새로운 박테리아 특정의 광학 검사 Confocal 레이저 Endomicroscopy에 의해 전 비보 인간의 폐 조직에 프로브

이 기술은 작은 분자 화학의 급속 한 식별에 대 한 fibered 공초점 형광 현미경 검사 법에 의해 인간의 폐 조직, ex vivo에서 박테리아 특정 광학 이미징 에이전트를 평가 하기 위한 효율적인 심사 과정을 설명 합니다. 프로브-번역 잠재력 후보자입니다.

이 광학 이미징 기술의 전반적인 목표는 인간 폐 내 이미징 감염을 위한 임상적 다루기 쉬움을 가질 수 있는 새로운 박테리아 특이적 광학 프로브를 신속하게 스크리닝할 수 있는 수단을 제공하는 것입니다. 이 방법은 새로운 광학 화합물이 표적에 특이적인지 여부 및 검출 가능한지 여부와 같은 분자 이미징 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 번역이 가능하다는 것입니다.

임상에서 사용할 수 있는 장비를 사용하여 유망한 이미징 프로브를 선택하면 프로브가 해당 환경에서 작동할 것이라는 확신을 얻을 수 있습니다. 이미징 직전에 드라이 아이스에 담아 냉동실에서 인간 폐 조직 샘플을 제거합니다. 실온에서 조직을 약간 해동시켜 메스로 1 x 4mm 섹션으로 자를 수 있도록 합니다.

집게를 사용하여 얇게 썬 인간 폐 조직을 96웰 투명하고 평평한 바닥 조직 배양 플레이트의 웰에 넣습니다. 사용하지 않은 인간의 폐 조직은 즉시 보관 용기에 넣고 드라이아이스에 담아 섭씨 영하 80도의 냉동고로 다시 운송합니다. 다음으로, 피펫으로 각 폐 조직 샘플에 100마이크로리터의 PBS를 추가하여 샘플에서 혈액을 씻어냅니다.

피펫 팁을 사용하여 모든 조직이 PBS로 덮여 있고 웰 벽에 달라붙지 않았는지 확인합니다. PBS를 분리하여 폐기합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 염색되지 않은 Calcein AM 표지 또는 테스트 프로브 표지 박테리아를 폐 조직이 포함된 각 웰에 피펫팅합니다.

또한 100마이크로리터의 PBS에 폐 조직으로 대조군을 설정합니다. 먼저 광섬유 클리너로 섬유 공초점 형광 현미경 이미징 광섬유 커넥터 장치를 청소합니다. 청소용 리본의 커넥터를 앞으로 문질러 먼지와 오물을 제거합니다.

레이저 스캐닝 장치 전면에서 노란색 보호용 캡을 제거합니다. 은색 허브가 멈출 때까지 시계 반대 방향으로 부드럽게 돌려 LSU 허브를 준비합니다. FCFM 이미징 파이버 커넥터를 위쪽을 향하도록 삽입합니다.

광섬유를 제자리에 잡고 두 번 딸깍 소리가 날 때까지 은색 허브를 시계 방향으로 돌립니다. 실버 허브를 시계 방향으로 45도 더 돌려 연결을 완료합니다. 그런 다음 FCFM 이미징 광섬유 보정을 완료하기 위해 팝업되는 지침을 따릅니다.

먼저 화면의 시작 레이저 버튼을 눌러 FCFM 이미징 파이버 테스트를 수행합니다. 레이저가 중앙에 위치합니다. 보정 키트에서 새 바이알을 선택하고 화면의 지시를 따릅니다.

FCFM 이미징 파이버의 말단부를 노란색 바이알에 넣고 모니터에서 형광이 증가하는지 확인합니다. 그런 다음 섬유 팁을 젓지 않고 빨간색 바이알에 넣습니다. 형광이 사라질 때까지 기다립니다.

마지막으로 파란색 바이알에 섬유 팁을 헹굽니다. 다음으로, FCFM 이미징 광섬유를 파란색 바이알에 배치하여 배경 획득을 수행합니다. start laser를 누른 다음 옵션이 되면 계산을 누릅니다.

마지막으로, FCFM 이미징 광섬유를 노란색 바이알에 넣어 광섬유 검출을 수행합니다. 다시 start laser를 누른 다음 calculate를 누릅니다. 자동 보정 중에 소프트웨어에 표시된 대로 빨간색 바이알에 10초 이상 넣은 다음 파란색 바이알에 4초 이상 넣어 FCFM 이미징 파이버의 말단부를 청소합니다.

데이터 수집을 시작하려면 화면에서 시작을 클릭하거나 왼쪽 페달을 밟아 레이저를 켭니다. 다음으로, 각 박테리아 현탁액 샘플을 이미지화합니다. FCFM 이미징 파이버의 말단부를 삽입하고 현탁액을 통해 파이버를 천천히 움직여 샘플을 조사합니다.

