Name: 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 인간 세포, C. elegans, 쥐에서 미토파지를 검출하는 생체 외 및 생체 내 방법을 통해. 이 기술은 신경퇴행성 질환 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리 박사 아츠 시 미 야와 키와 박사 리처드 J. Youle mt Keima 플라스 미드를 공유 하기 위한 감사 및 mt Keima 통합 Hela 세포. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 Raghavendra A. Shamanna와 박사 데보라 L. Croteau 감사합니다. 이 연구는 NIH (VAB)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다, 노화, 2014-2015 년에 국립 연구소와 NIA 2016-2017 내부 실험실 (EFF, VAB) 부여 합니다. EFF HELSE 대단히 OST RHF에 의해 지원 되었다 (프로젝트 No: 2017056)와 노르웨이의 연구 위원회 (프로젝트 No: 262175).
작가 기부:
EFF는 원고를 설계 하 고 준비 초안; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH, 그리고에 드 쓴 다른 부분의 종이; NT, JP, HN, VAB 개정 원고와 전문성을 제공.

<ol><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+DNA+damage+signalling+to+mitochondria+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).</li>
<li>Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+mitochondrial+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protecting the mitochondrial powerhouse.</a> Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).</li>
<li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(16)00081-2.pdf">The Mitochondrial Basis of Aging.</a> Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Shadel, G. S., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+signaling+in+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis.</a> Cell. 163 (3), 560-569 (2015).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Lazarou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+kinase+PINK1+recruits+autophagy+receptors+to+induce+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy.</a> Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).</li>
<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+Disease%3A+Cellular+and+Molecular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Fivenson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+neurodegeneration+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in neurodegeneration and aging.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+autophagy+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compromised autophagy and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).</li>
<li>Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22240478">Mechanisms of autophagosome biogenesis.</a> Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).</li>
<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+disease%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+autophagic+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of autophagic activity in mammalian cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26549682">Measuring In Vivo Mitophagy.</a> Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitophagy+in+XPA+via+PARP-1+hyperactivation+and+NAD%28%2B%29%2FSIRT1+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction.</a> Cell. 157 (4), 882-896 (2014).</li>
<li>Diot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+assay+of+mitophagy%3A+Combining+high+content+fluorescence+microscopy+and+mitochondrial+DNA+load+to+quantify+mitophagy+and+identify+novel+pharmacological+tools+against+pathogenic+heteroplasmic+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA.</a> Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).</li>
<li>Schiavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Starvation-Induced+Mitophagy+Mediates+Lifespan+Extension+upon+Mitochondrial+Stress+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans.</a> Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Sargsyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+parallel+measurements+of+macroautophagy+and+mitophagy+in+mammalian+cells+using+a+single+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor.</a> Sci Rep. 5, 12397(2015).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltun%2C+ZF+%22WormAtlas%22">WormAtlas</a>. , (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Mitophagy+Monitoring+in+Caenorhabditis+elegans+to+Determine+Mitochondrial+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Mitochondrial+Selective+Autophagy+in+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Eiyama, A., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+Mitophagy+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assays for Mitophagy in Yeast.</a> Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
</ol>

보어 연구소 ChromaDex와 GlaxoSmithKline CRADA 준비 하고있다.

Mitophagy의 정확한 측정은 기술적으로 요구 하 고 있다. 여기, 우리는 mitophagy의 질적 모두 검출 및 정량화의 가장 일반적인 실험실 실험 모델 mitophagy 수준에 대 한 허용 하는 여러 가지 강력한 기법 제시.
복제할 데이터를 얻기 위해 적어도 3 개의 생물 학적 반복 된 실험 설계는 필요 하다. 실험 및 분석에 관련 된 모든 연구 실험 그룹 id에 멀게 합니다. 또한, 필드 이미징 선택 되어야 한다 무작위로 이미지 중. 세포 배양 및 C. 선 충 연구, 적어도 3 개의 생물 학적 반복 수행 되어야 한다. Mt Keima 마우스 연구, 쥐의 충분 한 번호를 사용 하 여 통계적 의미를 달성 하는 것이 좋습니다. 포유류 세포에 대 한 각 실험에 대 한 30-100 셀을 분석 하 고 적어도 3 다른 실험을 실행 합니다. 이 단계에서 품질 관리 결과를 복제할 수 있습니다. 효 모에 mitophagy의 감지 되었습니다 최근<sup class="xref...

