Name: Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 배우세요 생체 내 현미경법을 사용하여 쥐 모델에서 단핵구 유도 및 혈관신생을 연구하는 방법을. 이 기술은 말초동맥질환 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 ELSE Kröner 재단에 의해 지원 되었다 그리고 DFG (도이치 가운데, 독일 연구 재단) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, 공동 연구 센터). 특별 기술 지원에 대 한 한스-홀거 Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, 오토 폰 Guericke 대학 마그데부르크, 마그데부르크, 독일, 감사 합니다.

우리의 연구 동물 보호에 대 한 독일 법의 섹션 8에 따라 작센-안할트, Landesverwaltungsamt 할리 상태의 권한으로 수행 되었다. (§ 8, 18.05.2016-BGBI에서에서 동물 보호에 대 한 독일 법의 단락 1. 나 S. 1206, 1313, 13.08.2013에서 § 31 TierSchVersV).
 참고: 여기 실험에 대 한 8 12 주 오래 된 남성 BALB/c 마우스 사용 되었다, 및 혈액 기증자 로부터 인간 monocytes intravital 현미경 검사 법을 통해 monocytes의 시각화를 위해 사용 되었다.
 1. 셀 준비 참고: monocytes의 격리를 참조 하십시오 우리의 이전 게시 된 비디오 정돈에 지침에 대 한: &#34; 절연 및 정 맥 주입의 Murine 골 파생 Monocytes &#34; 바그너 외. 여 4 참고: 때 셀 모든 단계 작업 것이 오염을 피하기 위하여 살 균 되어야 합니다.
<ol><li>셀 3, 3으로 얼룩 &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염 <ol><li>Resuspend 1 x 10 6 셀/mL의 농도와 혈 청 무료 문화 매체에 셀. 
		참고:만 혈 청 자유로운 매체 수는 효율적인 얼룩, 닥터지 염료 이미 혈 청의 질 성 구성 요소에 의해 캡처 그렇지 않으면 것 때문.</li>
		<li>1 m m 3, 3의 추가 5 µ L &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염 dimethylformamide 셀 서 스 펜 션의 1 ml에 신중 하 게 resuspend와.</li>
		<li>품 20 분 동안 37 ° C에서 셀 솔루션</li>
		<li>37 ° C에서 5 분에 대 한 500 x g 세포를 원심</li>
		<li>는 상쾌한을 꺼내 려 하 고 37 ° C 따뜻한 태아 종 아리 보충 하는 혈 청 매체와 셀 resuspend.</li>
		<li>1.1.4와 1.1.5 단계를 반복 하 여 두 번.</li>
		<li>수식 가진 셀의 개수: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg" /></li> <li>150 µ L 살 균 0.9 %NaCl 용액으로 세포를 resuspend.</li>
		<li>꼬리 정 맥에 주입 셀.</li>
	</ol></li></ol> 2. 마 취 <ol><li>흡입 마 취 <ol><li>isoflurane 화학 안전 후드 닫힌된 빈에 5%의 농도 사용 하 여 기화 기의 도움으로 증발.</li>
		<li>마우스를 신중 하 게 처리 하 고 빈에 넣어.</li>
		<li>이동 중지 되었습니다 후 후부 목의 피부에 의해 동물 처리.</li>
	</ol></li> <li>복 마 취 참고: 사용 isoflurane 마 취, 단계 2.1, 복 주사를 수행 하려면 아래 설명 된. 빠른 복구와 isoflurane 마 취의 짧은 연기 마약 효과, 마우스를 처리 하 여 복 마 취 주사 쉽습니다.
	<ol><li>2.4 mL 마 취 제 (10%), 0.8 mL Xylazine (2%), 및 6.8 mL NaCl (0.9%)의 솔루션을 사용 하 여 복 주입을 위해.</li>
		<li>무게 동물 마 취 제를 적용 하기 전에. 
		참고: 마 취에 대 한 공식 이다: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg" /></li> <li>30g 바늘 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 왼쪽된 하복 부에 주입 솔루션.</li>
		<li>마우스의 장에 놓고 마약 효과 기다립니다. 
