Name: 재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 배우세요 재조합 단백질의 사이트별 글리코실화 방법을 통해 단백질 구조와 기능 변화를 평가하는 기술입니다. 이 방법은 구조생물학 및 단백질 공학 연구에 효율적으로 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 (P.B.S.에 05239), 캐나다 재단에 의해 지원 되었다 혁신/온타리오 연구 기금 (P.B.S.), 전립선 암 싸 워 재단-Telus 타고 아빠 (P.B.S.) 하 고 온타리오에 대 한 (Y.J.C. N.S.)를 대학원 장학입니다.

1. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)-세균 애완 동물-28a 식 벡터에 Cys의 설립에 대 한 사이트 이동 mutagenesis 중재.
<ol><li>260에서 0.020 (μ g/mL) cm -1의 자외선 (UV) 소멸 계수를 사용 하 여 애완 동물-28a 벡터 (즉, 두 배 좌초 된 DNA)의 농도 결정 nm.</li>
	<li>합성 각 Cys 돌연변이 대 한 보완 돌연변이 뇌관의 쌍 난) 이전에 1 루 불일치 및 15 뉴클레오티드 보완 후 서식 파일에 서식 파일을 보완 15 뉴클레오티드의 최소 있다는 마지막 기본 불일치, ii) 45 뉴클레오티드, 및 iii 총 뇌관 길이 초과 하지 않는) 구 아닌 또는 시 토 신은 각 뇌관 (표 1)의 첫 번째 및 마지막 뉴클레오티드 위치에 위치. 뇌관 종합 0.025 μmol 규모 및 카트리지 정화를 사용 하 여 수행 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 두 개의 20 µ L PCR 반응 혼합물을 설정: 앞으로 뇌관과 두 번째가지고 있는 역방향 뇌관을 포함. 1.5 m m MgCl 2, 0.2 m m dNTPs, 0.5 μ M 뇌관, 0.4 μ DMSO, 1 x PCR 버퍼의 최종 농도 포함 하는 각 혼합물 준비 1.25 ng/μ 템플릿 DNA, 0.02 U/μ 고 충실도 DNA 중 합 효소.</li>
	<li>열 3 단계 프로토콜을 사용 하 여 별도 혼합물을 주기: 98 ° C 30에 대 한 s (변성 시키기), 53-56 ° C 30에 대 한 s (어 닐 링), 30 s kilobase(kb) -1 (확장) 서식 파일 DNA의 72 ° C. 5 주기 위한 온도 프로그램을 반복 하 고 추가 7.5 분에 대 한 최종 72 ° C 확장 단계</li>
	<li>별도 튜브에 앞으로 역 뇌관으로 초기 PCR 후 단일 튜브 (즉 40 μ 총)으로 제품을 결합 하 고 계속 1.4 단계에서 설명한 대로 동일한 자전거 매개 변수를 사용 하 여 추가 20 사이클에 대 한 PCR 반응.</li>
	<li>1% (w/v) agarose에 PCR 반응 혼합물의 electrophorese 15 μ 젤 0.5 x Tris, 아세트산, 에틸렌 diamine tetra 아세트산 (EDTA) 실행 버퍼 (태)을 사용 하 여. 컨트롤 템플릿 하지 PCR에 의해 증폭 된 DNA의 상응 하는 금액 및 마커 밴드 모두 큰 고 예상된 PCR 제품의 크기 보다는 더 적은 포함 하는 참조 DNA 사다리의 약 수를 electrophorese.</li>
	<li>40 분 120 V에서 전기 이동 법, 후 잠수함 물 0.5 μ g/mL ethidium 평범한 사람 및 실 온에서 30 분 동안 동요에에서 젤. 전체 길이 서식 파일은 증폭 되었다 돌연변이 뇌관에 의해 증가으로 UV 빛에서 컨트롤 템플릿 밴드에 비해 증폭된 밴드의 상대 ethidium 평범한 사람 형광 강도 확인 (302 nm).
