Name: Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 양측 광학 창과 투광자 현미경을 사용하여 Thy1-GCaMP6s 유전자 변형 쥐의 체성감각 피질에서 신경 활동을 장기간 측정하는 방법을. 이 기술은 뇌 기능과 가소성 연구에 활용됩니다.

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우리는 우수한 기술 지도 대 한 Wenbiao Gan (Skirball 연구소, 학과의 생리학 및 신경 과학, 뉴욕 대학 의과대학, 미국)와 패티 Raley, 의료 편집기 (신경 외과, 인디애나에 매우 감사 대학의 학부), 원고 편집에 대 한. Jinhui 첸 박사 (스 탁 신경 과학 연구소, 인디애나 대학의과 대학, 미국)는 b 6을 제공 하는 감사 합니다. Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/J 쥐. 이 작품 감독 지난 군사 지역 중 PLA 2016ZD03의 종합 병원의 기초에 의해 부분적으로 지원 되었다 (XJL), 및 NIH NS059622, NS073636, 국방부 CDMRP W81XWH-12-1-0562, 장점을 검토 상 I01 BX002356 노 병의 미국 학과에서 업무, 크레이그 H Neilsen 재단 296749, 인디애나 척수와 뇌 손상 연구 재단, Mari Hulman 조지 기부금 펀드 (XMX).