		참고: 마약 효과 일반적으로 나타납니다 5 분 이내 주사 된 경우. 마 취의 정확한 깊이 뚜껑 반사 또는 발가락을 꼬집어, 반응 없는 호흡의 일반, 제어 속도 의해 결정 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 3. 지하실 막 같은 매트릭스의 주입 참고:이 메서드는 monocyte 주입 후 종양 혈관 신생 연구 우리의 그룹에 의해 사용 됩니다. 실험에 따라 성장 요인 지하실 막 같은 매트릭스를 추가할 수 있습니다. 우리는 마우스의 측면에서 종양을 주입 하기 전에 대 퇴 동맥 결 찰을 수행. 매트릭스는 주입을 위해 4 ° C의 온도가지고 있어야 합니다. 이 온도에, 행렬은 액체; 젤은 체온 (37 ° C)에 고체를 견고 하 게. 피하 매트릭스의 더 나은 시정을 위한 플러그, 사출 사이트에서 마우스의 피부를 면도.
 참고: 옵션: 추가 100 ng 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 300 ng 혈관 내 피 성장 인자, 및 지하실 막 같은 매트릭스를 무 균 조건 하에서 26 I.U. 덤플링을.
<ol><li>30 G 인슐린 주사기를 얼음에 저장소 사용까지 매트릭스의 1 mL 로드.</li>
	<li>동물 테이블에 누워 누르고 있으면 마우스의 피부 측면에 주사 부 옆.</li>
	<li>지하실 막 같은 매트릭스의 500 µ L를 피하 주사. 
	주: 실제적인 이유를 위해 그것은 피하 분산을 피하기 위해 한 위치에서 조밀 하 게 지하실 막 같은 매트릭스를 삽입 하는 데 필요한. 실험의 끝에 마우스를 희생 후 조직에서 인공 종양을 꺼내 려 하는 것이 쉬울 것 이다.</li>
</ol> 4. 정 맥 주입 꼬리 참고: 꼬리 정 맥 주입 실험 하기 전에 시험 동물에 NaCl 솔루션 연습. Monocytes는 적절 하 게 꼬리 정 맥에 주입 수 없습니다, 아무 조직의 효과 담보에 있을 것입니다. 이 프로토콜에서 2.5 백만 monocytes 주입 하 고. Bodyweight의 더 이상 5 µ L/g를 주사 하려고.
<ol><li>준비 단계 1.1.8 2.5 백만 monocytes를 포함 하는 monocyte 솔루션을 사용 하 여.</li>
	<li>30g 바늘과 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 주입을 위해.</li>
	<li>신중 하 게 마우스를 처리, restrainer에서 동물을 제 지 하 고 마우스 감염 되지 및 호흡에 대 한 충분 한 공간이 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>꼬리 접시에 게 연락할 수 있도록 난방 패드는 restrainer 넣어.</li>
	<li>꼬리 정 맥, 꼬리의 측면에 있는 식별.</li>
	<li>90 °, 꼬리 꼬리 정 맥 꼬리의 위 부분에 나타나도록 설정.</li>
	<li>주입 사이드는 monocytes를 주입 하기 전에 소독.</li>
	<li>세를 직면 하는 바늘의 경사와 평면 각도에 monocyte 솔루션을 주입 하려고 
	참고: 중지 주사 물집이 나타나면 이것이 실패 한 주입의 징조. 절차를 다시 시도 더 proximally.</li>
	<li>주사 사이트에서 약 60에 대 한 꼬리에 부드러운 압력을 적용 하 여 출혈을 멈추게.</li>
	<li>을 조직의 부작용에 대 한 모니터링 마우스 그것의 감 금에 있는 동물에는 완 치 후 30 분 동안 동물 관찰.</li>
</ol> 5. Intravital 현미경 <ol><li>준비 <ol><li>접착 테이프를 가진 일정 한 온도 유지 하 고 자리에는 발을 해결을 열 패드 (37 ° C)에 마 취 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>다리 또는 현미경에 사용 되는 측면의 사이트에서 피부를 소독.</li>
		<li>머리 간섭을 유발 하지 않도록 더 나은 처리에 대 한 관심의 영역을 면도.</li>
		<li>삭제할 살 균 메스와 0.5 x 0.5 cm의 사각형 영역에 미세 집게 피부. 
		참고: 그것은 촉촉한; 관심 영역을 유지 하는 것이 중요 그렇지 않으면, 이미지와 조직의 품질 손상 될 것 이다. NaCl 솔루션 영역을 축 축 하 게 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>두 조정 가능한 우표 사이 다리를 놓고 우표 위에 커버 글라스를 위치.</li>
		<li>조직과 젖어 유리 접촉 확인.</li>
		<li>Inj혈관의 더 나은 시정을 위한 정 맥 체계로 요법 50 µ L rhodamine dextran retrobulbar.</li>
		<li>현미경 검사 법을 시작 하 고 필요한 경우 다리의 위치를 조정.</li>
	</ol></li> <li>Intravital 현미경 설정 <ol><li>현미경, 컴퓨터, 전자 인터페이스와 레이저.</li>
		<li>보육 실의 난방 단위 설정 또는 난방 (플레이트/패드), 무대 설정 온도 37 ° c.</li>