	<ol><li>아무 증폭 명백한 경우 0.5 ° C 증가 53-56 ° C 온도 범위에서 어 닐 링 온도 조정 후 PCR을 반복.</li>
	</ol></li> <li>돌연변이 뇌관에 의해 템플릿의 증폭의 확인, 치료 DpnI 제한 효소 소화 methylated 템플릿 DNA PCR 반응 혼합물의 나머지 ~ 25 μ. DpnI를 사용 하 여 25 μ PCR 반응 혼합물 및 1 × DpnI 반응 버퍼의 마지막 농도 0.5 µ L (10 단위)에서. 2.5 h 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>열 100 µ L 소화 혼합물의 5 ~ 10 μ 충격 1.75 mL microcentrifuge 튜브에 유능한 DH5α Esherichia 대장균 세포 추가 템플릿 소화, 다음. 60 분에 대 한 얼음에 세포 DNA 혼합물을 품 어</li>
	<li>열 충격 45 42 ° C에서 microcentrifuge 튜브에 세포 DNA 혼합물 건조 열 블록에 s. 3 분 동안 얼음에 혼합물, 잠복기 후 실내 온도 Luria Bertani 국물 (파운드)의 900 μ 셀 추가 하 고 총 세포 현 탁 액 살 균 14 mL 라운드-하단 튜브로 전송.</li>
	<li>190 rpm에서 일정 한 동요와 90 분 동안 37 ° C에 세포 현 탁 액을 품 어.</li>
	<li>이후, 세포 현 탁 액 1.75 mL microcentrifuge 튜브 및 실 온에서 5 분 동안 10000 x g에서 원심 분리기로 다시 전송.</li>
	<li>원심, 후는 상쾌한의 900 μ를 제거 하 고 부드러운 pipetting 파운드의 나머지 100 μ에 의해 세균성 세포 resuspend</li>
	<li>전송 식 벡터 (즉 60 μ g/mLKanamycin)에 대 한 선택은 항생제를 포함 하는 파운드-한 천 격판덮개에 결과 집중된 세포 현 탁 액. Aseptically 한 천 격판덮개에 균등 하 게 정지를 확산 하 고 37 ~ 16 h에 대 한 품 어 ° c.</li>
	<li>다음 날, antiobiotic 선택 압력 (예: 60 μ g/mL 대)를 포함 하는 액체 LB의 5 mL에 접시에서 단일 식민지를 예방. 성장 37에 지속적인 동요를 37 ° C에서 하룻밤 액체 문화 ° c.</li>
	<li>격리 및 45의 알칼리 성 세포의 용 해 절차 따라 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 대장균 세포에서 전파 된 플라스 미드 정화.</li>
	<li>관심의 돌연변이 존재 하 고 적절 한 독서 프레임 46 플라스 미드 생어 DNA 연속 확인.</li>
</ol> 2. 15 BL21 ΔE3 대장균에 N 표시 된 단백질 식 통일.
 참고: 다른 재조합 단백질 필요 다른 식을 조건. 다음은 인간 STIM1 EFSAM 단백질의 표현에 대 한 최적화 절차.
<ol><li>BL21 ΔE3 codon (+) 열 충격 유능한 세포에 Cys 변이 (즉: 애완 동물-28a-EFSAM)을 품고 식 벡터를 변환 하 고 1.9-1.14 단계에 설명 된 대로 항생제 선택의 압력을 포함 하는 파운드-한 접시에 접시)와 다음 수정: 직접 원심 분리에 의해 microcentrifuge 튜브에 세포를 집중 하지 않아도 파운드-한 접시에 ~ 1000 μ 총 세포 현 탁 액에서 약 150 μ 수 접시.</li>
	<li>다음 날, aseptically 200 mL 삼각 플라스 크를 포함 하는 적절 한 항생제 (예: 60 μ g/mL 대 애완 동물-28a-EFSAM에 대 한) 보충 파운드의 20 mL에 단일 식민지 전송. 이 액체 시 동기 문화 하룻밤 (즉 ~ 16 h) 37 ° C에서 일정 한 동요에 성장 ~ 190 rpm.</li>
	<li>M9 준비 단계 2.2로 같은 날 15 압력가 마로 소독 하 여 N 표시 된 단백질 표정 매체 1 L m 9의 4 L 삼각 플라스 크에 소금 (42 m m 나 2 HPO 4, 22 mM KH 2 포 4, 8.6 m m NaCl, pH 7.4)를 버퍼. 일단, 20% (w/v) D-포도 당, 1 M CaCl 2, 1 M 티 아민, 1 M MgSO 4, 1 mg/mL biotin, 0.2 g/mL 15 N-NH 4 Cl의 혼합물 1 L 살 균 M9 소금 솔루션으로 0.2 μ m의 무 균 주사기 필터를 통해 필터링 되도록는 이러한 구성의 최종 농도 0.2% (w/v) D-포도 당, 100 μ M CaCl 2, 50 μ M 티 아민, 1mm MgSO 4, 1 μ g/mL biotin과 1 mg/mL 15 N-NH 4 cl.</li>
	<li>다음 날, aseptically 50 mL 살 균 원뿔 튜브와 작은 셀을 15 분 동안 2400 × g에서 원심 분리기로 20 mL 하룻밤 액체 시 동기 문화를 전송.</li>
	<li>파운드 매체 decanting, 후 resuspend M9 최소 매체의 10 mL에 결과 셀 펠 릿 및 항생제 (예: 60 μ g/mL 대)와 M9 최소 매체의 1 L에 resuspended 펠 릿 혼합 전송.</li>
	<li>성장 포함 하는 37 ° C에서 600 nm (OD600)에 도달에서 광학 밀도까지 떨고 ~ 190 rpm 상수 세균 스타터 문화 M9 최소 매체의 1 L ~0.6-0.8.</li>
	<li>Specfified OD600 범위에 도달 하면 추가 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside 단백질 표정 유도 (IPTG)의 200 μ M.</li>
	<li>IPTG 추가 후 ~ 190 rpm ~ 16 h (즉, 하룻밤)에 대 한 지속적인 동요와 주위 온도에 단백질 식 세포를 배양 하는 것을 계속.</li>
	<li>다음 날, 수확 ~ 10000 × g, 30 분에 4 ° C에서 원심 분리 하 여 박테리아</li>
	<li>LB를 가만히 따르다와 50 mL 원뿔 튜브로 셀 펠 릿을 전송. 정화까지-80 ° C에서 펠 릿 저장.</li>
</ol> 3. 대장균에서 재조합 형 단백질의 정화.