모든 수술 및 동물 취급 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 연구 위원회)의 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 지침에 대 한 가이드 아래 승인으로 수행한 위원회입니다. 2 광자 영상 설치의 도식 적인 그림은 그림 1에 표시 됩니다.
1. 영상에 대 한 동물을 준비합니다.
<ol><li>수술 영역 (표 1)에 멸 균 거 즈, 면봉, 고 압력가 수술 도구를 배치 합니다. 수술 도구 intersurgery 살 균을 위한 마이크로 비드 소독 기를 켭니다.</li>
	<li>케 타 민 (17.2 mg/mL), xylazine (0.475 mg/mL) 및 acepromazine (0.238 mg/mL) (6 µ L/g 몸 무게)의 혼합물의 복 주사 (i.p.) 마우스 (남성 또는 여성, 1.5-2.5 개월, 20-25 g)을 anesthetize. 동물 발가락 꼬집어 자극에 응답 하 고 없이 각 막 반사 마 취의 적절 한 깊이 도달할 때까지 기다립니다. 수술 동안 주고 부스터 복용량 1/3의 마 취약으로 칵테일의 원래 복용량 원래 마 취 상태를 유지 하는 데 필요한.</li>
	<li>Buprenorphine를 피하 주사 (사우스 캐롤라이나, 0.05-0.10 mg/kg) 수술 전 진통 대리인으로. 각 막 건조, 백 내장 형성을 방지 하기 위해 동물의 눈을 보호 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>저체온증을 방지 하기 위해 커버 메 마른 외과 용 드 레이프와 난방 패드에 GCaMP6s 유전자 변형 마우스를 놓습니다. 생쥐 머리 들고 어댑터와 동물의 머리를 고정 시켜야 합니다.</li>
	<li>대부분의 두 번에 지 면도날으로 두 피에 머리를 면도. Povidone-요오드 솔루션 다음 살 균 알코올 준비 패드와 함께 외과 영역을 청소.</li>
</ol>2. 만성 두개골 창 준비
<ol><li>두 피 (2 m m x 3 m m)의 직사각형 잘라 한쪽 (오른쪽)의 두개골에가 위를 확인 합니다. 노출 영역을 만들려면 면봉으로 옆으로 피부를 밀어 > 3 m m 직경 (그림 3A). 부드럽게 무딘 microsurgical 블레이드 (메스 블레이드 #10;와 두개골 된다고 하 여 두개골에 연결 하는 결합 조직 제거 그림 3C)입니다.</li>
	<li>부드럽게 원을 그려 S1 영역 표시 (3 m m 직경, 센터 조정:는 bregma와는 중간에서 2.5 m m-1.5 m m)는 치과 사용 하 여 두개골에 드릴 (그림 2B).</li>
	<li>왼쪽된 두개골 (그림 2B)에 동일한 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>치과 시멘트 응용 프로그램에 대 한 기초를 제공 하기 위해 뼈에 Cyanoacrylate 슈퍼 접착제의 얇은 층을 적용 됩니다.</li>
	<li>해 현미경 원형 홈 고속 microdrill (그림 3D)를 사용 하 여 S1 주변 두개골에 아래로 얇은. 목적은 그것에 광학 창의 배치에 대 한 부드러운 가장자리를 만드는 것입니다.</li>
	<li>반복 시추 촉진 하 여 열을 방산 숱이 과정 정기적으로 두개골 인공 척수 (실제, 실 온) 적용 됩니다. 간헐적으로 마찰 유도 과열 방지를 위해 드릴링을 수행 합니다. 집 진공 라인 또는 진공 펌프와 뼈 파편 떨어져 빨 아.</li>
	<li>뼈의 약 2/3 깊이 뚫고 후 천천히 그리고 신중 하 게 얇은 나머지 1/3 뼈까지 (뼈 플랩) 두개골의 원형 조각 주변의 두개골에서 완전히 무료입니다.</li>
	<li>천천히, 그리고 신중 하 게 # 5/45 집게의 쌍으로 원형 뼈 플랩을 제거 하 고 경질 (그림 2C; 노출 그림 3E)입니다.</li>
	<li>노출 된 뇌 영역 실제 (그림 3E)와 촉촉한 유지. 이후 출혈 뇌 혈액 흐름을 변경, 붓기, 뇌를 가속 되며 심각 하 게 이미지 품질이 저하 pial 배에 어떤 손상을 하지 마십시오.</li>
	<li>두개골 (contralateral) 왼쪽에 동일한 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>광 창 조립, 광학 접착제 접착제 및 사이 coverglass 레이어 하나 한 번에 치료를 사용 합니다. 필요한 경우, 따뜻한 접착성 접합을 강화 하는 인큐베이터에 광 창 (50 ° C 12 h에 대 한). 2 부분을 포함 하는 광학 창: 윗부분 5 m m의 직경을 가진 단일 라운드 커버 유리를 포함 하 고 하단 부분 직경 3 mm (그림 2D)와 1-3 라운드 커버 안경 포함.</li>
	<li>광 창 에탄올 (70%, vol/vol)에 저장 하 고 사용 하기 전에 멸 균 식 염 수로 그것을 씻어. 광 창 설치 하기 전에 결함, 아래는 stereoscope 광학 접착제 또는 부정확 한 정렬의 잘못 된 금액을 포함 하 여 광학 창을 확인 합니다.</li>
	<li>광 창 craniotomy 지역 (그림 2D) 설치. 광학 창 윗부분은 두개골에 달려있다 고 광학 창의 아래쪽 부분 craniotomized 오프닝에서 맞는 CSF (2D 그림, E)의 경질에 달려있다.</li>
	<li>광 창 가장자리 (그림 2F; Cyanoacrylate 슈퍼 접착제로 두개골의 윗부분을 밀봉 그림 3 층)입니다.</li>