		<li>수집 소프트웨어를 시작합니다. 현미경 공명 스캐너를 갖춘 경우이 빠른 스캐닝 모드 선택.</li>
		<li>온도가 일정 수준 (35-37 ° C) 도달할 때까지 기다렸다가 
		참고: 안정 온도 대 한 중요 하다: (a) 마우스, 마 취의 밑에 그것의 온도, 및 (b) 피하 또는 적어도 최소화 초점 드리프트를 제어할 수 없습니다. 이 주변 조건 (예를 들어, 에어컨 시스템 및 사람들을 포함 한 방에 열원 수)에 따라 몇 시간 1 시간을 걸릴 수 있습니다. 침수 목적 사용 하는 경우 렌즈와 커버 유리 (또는 조직) 사이의 접촉 영역 불안정의 전형적인 소스입니다. 렌즈는 객관적인 히터 난방 도움이 될 수 있습니다; 또는, 자동 초점 시스템 현미경 좋습니다.</li>
		<li>실험의 확인 요구 사항을 충족 높은 숫자 조리개와 확대 렌즈 선택 (이 섹션의 끝에 참고).</li>
		<li>이득, 채널 설정, 검사 속도, 픽셀 해상도, 깊이 볼륨, 스텝 크기 및 단계에 실험 동물을 배치 하기 전에 평균 현미경 설정을 최적화.</li>
		<li>수집 시간을 줄이기 위해 양방향으로 스캔.</li>
		<li>현미경에는 안정적인 상태에 도달 했습니다 및 설정을 dummy의 도움으로 테스트 후 마 취 마우스 prewarmed 현미경 스테이지에 배치.</li>
		<li>관심 영역 지하실 막 같은 매트릭스 내의 초점으로 밝은 빛 조명 사용 하 여 가져오고 간단히 적용된 fluorophores에 대 한 적절 한 필터 설정으로 자외선에 의해 모 세관 검사.</li>
		<li>스캐닝 모드; 전환 낮은 해상도 256 x 256 모드에서 검색을 시작 하 고 이득을 강화 하 고 레이저 출력 신호 모니터에 관찰 때까지.</li>
		<li>관심의 구조에 초점입니다. 모든 세부 사항을 볼 수 있습니다 때까지 확대.</li>
		<li>정의 &#34; 시작 &#34; 및 &#34; 끝 &#34; 축 방향에 위치.</li>
		<li>검색 중지.</li>
		<li>스테핑 크기 (예를 들어, 0.5 µ m) 및 초점 비행기 (예를 들어, 10-20)의 수 정의.</li>
		<li>스위치 이동 subcellular 구조 또는 셀 선택 검사의 속도 따라 최종 픽셀 해상도 (512 x 512 또는 1024 x 1024) 속도 (스캔 주파수) 움직임에 가장 맞는. 스택의 인수를 고정 권장 양방향 검색. 
		참고: 충분 한 이미지 품질을 제공 하는 검색의 높은 스캔 속도 선택 합니다. 전형적인 포인트 스캐너 400 Hz 및 1.4 kHz 사이 속도 제공합니다. 공 진 스캐너 추가 8 kHz 또는 12 kHz를 제공합니다. Y-방향으로 줄 수를 줄이면, 스캔 속도 증가 될 수 있다 추가 (일반적인 값은 512 x 512, 512 x 256 또는 512 x 200 픽셀 해상도). 신호 대 잡음 비율에 따라 하나 2와 4 사이 평균 라인을 추가 하 여 이미지 품질을 개선 하기 위해 시도할 수 있습니다. 일반적으로, 8 KHz 공명 스캐너; 양방향 모드에서 18 ms의 인수 시간/프레임에 결과 없이 평균 512 x 200의 설정 512 x 200과 x 평균 4 프레임 당 56 ms 아래로 느려집니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , 
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<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
<li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기 설명 하는 방법을 부수적인 동맥의 개발이이 선박에 monocytes의 동작 및 arteriogenesis의 과정에 빛이 나. 이 프로토콜을 적용 하기 위한 단계는 쉽게 학습과 과학의 다른 분야에서 사용 될 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구 하 고 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어, 현미경 장비 설명된 기법을 실행 해야 합니다. 한 실험에 대 한 장비를 얻는 하는 것은 장치를 공유 하는 다른 기관과 협력 하는 것이 중요 하다 그래서 지속 가능한, 하지입니다.
다른 어려움 연습 피할 수 있는이 프로토콜 연결을 확인 하 고 있습니다. 처음에는, 현미경, 마우스 위치에 대 한 문제가 있을 수 있습니다 그리고 이미지 품질은 이러한 상황에서 고통을 수 있습니다. 또 다른 중요 한 점은 꼬리 정 맥 주입입니다. Monocytes 제대로 주입 하는 경우는 혈관에 볼 수만 있습니다. 따라서, 그것은 마우스를 위치 하기 전에 주사를 실행 하는 것이 좋습니다.
<p class="jov...