오른발 페달을 밟거나 광섬유가 샘플 주위를 천천히 이동할 때 화면의 녹화 컨트롤을 선택하여 길이에 관계없이 비디오를 녹화합니다. 8% 과산화수소로 FCFM 이미징 섬유의 말단부를 청소하고 샘플 사이의 렌즈 세척 조직을 청소합니다. 각 폐 조직 샘플을 이미지화하려면 FCFM 이미징 섬유의 말단부를 샘플에 삽입하여 섬유의 끝과 조직 사이의 직접적인 접촉이 이루어지도록 합니다.

그런 다음 이미징 파이버의 끝을 부드럽게 움직여 샘플을 조사합니다. 섬유의 끝을 조직에서 멀리 들어 올리면 초점면에서 조직이 제거됩니다. 그러나 이것은 조직에 부착되지 않은 표지된 박테리아를 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

오른발 페달을 밟거나 광섬유가 샘플 주위를 천천히 이동할 때 화면의 녹화 컨트롤을 선택하여 길이에 관계없이 비디오를 녹화합니다. 렌즈 세척 조직과 샘플 사이에 8%의 과산화수소로 FCFM 이미징 광섬유의 말단부를 청소합니다. 시스템을 끄려면 왼쪽 발 페달을 누르거나 화면의 버튼을 클릭하여 레이저를 끄십시오.

그런 다음 은색 LSU 허브가 멈출 때까지 시계 반대 방향으로 돌려 CLE 장치에서 FCFM 이미징 광섬유를 분리합니다. 그런 다음 LSU에서 광섬유 커넥터를 부드럽게 당겨 LSU 허브에서 FCFM 이미징 광섬유를 제거합니다. 보호 캡을 LSU 장치 전면에 있는 FCFM 이미징 광섬유의 근위 끝으로 되돌립니다.

8% 과산화수소와 렌즈 세척 티슈로 FCFM 이미징 광섬유를 세척하고 소독합니다. 마지막으로 섬유를 보관 상자에 부드럽게 넣습니다. 소프트웨어를 열고 소프트웨어 대시보드의 go to(다음으로 이동) 아이콘을 통해 컴퓨터에서 적절한 디렉토리를 선택하여 분석할 파일을 가져옵니다.

각 비디오 파일을 두 번 클릭하여 엽니다. 비디오는 최적화된 색상 조회 테이블과 함께 자동으로 재생되고 색상 테이블이 조정됩니다. intensity scale bar 위에 있는 지팡이 버튼을 클릭하여 자동 intensity scaling을 비활성화합니다.

버튼 주위에 검은색 음영이 없으면 기능이 비활성화됩니다. 최상의 대비를 제공하기 위해 최소 및 최대 막대를 이동하여 원하는 강도 배율을 선택합니다. 강도 스케일링을 선택할 때 히스토그램 도구를 사용하여 가장 넓은 다이나믹 레인지가 캡처되도록 합니다.

원하는 스케일링이 달성되면 기본 녹색으로 표시된 드롭다운 메뉴 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 룩업 테이블을 저장하는 옵션을 선택합니다. 조회 테이블을 원하는 위치에 저장합니다.

데이터 세트 내의 다른 비디오에 대해 기본 녹색 드롭다운 메뉴를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 조회 테이블 로드를 선택하여 동일한 조회 테이블을 적용합니다. 데이터 세트 내의 모든 비디오에 일관된 강도 배율을 적용하려면 적절한 파일을 선택합니다. 영화 릴 버튼을 클릭하여 처리된 비디오를 내보냅니다.

MPG 파일을 생성할 원하는 비디오 형식을 선택합니다. 그런 다음 내보내기를 누르고 비디오 파일을 저장할 파일 위치를 선택합니다. 레이블이 지정된 박테리아는 비디오에서 녹색으로 깜박이는 점으로 시각화됩니다.

폐 조직 구조는 치조 공간이 검은색으로 보이는 정렬된 형광 가닥으로 분명합니다. 표지되지 않은 포도상구균 박테리아는 FCFM으로 이미징할 때 형광을 발하지 않으며, 이는 광학 이미징 화합물에 대한 요구 사항을 보여줍니다. 스크리닝을 거치는 형광 화합물에 의해 성공적으로 표지된 포도상구균은 FCFM으로 이미징할 때 볼 수 있습니다.

그림은 성공적으로 라벨링된 포도상구균을 보여줍니다. 인간의 폐 조직은 488나노미터에서 자동 형광을 발합니다. 이 비디오는 FCFM으로 촬영한 인간의 폐 조직을 보여줍니다.

표지되지 않은 황색포도상구균(Staph aureus)을 조직에 첨가하였다. 그들은 볼 수 없습니다. 그러나 성공적으로 표지된 박테리아는 FCFM 이미징을 통해 인간의 폐 조직 배경에서 작고 반짝이는 반점 점으로 볼 수 있습니다.

이 기술을 마스터하면 샘플 수에 따라 10분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 설정 보정을 수행할 때와 샘플 이미징 사이에 광섬유를 철저히 청소해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생물학적 샘플 이미징을 위해 FCFM 장치를 설정하는 방법과 캡처된 데이터를 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차에 따라 CFU 도금과 같은 다른 방법을 수행하여 박테리아 세포 수 및 라벨링 후 생존력 결정과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 인체 조직 및 병원성 박테리아로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.