	<li>Cyanoacrylate 슈퍼 접착제 건조, 검은 치과 시멘트 (Dentsply) 커버 유리 가장자리에 적용 됩니다. 모든 노출 된 두개골을 치과 시멘트를 적용 하 고 여백을 빛 (그림 2G-H; 차단 상처 그림 3B)입니다.</li>
	<li>왼쪽에 동일한 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>난방 패드에 복구 하 고 적절 한 모니터링에서 복구에 대 한 그것의 가정 케이지를 동물을 반환을 동물 허용. 젖은 음식을 씹는 및 수 화를 제공 합니다. 통증을 줄이기 위해, 관리 buprenorphine 사우스 캐롤라이나 (0.05-2.0 mg/kg) 2 일 동안 매 8-12 h postinjury. 마우스를 복구할 수 있도록 영상 전에 추가 7-10 일.</li>
</ol>3. 2-광자 이미징
<ol><li>실험 당일, 동물 마 취 제와 xylazine (복용량 및 위에서 설명한 대로 마 취의 유지 보수) anesthetize. 75% (vol/vol) 에탄올과 두개골 창을 청소.</li>
	<li>2 P 현미경와 머리 잡고 어댑터, 귀 바 마우스 머리 소유자에 연결 된 통해 움직일 머리와 생리대에 휴식의 구성 된 영상 설정에서 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>이미지의 한 번에 광학 창 한쪽. 광학 착오를 최소화 하기 위해 광학 창 및 오른쪽 두개골 현미경의 광 축에 수직으로 지향된은 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>높은 배율 2 P angiographies (그림 4A1) 등록에 대 한 참조 맵으로 4 배 확대에 밝은 필드 조명 두개골 윈도우의 초기 그림을 가져가 라.</li>
	<li>10 배 확대 (그림 4A2)를 사용 하 여 관심 영역을 확대 합니다.</li>
	<li>S1 영역에 대 한 관심의 영역에서에서 선택 대뇌 피 질의 레이어 I 또는 II (pial 표면 아래 150 µ m)까지 합니다. 높은 확대를 원하는 경우 20 X 목표를 사용 합니다.</li>
	<li>여러 개의 신경 세포와 보기의 필드에 대 한 검색. 2 P 현미경 (그림 4B)를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 노출 시간 및 여기 광 레벨 (≈910 nm)는 깊이에 따라 및 GCaMP6s, 더 긴 노출 시간을 요구 하는 약한 신호 및 concordantly 시간 분해능 덜 식 수준 결정 합니다. 우리는 일반적으로 픽셀 노출 시간 당 ~ 4 µ s를 사용합니다. 512 × 512 픽셀의 해상도에서 3-5 Hz의 프레임 속도로 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>시계열을 기록 하기 시작 합니다. 낮은 확대 이미지에 관심 (ROI) 표준 포인트 또는 혈관 패턴 기준으로 모든 영역의 좌표를 저장 합니다. 시간이 지남에 따라 같은 투자 수익을 이미지. S1 영역 왼쪽된 반구에의 칼슘 역학을 관찰 하는 동일한 절차를 수행 합니다. 각 투자 수익에서 형광에 변화를 계산 합니다.</li>
	<li>개별적으로 또는 시간 경과 영화 (그림 4C1-C3, D, E)로 이미지를 획득.</li>
	<li>이미징 형광 dextran 염료 2 P 현미경으로 설치류의 꼬리 정 맥에 주입 하 여 대뇌 피 질의 혈액 흐름 역학에서 vivo에서 공부 합니다. 랜드마크로 서 vasculatures를 사용 하 여 인식 하 고 이미지를 오랜 기간 동안 세션을 이미징에 동일한 투자 수익.</li>
</ol>4입니다. 데이터 처리
<ol><li>ImageJ 및 출처를 사용 하 여 이미지 분석을 위한. ImageJ (그림 5A-B)와 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 개별 이미지 (또는 t-시리즈 영화)에 대 한 군데 신경 및 2 배경 측정 (그림 5C) 지역 근처 별도 ROI를 선택 합니다. 투자 수익 관리자 (그림 5C) 총 강도 취득 합니다. 참고: 그림 6 은 대표적인 칼슘 이미지를 보여 줍니다. 칼슘 과도 (녹색)과 혈관 (적색) 표시 다른 시간 지점에서 초 (그림 6A-D) 7 d 마우스에서 초기 윈도우 설치 후. 빨간색과 녹색 채널 (그림 6E) 또는 녹색 채널 (그림 6 층)에 대 일 분 녹화 기간 z 투영 표시 됩니다. Z-프로젝션은 러프와 원 경계 (모든 프레임에 대 한 관심의 개체 신경 포괄) 수동으로 선택 배경 영역 ( 근처 독립 2의 선택 뿐만 아니라 영화에 모든 이미지의 압축 된 이미지를 표시 그림 6G).</li>
	<li>각 투자 수익에서 계산 평균 형광 배경, FB FB (FB1 + f b 2) = 2, 형광의 그리고 변화 소마 (F)로 표시 / δ/F, δ/F = (F-FB) / FB.</li>
	<li>ImageJ 기준선 보정, 피크 찾기/결정, 피크 통합, 피크, 피팅 또는 Time-Saving 피크 분석 기능 등의 기능을 사용 하 여 단계적으로 피크 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branch-specific+dendritic+Ca%282%2B%29+spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li>
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<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