심혈 관 질환, 관상 동맥 심장 질환 또는 말 초 동맥 질환을 포함 하 여 죽음의 가장 일반적인 원인은 세계적으로1. 세포 치료 외과 중재를 받을 수 없는 사람들을 위해 특히 심혈 관 질환을 치료 하는 유망한 접근 이다. 치료 도구2,3는 관류를 개선 하 고 허 혈 성 및 underperfused 조직의 기능을 유지 하는 전반적인 목표와 셀 또는 그들의 secreted를 사용 하 여 여러 접근이 있다. 이 목표를 달성 하기 위해 한 시도 arteriogenesis, 부수적인 동맥의 개발을 향상을 향상 시킬 것입니다. Monocytes는 담보와 관련 한 중요 한 세포 유형입니다. 우리의 그룹 허 혈 및 후속 염증6유도 hindlimb 허 혈 모델을 사용 하 여 특히 염증4,5의 분야에서 monocytes의 효과 연구에 집중 했다. Monocytes 염증의 지역를 담보7의 개발을 이끌어 내는 복잡 한 조직 반응 일으킬 합니다.
Intravital 현미경 검사 법의 사용, 우리는 이러한 세포에 vivo에서 의 동작을 연구 하 고 염증의 지역에 주입된 monocytes의 추적 관찰 수 있습니다. 대부분의 이전 연구는만 사후 분석, 조직학 아티팩트 및 준비에 필요한 동물의 많은 수의 소개를 포함 하 여 단점을 보유 하 고 있는 설명 합니다. 우리의 접근, 우리 면역 프로세스를 조사할 수와 여러 시간 점에서 통해 부수적인 형성 라이브 이미징.
부수적인 동맥 허 혈 성 지역에서의 개발 이외 monocytes는 또한 종양의 성장 영향. 이러한 프로세스를 조사, 우리 Engelbreth-Holm-떼 마우스 육 종, 종양 세포 외 기질 단백질8, 풍부한에서 추출한 지하실 막 같은 매트릭스를 주사 하 고 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석. 이 행렬은 내 피 세포 네트워크 형성 또는 신생 억제;을 통해 항 암 치료에 대 한 스크린 테스트 분자에 사용 이 경우에, 우리는 세포 치료9,,1011monocytes의 종양 신생 잠재력을 평가할 것입니다.
이 프로토콜의 목표는 vivo에서 모델에서 허 혈에 의해 발생 하는 면역 과정을 공부 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 보여 줍니다. 우리는 사후 근육 조직의 조직학 검사 결과에 비해 더 현실적인 테스트 환경을 생성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10% 태아 송아지 세럼 (FCS)</td> <td>Sigma Aldrich, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 페니실린/스트렙토마이신</td><td>Sigma Aldrich, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL Omnifix -F 인슐린 주사기</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 주사기&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany</td><td></td><td>Injectomat- 주사기 50 ml with canule</td></tr><tr><td>6-well-ultra-low-attachement-plates</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8- 12 주, 수컷, C57BL/6, BalbC 마우스&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>접착 테이프</td><td>TESA SE, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition Software</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); 버전: 2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td>29G, 30G</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 배지</td><td>단일 성분</td><td></td><td>Medium199, 10% 태아 송아지 혈청, 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, 독일</td><td></td><td>Allegra X-15R 원심 분리기</td></tr><tr><td>탈모 크림</td><td>Veet, Mannheim, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen Eugene, Oregon, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소독제</td><td>Sch &uuml; LKE& Mayr GmbH, 노르더슈테트, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스 No.10&nbsp;</td><td>깃털 안전 면도기 Co.Ltd, 오사카, 일본&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer 플라스크</td><td>GVB, Herzogenrath, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>시그마 Aldrich, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Rubis, Stabio, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>Katalognummer: D-1819</td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>히팅 패드&nbsp;</td><td>라보텍트 GmbH, G&ouml; 팅겐, 독일&nbsp;</td><td></td><td>핫 플레이트 062</td></tr><tr><td>인간 대식세포 콜로니 자극 인자</td><td>Sigma Aldrich, 함부르크, 독일</td><td>SRP3110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인도적인 백혈구 필터</td><td>혈액 보존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; Heim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>케타민 (10%)</td><td>Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leukocyte separation tubes (필터가 있는 튜브)&nbsp;</td><td>Bio one GmbH, 프리켄하우젠, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany</td><td></td><td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>림프구 분리 매체 LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미디엄 M199&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbiological work bench</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터와 가열 장치가 있는 현미경 스탠드</td><td>&nbsp; Leica DMI 6000, Pecon, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monocyte wash buffer</td><td>우리 그룹에서 제조하였으며, 단일 구성 요소</td><td></td><td>PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA</td></tr><tr><td>마우스 억제</td>기 <td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>다광자 현미경으로</td> 제조되었습니다.<td>라이카, 베츨라, 독일&nbsp;</td><td></td><td>라이카 SP5 컨포칼 현미경, 카멜레온, 코히런트</td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>Berlin Chemie AG, 베를린, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber&nbsp;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, 다름슈타트, 독일</td><td></td><td>ph 7,4 sterile</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>단일 성분</td><td></td><td>90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, &rho;= 1,064 g cm-3</td></tr><tr><td>Percoll 솔루션</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, 웁살라, 스웨덴</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td></td><td>10&micro; L/100&마이크로; L/200&마이크로; L/1000&마이크로; L</td></tr><tr><td>Pipettes serological</td><td>Greiner Bio-One GmbH, 프리켄하우젠, 독일</td><td></td><td>&nbsp; Cellstar2ml, 5ml, 10ml</td></tr><tr><td>피펫팅 헤드</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리스티롤 튜브</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, 프리켄하우젠, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gie&szlig; en, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡입 장치</td><td>Integra bioscience, Fernwald, 독일</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>캡이 있는 튜브</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>15ml, 50ml Cellstar</td></tr><tr><td>자일라진 (2 %)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH, D&uuml; sseldorf, 독일</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital 현미경 monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 murine 모델에서 종양 관련 신생의