Mitophagy은 미토 콘 드리 아 유지 보수를 위해 필수적 이다. 미토 콘 드리 아 여러 세포 신호 경로 교차 하 고 보편적인 하위 세포 세포 세포 에너지 생산과 세포 물질 대사, 칼슘 항상성1,2,3, 에 대 한 책임은 4. 미토 콘 드리 아 끊임없이 경험 반응성 산소 종 (선생님)와 미토 콘 드리 아 이용과 같은 내 인 성 및 외 인 근원에서 과제 각각, "세"와 역 기능 mitochondria의 세대 이끌어 내는. 손상 된 미토 콘 드리 아의 축적 유해한 ROS의 양을 증가 하는 동안 ATP 생산의 효율성을 감소 하 고 대사 질환, 광고, 같은 나이 관련 된 질병에 연결 되었다 PD1,5,6 . 유도 미토 콘 드리 아 세포 역 기능을 방지 하기 위해 셀 필요가 특히 미토 콘 드리 아를 손상 인식 하 고 효율적으로 세포 과정을 통해 그들을 제거 미토 콘 드 리아 autophagy를 (mitophagy) 불린다. 이 mitophagy 건강에서의 중요성을 설명 하 고 질병 검색 mitophagy 정확 하 고 효율적인 방법에 대 한 필요성을 보여줍니다 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.
Mitophagy는 많은 단백질과 단백질 단지5,,78와 관련 된 여러 단계 프로세스입니다. 간단 하 게, 손상 된 mitochondrion 처음 인식 이며9,10플라즈마 멤브레인, 바인딩과 그물, 골 단지, 핵, 또는 mitochondrion 자체에서 발생 한 수 있습니다 더블 membraned phagophore에 의해 잠겼습니다. 구형 phagophore elongates 및 결국 미토 콘 드리 아 autophagosome (mitophagosome) 구성 안에 미토 콘 드리 아를 봉인. mitophagosome 다음 성능 저하, 형성 하는 autolysosome는 손상된 mitochondrion 저하 및 재활용7,8은 리소좀으로 퓨즈. 또한 mitophagy에 관련 된 주요 autophagic 단백질 포함: Autophagy 관련 7 (ATG7) 및 Beclin1 (개시), Microtubule-Associated 단백질 1A/1B-라이트 3 (LC3-II) ( C. elegans에서 하는지-1)과 p62 체인 (phagophore의 구성 요소), 그리고 관련 된 lysosomal 막 당단백질 2 (LAMP2)6,7. 또한, PTEN 유도 상 상속 키 니 아 제 1 (핑크-1), Parkin1, 핵 점 단백질 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 상호 작용 단백질 3 처럼 (닉스/BNIP3L) (DCT-1 C. 선 충)를 포함 하 여 mitophagy에 고유한 여러 가지 필수적인 단백질은 다른 사람의 사이에서5,6,11.
Autophagy의 수준에서 변화를 감지 하는 일반적인 방법은 LC3-II/LC3-나의 LC3-II/말라 비율입니다. 그러나,이 메서드는 일반적인,이 비율 증가 증가 개시 또는 리소좀12mitophagosome의 장애인된 융합 반영 수 있습니다. 또 다른 방법은 없는 autophagy 마커 (예를 들어, LC3)와 미토 콘 드리 아 단백질 (예를 들어, Translocase의 외부 미토 콘 드리 아 막 20 (TOMM20, proteasomes에 의해 타락 될 수 있는)) 사이 colocalization를 평가 하는 것입니다. 그러나,이 수만 총 mitophagy 수준에서 변경 내용을 나타내고는 단계를 구별할 수 없습니다 어떤 막힘에 발생 합니다. 이 mitophagosomes의 축적을 병렬로 lysosomal 억제제 (예를 들어, E64d + Pepstatin A, EP에 게 불리는)를 사용 하 여 명백 하 게 될 수 있습니다. Mitophagosomes EP와 치료 다음과의 수와 초기에 mitophagosomes의 수의 차이 mitophagy를 나타낼 수 있습니다. 이러한 제한에는 소설 mitophagy 탐지 기술의 개발 라는 메시지가 있다. 인간의 질병의 넓은 스펙트럼에 mitophagy의 증가 관련성에 비추어 우리 연구원에 대 한 도움이 될 수 있습니다 몇 가지 강력한 mitophagy 탐지 기법 제시. 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 기술을 커버 하 고 mitophagy의 변경 사항을 확인 하려면 여러 기술을 결합 하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>mt-Keima mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 DNA transfection 시약</td><td>Thermofisher</td><td>#11668027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>#31985062</td><td>무혈청 배지</td></tr><tr><td>mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima</td><td>addgene</td><td>#72342</td><td></td></tr><tr><td>COXII 항체 (마우스)</td><td>abcam</td><td>#ab110258</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 항체 (토끼)</td><td>NOVUS</td><td></td><td></td></tr>#CD107b <tr><td>적색 형광 단백질(RFP) 파장 568 nm의 염소-안티-토끼Thermofisher</td><td></td><td>#Z25306</td><td>Alexa Fluor 568 염료</td></tr><tr><td>염소-안티-마우스(파장 488 nm의 녹색 형광 단백질(GFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25002</td><td>Alexa Fluor 488 염료</td></tr>는 <tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>으로 금 퇴색 방지를 연장합니다</td><td>#P36931</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td>: <td>SIGMA , Corning Costar</td><td>#CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>4웰 챔버 슬라이드</td><td>, THermofisher, Nunc Lab-Tek</td><td>#171080</td><td></td></tr>, <tr><td>Nunc F, 96웰 플레이트</td><td>, Thermofisher</td><td>#152038</td><td></td></tr><tr><td>LC3B 항체, 토끼</td><td>NOVUS</td><td>#NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>DNA 항체</td><td>Progen Biotechnik</td><td>#anti-DNA 마우스 