두 광자 영상 뇌 표면 아래 약 800 µ m까지에 적당 한 해상도에 많은 세포의 활동의 동시 측정을 수 있습니다. 우리 통합 듀얼 광 창 기술과 2 P 있는 레이어 V 신경 somata의 인구에 있는 칼슘 역학 관찰 하 유전자 인코딩된 GCaMP6s > pia 아래 500 µ m. 두개골의 각 측면에 오픈 광학 창, 메서드 신경 활동의 연장과 안정적인 칼슘에 생체 내이미징에 대 한 대칭 포유류 두뇌 지역에 걸쳐 수 있습니다. 이 방법의 주요 측면 대칭 S1 영역에 듀얼 오픈 두개골 광학 창에 최소 침 습 수술 및 신경 활동의 2 P 이미지를 포함 합니다.
양자 S1 지역에서 네트워크 활동 조사 어떻게 듀얼 두개골 윈도우의 예 조사 지역 및 대칭 정보 성인 두뇌 vivo에서 처리를 사용할 수입니다. 이 메서드는 또한 신경 활동 (예: Thy1-GCaMP6s 마우스를 사용 하 여) 대뇌 피 질의 소성 b 6 공부 하 고 사용할 수 있습니다. Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/deafferentation 일방적인 CNS 부상으로 인해 후 복구에서 해당 대칭 영역의 그대로 조직에서 J. 메서드는 optogenetic, 전기 또는 화학 stimulations 등 주변 자극 전략에 대 한 응답에서 대뇌 피 질의 활동을 검토 하 사용할 수 있습니다. 비록만 S1 영역에서 기술 시연,이 방법은 기본 모터 피 질 (M1)의 레이어 V 신경 세포 등 살아있는 두뇌의 다른 대칭 영역에서 활동을 조사 하 채택 될 수 있습니다. 뇌 영역의 개편에 대 한 관찰 postinjury 복구 기능에 중요 한 역할 적응 모터 동작에 대 한 신경 기질을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 머리 고정 마우스에 동작 동안 유전으로 확인 된 세포의 대칭 활동의 만성 측정에 대 한 수 있습니다.
기술적으로, 조사 품질 및 듀얼 두개골 윈도우의 일관성에 주의 기울여야 한다. 박 형 두개골 두개골 창 기술 12 이 좋습니다 초보자를 위한 연습. 이 그들의 형태학과 지방 유입 및 압출 메커니즘 칼슘 구획 사용 됩니다. 이 연구에서 우리는 b 6를 사용합니다. Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/J 쥐 수지상 척추 역학에서 vivo에서 (그림 4) 설명 하기 위해 예를 들어. 오픈-두개골 유리 창 설치는 수술 12후 높은 척추 회전율 및 반응성 glial 응답을 발생할 수 있습니다. 반면, 박 형 두개골 창 기술 쪽이 및 모 수석 수 잘 보존.
치수의 선택과 광 창의 두께 원하는 시야, 두개골 곡률, 두개골 두께, 및 이미징 13의 종류에 의존 될 것입니다. 경질에 광학 coverglasses의 부족 압력 두껍게 자라나는 두개골의 경질의 발생할 수 있습니다 그리고 증가 두뇌 모션. 반면, 광 coverglasses의 과도 한 압력 대뇌 피 질의 혈액 흐름을 방해 수 있습니다.
광 창 어셈블리, 접착제 및 광학 접착제와 긴 파장 UV 빛 한 번에 하나의 coverglasses의 추가 레이어를 치료. 접착성 접합을 강화 하기 위해, 따뜻한 인큐베이터에서 조작된 창 (50 ° C 12 h에 대 한). 70% (vol/vol) 에탄올에 광학 창 coverglass를 저장 하 고, 수술을 하기 전에 멸 균 식 염 수와 린스. 광 창 오류 방지 하려면 사용 하기 전에 stereoscope 아래 결점 (같은 광학 접착제 또는 부정확 한 정렬에 대 한 잘못 된 양의)에 대 한 검사를 해야 합니다. 광학 접착제 너무 얇은 경우에, 공기 공간 수 있습니다 수 주름 잡은, 광학 착오 또는 커버 유리 분리 이식에서 발생할 수 있습니다. 반면, 너무 많은 광학 접착제 두개골 창 가장자리 과거 오버플로 일으킬 수 있습니다.
요약 하자면, 여기 우리가 칼슘 역학 또는 2 대칭 기본 somatosensory 외피 지구에서 Thy1에 두개골 창을 통해 수지상 형태학을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 및 Thy1-YFP 유전자 변형 쥐, 각각 2 P 현미경을 사용 하 여. 이 기술은 크게 신경 네트워크의 복잡 한 구조 및 기능적 관계를 해 부 촉진 수 있습니다.