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

주변 동맥 질환과 허 혈 성 심장 질환에 대 한 치료 목표 hemodynamic 협 착 증으로 인 한 허 혈 성 영역에 혈액 흐름을 증가 하는. 혈관 수술은 가능한 옵션을 선택한 경우에만 통증, 중요 한 사지 허 혈, 또는 생활에 주요 중단 휴식 또는 작업 진행 등 수술을 위한 표시 없이 환자에 대 한, 그들의 질병을 완화 하기 위해 몇 가지 가능성이 있다. 부수적인 형성의 자극을 통해 관류 monocyte 강화 통해 세포 치료 비-침략 적 몇 가지 옵션 중 하나입니다.
우리의 그룹 hindlimb 허 혈 모델을 사용 하 여 마우스에 monocyte 이식 후 arteriogenesis을 검사 합니다. 이전에 우리 hindlimb 관류 syngeneic monocyte 파상풍 자극이 식을 사용 하 여 향상을 증명 하고있다. 부수적인 형성에 효과 뿐만 아니라 종양의 성장 뿐만 아니라이 치료에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 효과 조사, 우리 후 대 퇴 동맥의 폐색, 마우스의 측면에 Engelbreth-Holm-떼 육의 기질을 주입 하 여 지하실 막 같은 매트릭스 마우스 모델을 사용 합니다.
인공 종양 연구 후 우리를 vivo에서 종양-신생 및 부수적인 동맥 내에서 귀환 하는 monocyte intravital 현미경 검사 법을 사용. 이전 연구는 사후 아티팩트에 후속 분석을 전제로 동물 모델의 조직학 검사를 설명 했습니다. 우리의 접근 지역 실시간으로 시퀀스에서 담보의 monocyte 유도 시각화, 수행, 쉽게 arteriogenesis 및 종양 혈관 신생 비보의 과정을 조사 하 고.

Intravital 현미경 종양 성장과 부수적인 선박 monocytes에 의해 실행의 시험에 대 한 종양 혈관 신생 및 arteriogenesis의 분자 메커니즘에 새로운 측면을 보여줄 수 있습니다. 셀 준비 되어야 하 고 신중 하 게 프로토콜의 단계를 사용 하 여 주입. 차이 단일 실험 사이 변이 발생할 수 있습니다. 정 맥 시스템 (그림 1) 조직의 효과 유지 하 고 주입 동맥 시스템에서 실시 하는 경우 발생할 수 있는 혈을 방지 하는 monocytes는 주입 해야 합니다.
지하실 막 같은 매트릭스를 사용 하는 경우 분산을 피하기 위해 천천히 주입 플러그 explantation 추가 조직학 검사에 대 한 도움이 될 것입니다 (그림 2, </...