단클론, AC-30-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>#D1306</td> DAPI IN 세포 분석기(형광 판독기)<td>가 있는 퇴색 방지 장착 매체</td></tr> GE <tr><td></td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>#IN 세포 분석기 2200</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000e 컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>#TE-2000e</td><td></td></tr><tr><td>공동 현지화 소프트웨어</td><td>Volocity</td><td>#Volocity 6.3</td><td>대안 Zeiss ZEN 2012 소프트웨어</td></tr><tr><td>IN 세포 조사자 소프트웨어</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#28408974</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 매체</td><td>Thermofisher</td><td>#DMEM&ndash; Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermofisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#12003C-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Thermofisher</td><td>#Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator</td><td></td></tr><tr><td>epifluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Imager Z2</td></tr><tr><td>카메라</td><td>올림푸스</td><td></td><td>올림푸스 DP71</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>자이스</td><td></td><td>자이스 Axio Observer Z1</td></tr><tr><td>컨포칼 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Image J</td><td>공동 국소화 분석 등</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>통계 분석 소프트웨어</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td><td></td><td>GraphPad Prism 소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>재료는 웜 픽을 만들기 위해 Surepure</td><td>Chemetals</td><td>#4655</td><td>픽은 30 게이지 90% 백금 10% 이리듐 와이어</td></tr><tr><td>IR: N2로 만들어집니다. Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td>에게 물질 문의 <td>형질 전환 동물을 20 &deg로 유지하십시오. C</td></tr><tr><td>IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 TOMM-20::Rosella</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pdct-1 DCT-1::GFP</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 DsRed에게 재료 문의 :: LGG-1</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라콰트 용액</td>에 대한 재료 문의 준비 M9 버퍼 <td>준비</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>에 대한 추가 데이터 참조</td></tr><tr><td>준비 M9-레바미솔 버퍼</td><td>준비</td><td></td><td></td>준비 참조</tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드 및 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>#B9992000</td><td></td></tr><tr><td>수술용 집게</td><td>STERIS 동물 건강</td><td>19개 개 중성화 수술 팩 경제</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>STERIS 동물 건강</td><td>19개 개 중성화 수술 팩 경제</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Thermofisher</td><td>#AM9625</td><td>10x PBS는 ddH2O 쉐이커를 사용하여 1x PBS로 희석해야</td></tr> 합니다. <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>#11-676-178</td><td>Thermo Scientific MaxQ HP 테이블탑 오비탈 소형 오픈 에어 플랫폼 쉐이커 패키지 A</td></tr><tr><td>2% 아가로스 패드</td><td>준비를</td><td></td><td></td>위한 추가 데이터 참조</tr><tr><td>Vibroslice 블레이드</td><td>세계 정밀 기기</td><td>#BLADES-2</td><td>싱글 엣지</td></tr><tr><td>블레이드 메탈 플레이트</td><td>MSC</td><td>#78803988</td><td>0.012 인치 두께 x 6 인치 너비 x 12 인치 길이, 430 스테인리스 스틸 시트</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>세제</td></tr><tr><td>: 메틸 바이올로겐 이염화물 수화물</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>#856177</td> 선충 용 <td>파라콰트</td></tr><tr><td>인큐베이터</td> : 20 &deg를 유지하는 <td>AQUALYTIC</td><td></td><td>인큐베이터; C</td></tr><tr><td>해부 실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>선충 (2 단계)</td></tr> <tr><td>epifluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager Z2</td><td>선충 (2 단계)</td></tr> <tr><td>UV crosslinker</td><td>Vilber Lourmat</td><td>BIO-LINK &ndash; BLX-E365</td><td>UV 광원, 356nm</td></tr></tbody></table>

