 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 분리된 모든 조직을 뚜껑에 메쉬가 있는 단일 15 mL 플라스틱 튜브에 모으십시오. 뚜껑의 메쉬를 통해 과잉 액체를 흡입하여 제거하십시오.10 mL의 PBTT로 세척하고 10 mL의 PBS로 헹굽니다. 내인성 horseradish peroxidase 활성을 억제하기 위해, PBS에 희석한 0.3% hydrogen peroxide 5 mL를 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 10 mL의 PBTT로 2회 세척합니다.미리 냉각한 80% acetone 10 milliliters를 첨가하고 minus 20 degrees Celsius에서 10분 동안 배양하여 조직을 투과화합니다. 조직을 재수화하기 위해 10 milliliters의 PBTT로 2회 세척합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직을 세척한 후, hybridization solution에 넣어 minus 20 degrees Celsius에서 보관합니다.다음 날까지 사용하지 않을 경우, 필터 어셈블리를 일반 캡으로 교체해야 합니다. 얼음 위에서 96-well PCR 플레이트의 각 well에 조직 약 20 µL씩 분주합니다. 8채널 매니폴드 피펫을 사용하여 조직에서 하이브리드화 용액을 제거합니다.각 웰에 갓 변성시킨 하이브리디제이션 용액 100 µL를 넣고 밀봉 테이프로 덮습니다. 금속 비드가 포함된 드라이 배스 가열 장치를 사용하여 56 °C에서 조직을 최소 2.5~3시간 동안 사전 하이브리디제이션합니다. 준비된 프로브 100 µL를 96-웰 PCR 플레이트에서 80 °C로 5분 동안 변성시킵니다.즉시 얼음 위에서 5분 동안 냉각합니다. 조직에서 사전 혼성화 용액을 제거하고 각 시료에 변성된 유전자 특이 프로브를 추가합니다. 알루미늄 밀봉 테이프로 덮고, 드라이 배스 가열 장치 내에서 금속 비드 아래에 둔 상태로 56°C에서 16~18시간 동안 하룻밤 동안 혼성화합니다.프로브 검출 절차를 시작하기 전, 필요한 모든 용액을 56 °C 가열 장치에서 미리 가온합니다. 하이브리드화된 조직을 멀티웰 플레이트 진공 매니폴드에 맞는 96-well 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 이 플레이트의 웰은 하단이 멤브레인으로 되어 있어 진공 상태에서 내용물을 제거할 수 있습니다.96-웰 플레이트에서 프로브를 제거하고, 56 °C 가열 장치에서 이 표에 명시된 단계에 따라 하이브리다이제이션 용액과 PBTT 혼합물로 샘플을 세척합니다. PBTT로 세척을 3회 마친 후, 가열 장치에서 96-웰 플레이트를 꺼내 PBTT 용액을 제거하고, 실온의 벤치탑 믹서에서 PBTTB로 조직을 20분 동안 블로킹합니다. 각 웰에 100 µL의 항체 용액을 넣고 벤치탑 샘플 믹서에서 2시간 동안 인큐베이션합니다.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 PBTTB로 헹군 후, 웰당 100 microliters의 Streptavidin horse radish peroxidase 용액을 첨가하고 상온에서 1시간 30분 동안 배양합니다. PBTTB로 5분씩 2회 세척합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 DAPI 용액으로 조직을 배양합니다.샘플을 Tyramide 용액과 함께 배양하며 시작하고, 벤치탑 믹서 위에서 암실 상태로 2시간 동안 배양하십시오. 배양이 완료되면 조직에서 Tyramide 용액을 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PBT와 PBS로 세척한 후, 웰당 150 µL의 antifade 마운팅 매질을 추가하십시오.조직이 웰이나 튜브 바닥으로 가라앉을 수 있도록 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날, 샘플을 현미경 슬라이드에 마운팅하고 커버슬립으로 밀봉하십시오. 마지막으로, 형광 현미경을 사용하여 샘플의 이미지를 촬영하십시오.초기 Drosophila 배아와 amnioserosa, 근육 및 중추신경계에 신호가 나타난 후기 Drosophila 배아에 대해 이 절차를 사용하여 얻은 결과 예시가 제시되어 있습니다. 각 패널에는 프로브가 하이브리드화된 유전자의 이름이 표시되어 있습니다. 다음은 3령 유충 조직, malpighian tubules, 중장, 타액선 및 근육의 예시입니다.마지막으로, 성체 난소와 성체 정소의 대표 이미지가 제시되어 있습니다. 숙련되어 효율적으로 수행한다면, 이 기술은 이틀 만에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 RNase-free 벤치에서 RNase-free 팁, 튜브, 플레이트 및 용액을 사용하고 장갑을 착용하는 것이 중요함을 기억하십시오.많은 수의 샘플이나 프로브를 다루는 경우, 절차를 서둘러 진행하지 마십시오. 또한, 현재 단계를 잊지 않도록 자신만의 표시 방법을 마련하는 것이 좋습니다. 이 절차를 수행할 때, 다중 프로브 검출, 단백질 또는 세포 마커가 결합된 프로브 검출과 같은 다른 방법들과 병행하여 적용할 수 있습니다.이를 통해 상대적 발현 패턴, 세포 및 세포 내 구획의 정체, 그리고 서로 다른 유전적 배경이나 질병에서의 영향과 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 모든 유형의 조직이나 배아에서 대부분의 in situ hybridization을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 포름알데히드, 과산화수소, 포름아미드와 같은 시약을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 실험을 수행하는 동안 적절한 취급 및 폐기와 같은 주의 사항을 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.

high-resolution-fluorescent-situ-hybridization-drosophila-embryos

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를...

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

여기에서는 기존의 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 초고해상도 이미징을 달성하기 위해 초기 초파리 배아에서 확장 현미경을 구현하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초고해상도 이미징을 위해 확장 현미경을 사용하여 전체 마운트 초파리 배아를 물리적으로 확대

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

이 프로토콜은 초파리 흑개척 유충 시립엽에서 하이브리드화 연쇄 반응 형광 제자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 탐침 설계, 하이브리다이제이션, 증폭, 조직 장착 절차가 상세히 설명되어 발달 중인 시엽의 시각화를 용이하게 합니다.

발달 중인 초파리 시엽에서의 잡종화 연쇄 반응 FISH

배우세요 Drosophila 태아와 조직에서 높은 해상도 RNA 현위치 하이브리다이제이션 방법을 Tyramide 신호 증폭과 96웰 플레이트를 사용하여. 이 기법은 세포 및 발달 생물학 연구에 RNA 공간 분포를 저비용으로 정밀하게 검출합니다.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

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