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

안녕하세요, 제 이름은 Christian Deffge입니다. 저는 마그데부르크 대학 병원의 의사이며, Dr. Herold와 Professor Braun-Dullaeus의 심혈관 연구팀에서 근무하고 있습니다. 저희는 측부 순환 성장 촉진에 대해 연구하고 있습니다.따라서, 저희는 이미징 기법을 사용합니다. 본 영상에서는 해당 방법론에 대해 설명하고자 합니다. 세포를 1 × 10⁶ cells/mL 밀도의 무혈청 배지에 재현탁하십시오.1 mM DIO와 dimethylformamide 5 µL를 1 mL의 세포 현탁액에 첨가하고 조심스럽게 재현탁합니다. 세포 용액을 37 °C에서 20분 동안 배양합니다. 세포를 500 g에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 37 °C로 데운 FCS 보충 배지로 세포를 재부유시킵니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. Neubauer counting chamber와 광학 현미경을 사용하여 세포 수를 측정합니다.염화나트륨 용액으로 세포를 재부유시킵니다. 세포를 꼬리 정맥에 주입합니다. Matrigel 매트릭스는 편평 세포 육종에서 추출하여 재구성한 기저막 제제입니다.이 방법은 혈관내피세포 네트워크 형성 또는 혈관신생 억제를 통한 항암 치료제에 대해 테스트 분자를 스크리닝합니다. 세포 치료에 사용하고자 하는 단핵구의 종양 혈관신생 잠재력을 재평가합니다. 멸균 조건 하에서 Matrigel에 100 nanogram BFGF, 300 nanogram VEGFA 및 26 international units heparin을 첨가합니다.용액을 볼텍싱한 후, 1 mL 인슐린 주사기에 채워 사용 전까지 얼음에 보관하십시오. 피하 Matrigel 플라크의 가시성을 높이기 위해, 주사 부위의 마우스 피부를 제모하십시오. 날카로운 메스나 제모 크림을 사용할 수 있습니다.동물을 테이블 위에 눕히고 옆구리의 주사 부위 옆에 있는 마우스의 피부를 잡습니다. Matrigel 500 µL를 피하 주사합니다. 실제 수행 시, 피하 확산을 방지하기 위해 Matrigel을 한 곳에 응축하여 주사하는 것이 필요합니다.실험 종료 후 마우스를 희생시킨 다음에 조직에서 Matrigel 매트릭스를 제거하는 것이 더 쉽습니다. 실험 전에 염화나트륨 용액으로 단핵구 주입을 연습하십시오. 단핵구가 전신적으로 투여되지 않으면 전신 효과가 나타나지 않습니다.본 프로토콜에서는 250만 개의 단핵구를 주입하였습니다. g당 5 µL 이하로 주입하십시오. 전체 과정 동안 히팅 패드를 사용하여 마우스의 체온을 유지하시기 바랍니다.세포의 전신 투여를 위해서는 보정기, 1 mL 인슐린 주사기, 30 g 바늘, 그리고 염화나트륨 용액에 재현탁된 단핵구가 필요합니다. 마우스를 조심스럽게 다루어 보정기에 고정하십시오. 마우스가 상처를 입지 않고 호흡할 수 있는 충분한 공간이 확보되었는지 확인하십시오.꼬리가 플레이트에 닿을 수 있도록 보정기를 가열 패드 위에 놓습니다. 