생체 외에서 그리고 vivo에서 인간 세포, c. 선 충, 쥐에서 mitophagy의 검출

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

미토 콘 드리 아 셀의 강국입니다 그리고 ATP의 형태로 세포 에너지를 생산. 미토 콘 드 리아 기능 장애는 생물학적 노화 및 질환 대사 질환, 조기 노화 증후군, Alzheimer의 질병 (광고) 및 파 킨 슨 병 (PD)와 같은 신경 퇴행 성 질환 등의 다양 한에 기여 한다. 미토 콘 드리 아 건강의 유지 보수는 미토 콘 드리 아 속 mitophagy 통해 역 기능 mitochondria의 효율적 허가에 따라 다릅니다. 정확 하 게 감지 하 autophagy/mitophagy, 특히 동물 모델 실험 방법 개발에 도전 있다. Mitophagy의 분자 메커니즘의 이해로 최근 진행은 소설 mitophagy 탐지 기술 개발을 활성화 하 고 있다. 여기, 인간의 세포, 꼬마 선 충 mitophagy 모니터 여러 다양 한 기법 소개 (예를 들어, 윈저 DCT-1 / 하는지 1 긴장), 마우스 (mt Keima). 간 종 평가 포함 하 여 이러한 mitophagy 탐지 기술의 조합 mitophagy 측정의 정확도 개선 하 고 mitophagy 건강과 질병에서의 역할의 더 나은 이해로 이어질.

인간 세포에 Mitophagy의 검출:
여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 인간 헬러 세포 mt Keima 플라스 미드와 페 했다. 건강 한 세포는 잘 조직 된 미토 콘 드 리아 네트워크 시연 (GFP, 488 nm)와 mitophagy의 몇 가지 부각 (RFP, 561 nm). 그러나, 세포는 미토 콘 드리 아 uncoupler FCCP와 청소용 (3 h 30 µ M) mitophagy 발생 (그림 1A)에서 깊은 증가 전시. Mitophagy는 LAMP2와 COXII (그림 1B) 사이 공동 지역화를 사용 하 여 측정 했다.
C. 선 충 에...

