2017년 8월 26일
Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.
안녕하세요, 제 이름은 Christian Deffge입니다. 저는 마그데부르크에 있는 대학병원의 의사이며, 헤롤드 박사와 브라운 둘레우스 교수의 심혈관 연구 그룹에서 일하고 있습니다. 우리는 담보 성장의 증대를 조사합니다.
따라서 우리는 이미징을 사용합니다. 이 비디오에서는 방법을 설명하고자 합니다. 무혈청 배양 배지에서 1 곱하기 10에서 밀리리터당 6번째 세포의 밀도로 세포를 재현탁합니다.
1 밀리몰 DIO와 디메틸포름아미드 5 마이크로리터를 1 밀리리터의 세포 현탁액에 첨가하고 조심스럽게 재현탁합니다. 세포 용액을 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 500g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
상층액을 제거하고 섭씨 37도의 따뜻한 FCS 보충 배지로 세포를 재현탁합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. Neubauer 계수 챔버와 광학 현미경을 사용하여 세포를 계수합니다.
염화나트륨 용액으로 세포를 재현탁시킵니다. 꼬리 정맥에 세포를 주입합니다. Matrigel matrix는 편평 육종에서 추출한 재구성된 기저막 제제입니다.
혈관신생 억제를 통한 내피 세포 네트워크 형성 또는 항암 요법을 위해 테스트 분자를 스크리닝합니다. 세포 치료에 사용하고자 하는 단핵구의 종양 혈관형성 가능성을 재평가합니다. 멸균 상태에서 100나노그램 BFGF, 300나노그램 VEGFA 및 26개의 국제 단위 헤파린을 Matrigel에 추가합니다.
용액을 와류로 만든 후 1밀리리터 인슐린 주사기에 채우고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. 피하 Matrigel 플라크를 더 잘 보려면 주사 부위에서 마우스의 피부를 면도합니다. 날카로운 메스나 제모 크림을 사용할 수 있습니다.
동물을 테이블 위에 놓고 옆구리의 주사 부위 옆에 마우스의 피부를 잡습니다. 500마이크로리터의 마트리겔을 피하로 주사합니다. 실용적인 이유로, 피하 분산을 피하기 위해 Matrigel을 한 곳에 조밀하게 주입해야 합니다.
실험이 끝날 때 마우스를 희생한 후 조직에서 Matrigel 매트릭스를 제거하는 것이 더 쉬울 것입니다. 실험 전에 염화나트륨 용액으로 단핵구 주입을 연습하십시오. 단핵구를 전신으로 적용할 수 없는 경우 전신 효과는 없습니다.
이 프로토콜 내에서 250만 개의 단핵구를 주입했습니다. 그램당 5마이크로리터 이하로 주입하십시오. 전체 절차를 수행하는 동안 가열 패드를 사용하여 마우스가 예열되었는지 확인하십시오.
세포의 전신 적용을 위해서는 억제제와 1밀리리터 인슐린 주사기, 30g 바늘, 단핵구 재현탁액 및 염화나트륨 용액이 필요합니다. 마우스를 조심스럽게 다루고 동물을 구속기에 구속하십시오. 마우스가 다치지 않았는지, 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.
꼬리가 플레이트에 닿을 수 있도록 가열 패드에 고정장치를 놓습니다. 감염을 방지하기 위해 주사 부위를 소독하십시오. 꼬리의 측면에 위치한 꼬리 정맥을 식별합니다.
꼬리를 90도 돌려 꼬리 정맥이 꼬리의 위쪽에 나타나도록 합니다. 단핵구 용액을 평평한 각도로 주입해 보십시오. 전신 부작용을 찾기 위해 30분 동안 동물을 관찰합니다.
동물이 완전히 회복된 후 쥐를 우리에 넣습니다. 마취된 마우스를 예열된 현미경 s에 놓습니다.tage 현미경이 안정적인 조건에 도달하고 더미에 의해 설정을 테스트한 후. 접착 테이프로 발을 고정하십시오.