감염을 방지하기 위해 주사 부위를 반드시 소독하십시오. 꼬리의 외측에 위치한 꼬리 정맥을 확인합니다.꼬리를 90도 돌려 꼬리 정맥이 꼬리의 윗면에 오도록 합니다. 단핵구 용액을 낮은 각도로 주입하십시오. 전신성 부작용이 있는지 확인하기 위해 30분 동안 동물을 관찰합니다.동물이 완전히 회복되면 마우스를 케이지에 넣습니다. 현미경이 안정적인 상태에 도달하고 더미(dummy)로 설정을 테스트한 후, 마취된 마우스를 예열된 현미경 스테이지 위에 올립니다. 발을 접착 테이프로 고정합니다.현미경 관찰에 사용할 다리 또는 옆구리 부위의 피부를 소독합니다. 더 원활한 조작과 털로 인한 방해를 방지하기 위해 관심 영역의 털을 깎아냅니다. 관심 영역을 촉촉하게 유지하십시오.그렇지 않으면 이미지와 조직의 품질이 저하될 것입니다. 다리를 두 개의 조절 가능한 지지대 사이에 놓습니다. 지지대 위에 커버 글라스를 배치합니다.현미경 관찰을 시작하고 필요 시 다리의 위치를 조정하십시오. 현미경 설정은 사용하는 소프트웨어에 따라 다릅니다. 자세한 내용은 프로토콜을 참조하십시오.본 데이터는 생체 내 현미경 관찰(intravital microscopy)이 소동물 모델의 혈류 내로 이식된 단핵구(monocytes)를 시각화하는 강력한 도구임을 입증합니다. 전신 효과를 유지하고, 동맥계에 주입할 경우 발생할 수 있는 색전증을 방지하기 위해 단핵구는 반드시 정맥계에 주입해야 합니다. Matrigel을 사용하는 경우, 분산을 방지하기 위해 천천히 주입하면 추후 조직학적 검사를 위한 플라그 적출에 도움이 됩니다.Matrigel 플러그 내에서, 서로 다른 실험 조건에 따라 모세혈관 수를 측정함으로써 혈관 형성을 측정할 수 있습니다. 생체 내 현미경 관찰 결과는 조직학적 검사를 통해 검증할 수 있습니다. 생체 내 현미경으로 검출된 단핵구들을 모든 조직 절편 내에서 확인할 수 있습니다.이미지 획득에 많은 시간이 소요되는 경우, 혈관 내 rhodamine dextran의 양이 감소합니다. 혈관의 가시성을 높이려면 rhodamine dextran 도포를 반복해야 합니다. Matrigel 상의 세포에 양성 프로브를 사용하면 최적의 설정을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.말초 동맥 질환 또는 허혈성 심장 질환 치료의 목표는 혈역학적 협착으로 인해 발생한 다른 관류 영역으로의 혈류를 증가시키는 것입니다. 측부 순환 형성 자극을 통해 단핵구를 강화한 관류 세포 치료는 수술 적응증이 없는 환자들에게 비침습적인 선택지가 될 수 있습니다. 단핵구는 허혈 영역에서의 측부 동맥 발달뿐만 아니라 종양의 성장에도 영향을 미칠 수 있습니다.이러한 과정들을 조사하기 위해, 우리는 생체 내 현미경 관찰과 연계하여 Matrigel 주입법을 사용합니다. 본 프로토콜의 목적은 생체 내 모델에서 허혈로 인해 발생하는 면역학적 과정을 연구하는 쉽고 효율적인 방법을 제시하는 것입니다. 이 새로운 방법을 통해, 우리는 사후 근육 조직의 조직학적 분석과 비교하여 더욱 실제에 가까운 테스트 환경을 조성할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