칼슘 및 그것의 규칙 여러 생리 적 프로세스를 중재에 필수적입니다. 칼슘 역학을 모니터링 하는 것은 뇌 질환 1,2,3,,45,6의 병 적인 조건 뿐만 아니라 정상적인 뇌 기능을 이해 하는 데 유용 ,,78. GCaMP6s 형광 이미징 스파이크 번호, 타이밍, 측정을 위한 강력한 도구 이며 시 냅 스의 수준 뿐만 아니라 주파수, 생체 외에서 그리고 vivo에서 9,,1011을 입력 합니다.
포유류 두뇌는 화살 비행기에 걸쳐 표시 된 대칭을 전시 한다. 최근 신경 연구는 대뇌 피 질의 개장에 빛을 발산 하 고 신경 활동에 의해 발생 외상 성 두뇌 또는 척수 부상 6,7을 역할의 그 본래 조직 대칭으로 해당 지역 재생 복구에 여전히 모호한 있습니다.
이 연구에서 우리가 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 양측 대칭 광학 윈도 만드는 실험 절차를 설명 합니다. 이러한 광학 창을 사용 하 여, 우리 설명 기본 somatosensory 외피가 (S1)에서 칼슘 역학을 측정 하는 GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 P 현미경을 사용 하 여. 결과 섹션에서 우리는 또한 EGFP 유전자 변형 쥐 2 P 이미지를 사용 하 여 S1 영역에서 다른 시간 지점에서 vivo에서 수지상 형태를 보여줍니다. 양자 S1 영역에 네트워크 역동성에 관한 관찰 메서드는 초기 예 하지만 어떻게 듀얼 오픈 두개골 창의 정상에 포유류 두뇌의 처리 지역 및 대칭 정보를 신경 도움이 될 것입니다. 조건 또는 다른 질병에서 vivo모델.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J</td><td>Jackson</td><td>24275</td><td>피질의 흥분성 뉴런의 부분 집합에서 녹색 형광 칼슘 지표(GCaMP)를 발현하는 유전적으로 암호화된 뉴런 지표 및 효과기에 의해 만들어진 모든 균주일 수 있습니다.</td></tr><tr><td>나6. Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ입니다.</td><td>Jackson</td><td>7919</td>는 <td>피질의 특정 집단 내의 뉴런 부분 집합에서 EGFP를 발현하는 모든 균주가 될 수 있습니다. 밝고 활력 있는 Golgi와 같은 염색을 제공합니다.</td></tr><tr><td>Dumont no. 5 집게, 표준, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>어떤 브랜드도 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Dumont no. 5SF 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11252-00</td><td>어떤 브랜드든 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로 비드 살균기</td><td>남부 Labware</td><td>B1201</td><td>선택의 모든 브랜드가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>하리시게' s SG-4N 헤드 홀딩 어댑터</td><td>Tritech Research</td><td>SG-4N</td><td>선택할 수 있는 모든 브랜드가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>이상적인 마이크로 드릴 전체 키트</td><td>Harvard 장치</td><td>72-6065</td><td>모든 브랜드를 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td>용 버 모든 <td>브랜드를 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>원형 커버 유리, 3mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0720</td><td>원하는 브랜드가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>원형 커버 유리, 5mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0700</td><td>원하는 브랜드가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Norland 광학 접착제</td><td>Norland Products</td><td>7106</td><td>선택의 모든 브랜드가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>록타이트 액체 슈퍼 접착제</td><td>WB 메이슨</td><td>LOC1647358</td><td>선택의 모든 브랜드가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>그립 시멘트 키트, 분말 및 솔벤트</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>모든 브랜드를 선택할 수 있습니다. 흰색 치과용 시멘트 분말(그립 시멘트) 5부와 검은색 템페라 분말 페인트 1부를 혼합합니다(빛을 차단하기 위해, 일부 사용자는 10:1 비율을 선호함).</td></tr><tr><td>젤 폼</td><td>Moore Medical</td><td>2928</td><td>선택의 모든 브랜드가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td>원하는 브랜드가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>인공 뇌척수액(ASF)</td><td>-</td><td>-</td><td>ACSF에는 125mM NaCl, 4.5mM KCl, 26mM NaHCO3, 1.25mM NaH2PO4, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2 및 20mM 포도당이 포함되어 있습니다. ACSF에 산소(산소 95%, 이산화탄소 5%)를 거품을 일으키고 pH를 7.4로 조정합니다. 모든 실험 전에 새로운 ACSF 용액을 준비합니다.</td></tr></tbody></table>