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

이 실험의 전반적인 목표는 인간 세포, 예쁜꼬마선충 및 생쥐의 미토파지 수준을 평가하는 것입니다. 미토파지(Mitophagy)는 신경 퇴행, 대사 질환 및 노화의 교차로에서 매우 중요한 개념이 되었으며, 여기에 제시된 방법론에 대한 통찰력과 향후 이러한 방법론의 사용은 이 중요한 분야에서 발전하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 강력하고 효율적인 방식으로 미토파지를 검출하고 in vitro 및 in vivo 모두에서 미토파지를 검출할 수 있다는 것입니다.여기에 제시된 이 기술은 연구자들이 새로운 통찰력을 개발하고 미토콘드리아 기능 장애가 있는 것으로 알려진 알츠하이머병과 파킨슨병을 포함한 신경 생성 질환에 대한 치료를 위한 새로운 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 미토파지의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 이러한 방법은 미토파지 유도제의 스크리닝을 통해 새로운 약물 후보를 발견할 수 있습니다. 이러한 방법의 시각적 시연은 미토파지 수준이 예쁜꼬마선충과 마우스 모두에서 실험 조건의 변화에 매우 민감하기 때문에 매우 중요합니다.300, 35 밀리미터 유리제 바닥 microwell 접시, 10 밀리미터 microwell에 있는 300, 000에서 100개의 세포를 씨를 뿌려서, 세포가 다음날에 70%confluency를 도달하도록. 세포를 완전한 세포 배양 배지로 유지하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에서 배양합니다. 다음 날, 제조업체의 프로토콜에 따라 15μl의 DNA transfection 시약을 150μl의 무혈청 배지로 희석합니다.또한 2-5마이크로그램의 mito-Keima 플라스미드 DNA를 150마이크로리터의 무혈청 배지로 희석합니다. 희석된 DNA transfection 시약에 희석된 mito-Keima 플라스미드를 첨가하고 혼합물을 10초 동안 와류로 처리한다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.다음으로, DNA transfection 시약 혼합물을 세포에 적하 방향으로 첨가하고 플레이트를 5-10초 동안 부드럽게 흔들어 용액을 혼합합니다. 이 시점에서 세포를 다시 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 새로운 완전한 세포 배양 배지로 변경한 다음 형질주입된 세포를 추가로 24시간 동안 배양합니다.컨포칼 현미경을 사용하여 형질주입된 세포를 이미지화합니다. 모든 웰에서 총 100-200개의 세포를 문서화하기 위해 40배 배율로 20개 영역을 무작위로 이미지화합니다. 첫째 날, 체벽 근육 세포에서 DCT-1 GFP와 DSRed LGG-1을 모두 발현하는 형질전환 동물의 L4 유충을 선택하여 OP50 종자 선충 성장 배지 플레이트에 놓습니다.최소 3개의 플레이트를 사용하여 각 3.5cm 플레이트에 5-10개의 지렁이를 놓습니다. 완료되면 선충을 섭씨 20도에서 배양합니다. 다음으로, 5일차에 15-20개의 L4 형질전환 유충을 선택하여 신선한 OP50 파종 플레이트로 옮겨 선충을 동기화합니다.각 실험 조건에 대해 최소 5개의 플레이트를 사용합니다. 7일째에는 관심 약물에 영향을 미치는 미토파지에 대해 차량 플레이트의 일부를 준비하고 일부는 양성 대조군으로 사용할 수 있도록 준비합니다. 다음으로, E.coli 파종 플레이트를 제곱센티미터당 222마이크로와트의 강도로 15분 동안 자외선에 노출시켜 플레이트의 미토파 유도 화합물이 박테리아에 의해 대사되지 않도록 합니다.이제 10 마이크로 리터의 관심 화합물을 시딩 된 플레이트의 상단에 추가하고 동일한 양의 화합물 차량을 차량 플레이트에 negative control로 추가합니다. 미토파지 유도를 긍정적으로 조절하려면 미토콘드리아 독성 물질인 파라콰트를 첨가하십시오. 용액이 전체 표면을 코팅할 때까지 플레이트를 부드럽게 휘젓고 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 실온에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다.건조되면 10-20 마리의 2 일 된 성인 형질 전환 동물을 플레이트로 옮깁니다. 섭씨 20도에서 이틀 동안 배양합니다. 9일째에 2% 아가로스 패드를 준비하고 패드당 M9에 20밀리몰 레바미솔 한 방울을 추가합니다.M9 레바미솔 드롭에 넣어 이미징을 위해 형질전환 동물을 고정시킵니다. 그런 다음 방울 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 샘플을 컨포칼 현미경 스테이지에 놓고 63배 배율로 Z 스택 이미지를 촬영하여 단일 체벽 근육 세포를 이미지화합니다.분리된 신선한 mito-Keima 마우스 간을 얼음 위의 차가운 금속판에 올려 조직을 빠르게 냉각시킵니다. 미토-케이마(mito-Keima) 단백질의 신호가 얼음 위에서 최대 1시간 동안 안정적으로 유지되므로 가능한 한 빨리 조직을 처리하는 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 간 샘플을 들어 올리고 얼음처럼 차가운 PBS 5ml로 헹굽니다.마지막으로, 두 개의 순차적 여기가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 조직 단면을 이미지화합니다. 여기에 제시된 절차를 사용하여 인간 HeLa 세포에 mito-Keima 플라스미드를 transfection했습니다. 건강한 세포는 미토파지 발생률이 거의 없이 잘 조직된 미토콘드리아 네트워크를 보여주었습니다.그러나 미토콘드리아 언커플러 FCCP로 전처리된 세포는 미토파지 발생률이 크게 증가했습니다. Mitophagy는 또한 LAMP2와 COXII의 공동 국소화를 사용하여 측정되었습니다. 예쁜꼬마선충에서 미토파지의 생체 내 검출을 위해, 체벽 근육 세포에서 MT 로젤라를 발현하는 형질전환 선충을 8밀리몰의 파라콰트로 처리했습니다.pH에 민감한 형광 비율의 감소로 나타나는 미토파지 유도 수준은 파라콰트로 처리된 선충에서 현저히 감소하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 DCT-1 융합 GPF와 DSRed 융합 LGG-1 사이의 공동 국소화 이벤트의 수가 증가한 것은 산화 스트레스에 대한 반응으로 미토파지 자극을 의미합니다. 마지막으로, 이 이미지는 mito-Keima 마우스의 간과 소뇌에서 나오는 mito-Keima 신호를 나타냅니다.조직은 차갑게 보관하고 가능한 한 빨리 이미지화해야 하지만, 적절하게 준비하면 정상 및 병태 생리학적 조건에서 미토파지에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 사용은 신경 변성 및 미토콘드리아 생물학의 광범위한 분야의 연구자들이 배양된 세포, 벌레 또는 예쁜꼬마선충 및 마우스 모델을 포함한 다양한 모델 시스템에서 미토콘드리아 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 예쁜꼬마선충과 생쥐 모두에서 미토파지 수치의 정량적 평가에 사용할 수 있는 여러 방법을 이해하게 될 것입니다.