이 비디오에서는 복강내에 지질다당류를 주입한 마우스 모델의 장간막 정맥에서 혈액 세포-내피 상호 작용의 실시간 시각화를 보여줍니다.

염증 마우스 모델에서 혈액 세포-내피 상호 작용을 분석하기 위한 생체 내 현미경 검사

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

형질전환 리포터 마우스와 주사 가능한 형광 라벨을 사용함으로써, 장기 생체 내 회전 디스크 컨포칼 현미경 검사는 ApcMin/+ 대장암 모델에서 장 선종에 대한 골수성 세포 거동을 직접 시각화할 수 있습니다.

골수 세포 역학의 실시간 영상 APC 최소 / + 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

이 원고 설명 기자 유전자 변형 마우스의 사용 및 다른 관리 경로 angiotensin II 유발 고혈압 면역 세포의 활성화를 평가 하기 위해 혈관의 intravital 비디오 현미경을 사용 하 여 형광 염료의 그들의 롤 및 endothelium에 고착 하는 능력.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

우리는 쥐에 있는 고분자량 (155 kDa) dextran의 정맥 주입을 사용하여 전이 (TMEM) 출입구 기능 및 암 세포 intravasation의 종양 미세 환경과 관련되었던 과도 혈관 투과성을 평가하기 위한 2개의 방법을 기술합니다. 방법은 살아있는 동물에 있는 활력 화상 진찰 및 면역 형광을 사용하여 고정된 조직 분석을 포함합니다.

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

본 프로토콜은 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 유도하기 위해 대퇴골 동맥 및 정맥 전기응고와 산화질소 합성효소 억제제의 투여를 결합한 말초 동맥 질환의 독특하고 임상적으로 관련된 모델을 기술한다. 심장 내 DiI 관류는 풋패드 혈관 구조의 고해상도, 입체 영상화에 사용됩니다.

Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

배우세요 생체 내 현미경법을 사용하여 쥐 모델에서 단핵구 유도 및 혈관신생을 연구하는 방법을. 이 기술은 말초동맥질환 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

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