thy1를 사용 하 여 기본 somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-gcamp6s 유전자 변형 쥐

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

포유류 두뇌는 화살 비행기에 걸쳐 표시 된 대칭을 전시 한다. 그러나, 성인 포유류 동물에 대칭 뇌 영역에서 신경 역학에 대 한 자세한 설명을 애매 남아 있습니다. 본이 연구에서는 양자 기본 somatosensory corticies (S1) Thy1에서 위의 듀얼 광 창을 통해 칼슘 역학을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 광자 (2 P) 현미경을 사용 하 여. 이 메서드는 머리말을 붙인 기간 비보에대 한 동일한 실험에서 한 번에 녹음 및 양자 마우스 뇌 영역 하나에에서 신경 활동의 quantifications을 수 있습니다. 한 시간 안에 완료 될 수 있는이 방법의 주요 측면 듀얼 광 창과 2 P 이미징의 사용을 만들기 위한 최소 침 습 수술 절차를 포함 합니다. 우리만 S1 영역에서 기술 설명, 비록 메서드를 촉진 하는 뇌 신경망의 구조와 기능 복잡 한 설명 살아있는 두뇌의 다른 지역에 적용할 수 있습니다.

2 별도 실험에서 결과 얻은 양자 광학 창을 사용 하 여, 우리. 첫 번째 실험 EGFP 표현 쥐 이미지 수지상 varicosities 하 고용. 그림 4C 1-3 광 창 이식 후 다른 시간 지점에서 촬영 된 이미지의 예를 보여줍니다. Note 수와 수지상 가지와 쪽이의 위치는 현저 하 게 안정 2 보기 (그림 4D, Ez-프로젝션) 사이.
두 번째 실험 Thy1-GCaMP6s 유전자 변형 생쥐 과도, 따라서 어떻게 칼슘 생리는 하나의 신경에 vivo에서 (그림 6) 내에서 측정 될 수 있다 설명 세포내 칼슘 측정 고용. 이 기술은 기록 하 고 깊은 있는 레이어 V 피라미드 뉴런의 인구에서 자발적인 활동을 계량 사용할 수 있습니다으로 &gt; pia 아래 500 µ m. (각 시간 지점에서 평균 응답으로 계산) 동안 평균 자발적인 응답 수많은 실험을 통해 계산할 수 있습니다. 2 P 기술 multielectrode 기록에 비해 뇌에 작은 기계적인 소요 연장된 기간 동안 대규모 또는 분산 된 신경 인구에서 동시에 활동을 감지의 이점이 있다.
허용 평균 측정을 생성 하기 위해 5-10 재판은 것이 좋습니다. 횟수가 자발적인 응답 또는 특정 자극에 대 한 응답의 내재 변동성에 종속 됩니다. 모든 단계를 엄격 하 게, 위에서 설명한 대로 따를 경우 연구원 두 박 형 두개골 두개골 창 기술에서 훈련 하 고 2 P 칼슘 이미징 vivo에서 하루 1-2 동물에서 양쪽에 100-200의 녹음을 얻을 수 있어야 합니다.
피크 분석 후 컬렉션 피크, 실제 진폭, 지역 및 각 피크에 대 한 반 최대 (FWHM)에 전체 폭의 실제 위치와 같은 결과 얻을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig1.jpg"> 그림 1 : 2-광자 (2 P) 이미징 두개골 광 창의 구성 요소의 회로도 그림. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig2.jpg"> 그림 2 : 회로도 그림 두개골 창 준비 하기 위한 주요 단계. (A) 해 현미경 외과 영역인 수술가 위를 사용 하 여 피부를 제거. (B) 사용 뼈까지 S1 영역 두개골에 원형 홈 (직경 3 m m)를 생산 하는 고속 microdrill 홈 내 흔들고 주변 뼈에서 분리 된다. (C) 기본 dura 노출 뼈 플랩 천천히 제거. (D) 조립 2 다른 직경을 가진 coverglasses와 광학 창 위 coverglass 더 큰 직경 (5mm) 있으며 낮은 coverglasses (보통 1-3)는 더 작은 직경 (3mm). 설치 될 coverglasses의 두께 두개골의 두께에 의존 될 것입니다. (E) 장소 두개골의 원형 개통에 coverglass 광학 창을 만들 수 있습니다. coverglasses의 더 낮은 부분 두개골 오프닝 안에 적합 해야 한다. coverglasses의 하단 부드럽게 두 라를 문의 하십시오. (F) 인감 창 cyanoacrylate 접착제로 두개골에 가장자리. (G)는 cyanoacrylate 마른 접착제 벽에 검은 치과 시멘트 측면을 적용. (H) ddH2O와 두개골 창와 물 침수 목표를 사용 하 여 이미지에 대 한. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig3.jpg"> 그림 3 . 두개골에 양자 창의 창조. (A) A 사진 이미지 쇼 2 두개골 광학 창 S1 영역 overlying 두개골의 각 측면에. (B) 높은 확대 이미지 (A)의 박스형 영역의 양자 광학 윈도 기본 경질과 혈관 노출 보여주는. 눈금 막대 = 680 µ m. (C) 노출 된 두개골. (D)는 중앙 뼈 플랩 볼 원형 홈 만들기 눈금 막대 = 900 µ m. (E)는 뼈의 제거, 후 두개골 오프닝 인공 척수 (실제)으로 채워졌다. 눈금 막대 = 720 µ m. (F) 두개골 열고 슈퍼 접착제 창의 가장자리 바다 표범 어업 동안 광학 창 설치. 경질 및 혈관 광학 창을 통해 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 600 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig4.jpg"> 그림 4 : 칼슘과 수지상 이미징. (A1) Thy1에 랜드마크로 서 혈관 (BV)를 사용 하 여 관심 영역 식별-GCaMP6s 쥐. (A2) 같은 랜드마크 및 레코드를 사용 하 여 시간이 지남에 따라 동일한 레이블이 셀 (빨간색 화살표)을 식별 합니다. (B) 칼슘의 대표 Z 프로젝션 뉴런 (빨간색 화살표)의 기본 somatosensory 피 질 (S1)에서 신호. 눈금 막대 = 10 µ m. (C1-3) 모 수석 (녹색) 및 b 6에 (빨간색) 혈관의 시각화. Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/레이어 광학 창 설치 후 1 일에서 S1 영역 II에에서 다른 깊이에서 J. (D) Z-1 일에 같은 지역에서 여러 개의 이미지의 투 상 (E) Z-광 창 설치 후 7 일 이내에 같은 지역에서 여러 개의 이미지의 투 상 수의 놀라운 안정성과 성인 등뼈와 1 일 및 광학 창 설치 후 7 일 사이 수지상 분기의 위치를 note. 눈금 막대 = C-E 5 µ m (C-E). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig5.jpg"> 그림 5 : 칼슘 신호 추적. (A, B) 가져온된 t-시리즈 영화 ImageJ 2 신경의 데이터 분석에 대 한의 예 (1 신경 및 신경 2, 각각). (C) A 스프레드시트 관심 영역에서 조명 강도에 데이터 표시 (ROI; 신경 및 2 지역 근처 별도 내로 조치 배경). 피크의 (D) 계산: Δ/F = (F-FB) / 일박 삼 식 제, FB = (FB1 + f b 2) / (평균 형광 배경 [FB], 형광의 그리고 변화 δ/F로 소마 [F]) 2. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig6.jpg"> 그림 6 . 대표 칼슘 이미지. (A-D) 칼슘 과도 (녹색)과 혈관 (빨간색) 7 일에는 마우스에 초에 다른 시간 지점에서 광학 창 설치 후 노란색 화살표: 상대적으로 덜 활성화 신경. 흰색 화살표: 스파이크 신경. (E, F) 빨간색 (혈관) 및 녹색 (칼슘) 채널 (E)과 녹색 채널 전용 (F)에 대 일 분 녹화 기간 Z 프로젝션 (G) 선택한 신경 및 그들의 인접 한 배경 영역이 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