in-vitro-vivo-detection-mitophagy-human-cells-c-elegans

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 미토파지를 연구하기 위한 생체 내 분석을 보여줍니다. 선충을 미토파지 유도 약물에 노출시키면 손상된 미토콘드리아의 미토파지 수용체인 DCT-1과 자가포식체막 단백질 LGG-1 사이의 공동 국소화에 의해 미토파지의 발생을 평가합니다.

형질전환 선충에서 Mitophagy를 검출하기 위한 In Vivo 분석

모델 유기체인 Caenorhabditis elegans에서 미토콘드리아 억제제의 효과를 생체 내에서 검출하고 잠재적인 강화 화합물을 식별하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능을 조절하는 화합물에 대한 약물 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

Screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정 Drosophila 태아

Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

이 프로토콜은 췌장 β 세포에서 미토파지의 정량적 분석을 위한 두 가지 방법을 설명합니다: 첫 번째는 세포 투과성 미토콘드리아 특이적 염료의 조합이고, 두 번째는 유전적으로 인코딩된 미토파지 리포터입니다. 이 두 기술은 상호 보완적이며 특정 요구 사항에 따라 배포할 수 있으므로 미토콘드리아 품질 관리를 정량적으로 처리하는 데 유연성과 정밀도를 제공합니다.

췌장 β세포에서 미토파지 플럭스를 조사하기 위한 보완적 접근법

이 프로토콜은 노화 중 예쁜꼬마선충 의 여러 조직에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

방법은 생쥐에서 인간의 retinoblastoma 종양을 전파하기 위해 설명되어 있습니다. 종양 세포에 직접 면역 결함 생쥐의 눈을에 주입하고 있습니다. 이차 종양이 성공적으로 직접적으로 인간의 종양과 교양 tumorspheres에서 수확을 모두 세포를 사용하여 설립되었습니다.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

우리는 여기서 인간의 간질 대뇌 피질 조직의 다중 전극 배열 녹음을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 간기 및 발작 사건의 간질 조직 절제술, 슬라이스 준비 및 다중 전극 배열 기록은 구체적으로 입증된다.

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

학습하세요 인간 세포, C. elegans, 쥐에서 미토파지를 검출하는 생체 외 및 생체 내 방법을 통해. 이 기술은 신경퇴행성 질환 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

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