 참고: 다른 재조합 단백질 별개 정화 절차 필요. 다음은 6 &amp; # 215에 대 한 프로토콜; 애완 동물-28a 구문에서 표현 된 포함 시체에서 그의 태그 EFSAM 정화.
<ol><li>수동으로 6 M guanidine-HCl, 20 mM Tris HCl (pH 8)에 냉동된 세균성 세포 pellet 균질 및 5mm β-mercaptoethanol 동력된 10 mL 전송 피 펫을 사용 하 여. Guanidine-HCl이이 단계에 대 한 젖은 셀 펠 릿의 5 mL 당 약 40 mL를 추가.</li>
	<li>다음는 90 분 부 화 교 잡 오븐에 일정 회전 주위 온도에 원심 ~ 15000 × g, 수용 성 단백질에서 불용 성 세포 파편 (즉 펠 릿)을 40 분 동안 8 ° C에 혼합물 혼합 (즉, 표면에 뜨는).</li>
	<li>50% (v/v) Ni 2 +의 추가 750 µ L-nitrilotriacetic 산 agarose 구슬 슬러리는 명확히 lysate와 교 잡 오븐에 반전으로 실 온에서 또 다른 90 분 동안 품 어.</li>
	<li>이후, 6 × 태그 그의 단백질을 중력 흐름 단백질 정화 열에서 agarose 구슬 수집 하 여 Ni 2 +에 바인딩된 캡처합니다. Lysate 3.5 단계로 이동 하기 전에 완전히 열을 통해 흐름을 허용.</li>
	<li>수집된 구슬 6 M 요소, 20 mM Tris HCl pH 8과 5 m m β-mercaptoethanol의 10 mL로 세 번 세척. 전체 10 mL 각 후속 10 mL 이전 열 통과 확인 워시</li>
	<li>6 M 요소, 20 mM Tris HCl pH 8를 사용 하 여 2 mL 분수의 시리즈에 있는 단백질을 elute 300mm 이미, 그리고 5mm β-mercaptoethanol 분수 사이 90 s 보육 시간. 전체 2 mL 각 후속 차입 단계 전에 열 통과 확인 하십시오.</li>
	<li>가이 단계에서 관심사의 단백질은 Coomassie 파란 얼룩이 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 47 Laemmli 방법을 사용 하 여 의해 eluted 분수에 확인. 둘 다 표준 분자량 마커 밴드에 대 한 단백질 크기, 양 및 순수성을 비교 하 여 평가 및 보다 적게 보다는 예상된 분자량 보다 큰 관심사의 단백질의.</li>
	<li>컷오프 3500 다 분자 무게와 투 석 막에 eluted 단백질 분수 수영장 및 4 ° C에서 1 L refolding 버퍼 (트리 스, 300 m m NaCl, 1 mM DTT, 5mm CaCl 2, pH 8 m 20 m)에서 품 어 하룻밤 동안 버퍼는 자석과 의해 자극 되는 c 활동가.</li>
	<li>~ 16 h refolding 시간 후 ~ 1 투 석 가방에 직접 단백질의 밀리 그램 당 트 롬 빈의 U를 추가 하 고 추가 ~ 24 h. 4 ° C에서 품 어</li>
	<li>는 Coomassie 파란 얼룩이 ~ 15 μ 단백질 aliquots 트 롬 빈과 보육 전후 투 석 가방에서 가져온 polyacrylamide 젤 (SDS 페이지)를 사용 하 여 변성 시키기에 electrophoresed는의 지에 의해 그의 태그 분열 6 ×의 범위를 확인 Laemmli 47의 방법입니다. 마이그레이션에 ~ 2 kDa 변화 그의 태그 쪼개진된 6 ×의 분자량에 해당 관찰, 3.11; 단계로 계속 경우 일부 소화 되지 않은 단백질 남아 있다 Coomassie 파란 얼룩에 의해 감지 되, 투 석 가방에 직접 단백질의 밀리 그램 당 트 롬 빈의 ~0.2 U를 추가 하 고 추가 ~ 24 h. 4 ° C에서 품 어</li>