현미경 검사에 사용되는 다리 또는 옆구리 부위의 피부를 소독합니다. 더 나은 취급과 모발에 대한 간섭을 피하기 위해 관심 영역을 면도하십시오. 관심 영역을 촉촉하게 유지하십시오.
그렇지 않으면 이미지와 조직의 품질이 저하됩니다. 조정 가능한 두 줄기 사이에 다리를 놓습니다. 줄기 위에 커버 유리를 놓습니다.
현미경 검사를 시작하고 필요한 경우 다리의 위치를 조정합니다. 현미경 설정은 사용하는 소프트웨어에 따라 다릅니다. 자세한 내용은 프로토콜을 참조하십시오.
당사의 데이터는 생체 내 현미경 검사가 소동물 모델의 혈류 내에서 이식된 단핵구를 시각화하기 위한 강력한 도구임을 보여줍니다. 단핵구는 전신 효과를 유지하고 동맥계에서 주사를 수행할 경우 발생할 수 있는 색전을 방지하기 위해 정맥계에 주입해야 합니다. Matrigel을 사용하는 경우 분산을 피하기 위해 천천히 주입하면 추가 조직학적 검사를 위한 플라그 삽입에 도움이 됩니다.
Matrigel 플라크 내에서는 다양한 실험 환경 내에서 모세혈관을 계수하여 혈관형성을 측정할 수 있습니다. 생체 내 현미경 검사 결과는 조직학적 검사로 확인할 수 있습니다. 우리는 모든 조직 절편에서 생체 내 현미경 검사로 감지된 단핵구를 찾을 수 있습니다.
이미지를 획득하는 데 많은 시간이 필요한 경우, 혈관 내 로다민 덱스트란의 양이 감소합니다. 혈관의 더 나은 가시성을 위해 로다민 덱스트란의 적용을 반복해야 합니다. Matrigel의 세포에 포지티브 프로브를 사용하면 최적의 설정을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
말초 동맥 질환 또는 허혈성 심장 질환 치료제의 목표는 혈역학적 협착증으로 인한 다른 관류 부위로의 혈류를 증가시키는 것입니다. 측부 형성 자극을 통한 단핵구 강화 관류를 통한 세포 요법은 수술 적응증이 없는 환자를 위한 비침습적 옵션입니다. 허혈성 부위의 측부 동맥 발달 외에도 단핵구는 종양의 성장에도 영향을 미칠 수 있습니다.
이러한 과정을 조사하기 위해 당사는 생체 내 현미경 검사와 함께 Matrigel 주입을 사용합니다. 이 프로토콜의 목표는 in vivo 모델에서 허혈로 인한 면역학적 과정을 연구하는 쉽고 효율적인 방법을 보여주는 것입니다. 이 새로운 방법을 통해 사후 근육 조직의 조직학적 정밀 검사에 비해 보다 현실적인 테스트 환경을 생성할 수 있습니다.
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본 연구는 말초 동맥 질환과 관련된 동맥신생에 있어 단핵구의 역할을 조사합니다. 기저막과 유사한 매트릭스와 생체 내 현미경을 사용하여, 대퇴동맥 결찰의 쥐 모델에서 단핵구 주입 후 단핵구 정착 및 종양 관련 혈관신생에 초점을 맞추고 있습니다.
Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in murine peripheral arterial disease models enables real-time visualization of cellular mechanisms underlying arteriogenesis and vascular remodeling. This approach provides predictive confidence for target validation in cell-based therapies and informs early-stage portfolio decisions for vascular and oncology indications. The method bridges the gap between static histological analysis and dynamic in vivo assessment, supporting translational continuity in preclinical research.
This intravital microscopy workflow integrates from early discovery through preclinical validation, supporting lead identification and mechanistic studies in vascular and oncology research.