양국 주 somatosensory corticies (S1) Thy1에서 위의 듀얼 광 창을 통해 신경 활동을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 광자 (2 P) 현미경에서 vivo에서를 사용 하 여.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

이 방법은 생체 내 장기간 마우스 양자 피질 영역전반에 걸쳐 신경 활성의 기록 및 정량화를 가능하게 한다. 2개의 광자 기술은 연장된 기간 동안 크고 분산된 신경 인구에서 동시에 활동을 검출하는 이점이 있습니다. 이 기술의 의미는 살아있는 두뇌의 다른 지구에 있는 정의된 신경 인구에 있는 활동 패턴의 조사를 향해 확장했습니다.시술을 시작하기 12 시간 전에 광학 창문을 섭씨 50도에서 70 %의 에탄올로 데우습니다. 광학 창은 둥근 5mm 직경 상단 커버 유리와 3mm 직경 의 커버 유리를 포함하는 하단 부분으로 구성됩니다. 온난화 인큐베이션이 끝나면 마취 된 20 ~ 25 그램 1 1/2 ~ 2 개월 된 Thy1 GCaMP6s 마우스에 발가락 핀치에 대한 반응부족을 확인하고 동물의 눈에 연고를 적용하십시오.멸균 커튼으로 덮인 가열 패드에 마우스를 놓고 마우스가 머리를 안정시키기 위해 헤드 홀딩 어댑터를 사용합니다. 두피의 대부분을 2가장자리 면도기로 면도하고 순차적인 멸균 알코올 준비 패드와 포비도요오드 용액 스크럽으로 노출된 피부를 청소하십시오. 그런 다음 한 쌍의 가위를 사용하여 두개골 의 오른쪽에있는 두피에 직사각형 2 mm를 3 밀리미터 잘라냅니다.면 봉면을 사용하여 피부를 옆으로 밀어 직경이 3밀리미터 이상인 노출 영역을 만들고 무딘 미세 수술 블레이드를 사용하여 두개골에 부착된 결합 조직을 부드럽게 제거합니다. 치과 훈련을 통해 S1 영역 주변에 직경 3mm원을 부드럽게 표시합니다. 두개골의 왼쪽에 유사한 원을 만든 후, 치아 노아크라이레이트 초접착제의 얇은 층을 뼈의 양쪽에 적용하여 치과 시멘트 응용 프로그램을 위한 베이스를 제공합니다.해부 현미경에서 고속 마이크로 드릴을 사용하여 S1 영역 주변의 두개골 오른쪽에 있는 원형 홈을 얇게 하여 매끄러운 가장자리를 만들어 필요에 따라 진공으로 뼈 잔해를 흡입합니다. 약 2/3 의 뼈 깊이가 달성 된 후, 원형 뼈 플랩이 완전히 주변 두개골에서 풀려날 때까지 뼈의 나머지 1/3을 천천히 조심스럽게 얇게 합니다. 5/45 개의 집게 쌍을 사용하여 뼈의 원형 조각을 천천히 조심스럽게 제거하여 두라를 노출시키고 피알 혈관을 손상시키지 않도록주의하십시오.같은 방식으로 두개골의 왼쪽에서 뼈 플랩을 제거 한 후, 멸균 식염수로 두개골의 오른쪽에 대한 광학 창을 헹구고 스테레오 현미경으로 결함을 확인합니다. 두개골에 놓여있는 창의 상단 부분과 두개골 개구부 내의 하단 부분으로 두개골 위에 광학 창을 설치하여 대뇌 척수액이있는 두라에 놓여 있습니다. 시아노아크라일레이트 슈퍼 접착제를 사용하여 광학 창 가장자리의 상단 부분을 두개골에 밀봉합니다.접착제가 건조되면, 유리의 가장자리에 검은 치과 시멘트를 적용, 노출 된 두개골의 오른쪽의 나머지, 빛을 차단하기 위해 상처 여백. 그런 다음 왼쪽 광학 창을 설치하고 동물이 전체 재조정될 때까지 모니터링하여 복구할 수 있도록 합니다. 시술 후 7~10일 후, 마취된 동물을 2광현미경아래 가열패드에 헤드 홀딩 어댑터에 배치하여, 두개골의 광학 창과 오른쪽은 현미경의 광학 축에 수직으로 지향되는 것을 주의한다.4배 배율에서 밝은 필드 조명을 사용하여 두개골 창의 초기 참조 맵 이미지를 획득합니다. 관심 의 동일한 영역의 여러 이미지를 수집 한 후, 왼쪽 반구의 S1 영역 내에서 칼슘 역학을 이미지와 두개골의 양쪽에 관심의 각 영역에서 형광의 변화를 계산합니다. 이러한 대표적인 이미지에서, EGFP 발현 마우스 내의 원점 및 혈관은 광학 창 설치 후 하루 에 S1 영역의 2층에서 서로 다른 깊이에서 시각화되었다.Z 프로젝션 이미지는 광학 창 이식 후 1일과 7일에 캡처되어 실험 기간 동안 수지상 가지및 척추의 매우 안정적인 수와 위치를 보여줍니다. Thy1 GCaMP6s 의 세포내 칼슘 과도 측정을 통해 피아 아래 500 마이크로미터 보다 깊은 곳에 위치한 5층 피라미드 뉴런의 자발적인 칼슘 활성 및 집단의 정량화를 허용하고 시간이 지남에 따라 자발적반응의 평균 수를 계산할 수 있다. 두개골 창 준비와 생체 내 2광자 칼슘 이미징 기술 모두에서 훈련된 연구원은 하루에 1~2마리의 동물로 두개골 양쪽에 100~200개의 뉴런의 기록을 얻을 수 있어야 합니다.두개골의 각 측면에 열린 광학 창을 통해, 방법은 생체 내에서 길고 안정적인 칼슘 이미징을 위한 대칭 포유류 뇌 영역에 걸쳐 신경 활동의 기록을 가능하게 합니다. 이 방법은 또한 주변 장치 또는 중추 신경계에 일방적인 상해 후에 피질 활동 및 가소성을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 Thy1 GCaMP6s 트랜스 제닉 마우스에서 두 광자 현미경을 사용하여 칼슘 역학을 측정하기위한 양자 두개골 창을 설치하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 형질전환 마우스의 광학 창을 통해 뇌의 신경 활동을 기록하는 것을 보여줍니다. 쥐는 신경 활동을 감지할 수 있는 형광 단백질을 발현합니다. 두개골의 작은 부분을 조심스럽게 제거하여 광학 창을 설치하고, 두개골을 검은색 시멘트로 덮어 이미징 전에 빛을 차단합니다.

신경 활동을 이미지화하기 위해 형질전환 마우스의 뇌에 광학 창 설치

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

이 프로토콜은 다중 섬유 광도 측정 기록을 구현하고 수행하는 방법, 칼슘 독립적 인 아티팩트를 수정하는 방법 및 이중 색상 광도계 이미징에 대한 중요한 고려 사항을 자세히 설명합니다.

자유롭게 움직이는 동물의 신경 활동을 기록하는 다중 섬유 광도 측정법

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

신피질(neocortex)의 일차 감각 영역은 발달 과정에서 독특한 자발적 활동을 보입니다. 이 기사에서는 생체 내 신생아 마우스의 영역별 동기 활동을 분석하기 위해 개별 뉴런 활동과 주요 감각 영역을 시각화하는 방법을 설명합니다.

단일 뉴런 해상도에서 신생아 마우스 감각 피질의 자발적 활동에 대한 In vivo 시각화

본 프로토콜은 체세포 및 내장 자극에 대한 요추-6 DRG 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위한 생체 내 칼슘 이미징을 간략하게 설명합니다. 다른 자극에 반응하는 뉴런 간에 철저한 비교가 이루어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 침술과 같은 내장 통증 및 신체 자극의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징

이 연구는 동기식 ECG 기록과 함께 생체 내 칼슘 이미징을 위해 마취된 마우스의 T-DRG를 노출시키는 외과적 조작을 제시합니다. 이 방법은 말초 전기 신경 자극 및 흉부 내장 기관 입력뿐만 아니라 1차 감각 수준에서의 상호 작용을 연구하기 위한 최첨단 도구입니다.

말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

배우세요 양측 광학 창과 투광자 현미경을 사용하여 Thy1-GCaMP6s 유전자 변형 쥐의 체성감각 피질에서 신경 활동을 장기간 측정하는 방법을. 이 기술은 뇌 기능과 가소성 연구에 활용됩니다.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

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