	<li>더 사용 크기 또는 이온 교환 크로마토그래피는 단백질 정화. EFSAM의 음이온 교환 크로마토그래피, 투 석 가방과 집중에서 단백질 솔루션 제거 ~는 10000 Da 분자량 컷오프로 한 원심 집중 장치를 사용 하 여 사진. 그 후, 다시 희석 솔루션 ~ 20-fold NaCl 무료 버퍼 (20 mM Tris, 5mm CaCl 2, 1mm DTT, pH 8)에.</li>
	<li>Prepacked 음이온 교환 열 단계 3.11에서에서 설명한 NaCl 무료 버퍼의 10 열 볼륨을 equilibrate. Equilibrate 로드 luer 잠금 주사기 dropwise 방식과 열 종료 솔루션의 꾸준한 흐름을 일으키는 원인이 되는 피하 주사기 압력 열을 통해 솔루션을 추진 하 여 아무 공기 방울을 포함 하는 버퍼를 사용 하 여. (예: 4 급 암모늄 기능 그룹으로 가교 된 agarose) 강한 음이온 교환기를 사용 하 여.</li>
	<li>NaCl 무료 (단계 3.11) 버퍼 열에 희석 단계 3.12에서에서 설명한 단백질 솔루션 로드.</li>
	<li>그라데이션에 단백질을 elute [즉, 0-60% (v/v)] NaCl 증가의 버퍼 (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5mm CaCl 2, 1mm DTT, pH 8) 2-펌프 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템을 사용 하 여. FPLC 시스템 ~1-1.5 mL 분수를 수집 하 고 모니터링 UV 280 nm 흡 광도 사용 하 여 단백질 차입 프로필을 설정 하 고 흐름 속도 0.5 mL/분</li>
	<li>차입 봉우리와 분수 뿐만 아니라 단백질 순도 Coomassie 파란 얼룩이 SDS 페이지 젤 Laemmli 47의 방법을 사용 하 여 관심사의 단백질에 포함 된 식별.</li>
	<li>풀 분수 보여주는 &gt; 95% (즉 분수 Coomassie 파란 얼룩이 젤에만 단일 단백질 밴드를 표시로 찍은) 투 석 가방 및 투 석 단계 3.8에서에서 설명한 대로 의해 관심의 실험적인 버퍼 교환으로.</li>
</ol> 4. 투 석 하 여 단백질을 포도 당-5-MTS 화학 부착.
<ol><li>준비 55 m m a N-(β-D-glucopyranosyl)-N의 재고 솔루션 '-[2-methanethiosulfonyl) 에틸] 10 mg의 100% (v/v) DMSO의 500 μ에 화합물을 용 해 하 여 우 레 아 (포도 당-5-MTS). 사용 하지 않는 포도 당-5-MTS-20에서 DMSO에서 solubilized 저장 ° c.</li>
	<li>준비 수정 1 리터에 ~ 60 μ M 단백질의 dialyzing 1.5 mL 수정에 대 한 단백질 견본 버퍼 20mm MOPS, 150 mM NaCl, 5mm CaCl 2와 0.1 m m TCEP, pH 8.3의 구성. 사용 하는 투 석 막 분자량 컷오프는 수정 되 고 단백질의 크기 보다 작은 (예: 17500 ~ 다 EFSAM에 대 한 3500 다 구분 사용).</li>
	<li>후 24 h 4 ° C에서 microcentrifuge 튜브로 투 석 가방에서 샘플을 전송. 2mm의 최종 농도 DMSO solubilized 포도 당-5-MTS 추가.</li>
	<li>주위 온도에서 1 h에 대 한 어둠 속에서 샘플을 품 어. 1 시간 잠복기 동안 혼합 솔루션 튜브의 부드러운 드려서 10 분 마다</li>
	<li>이후에, 다시 4.2 또는 원심 한 단계에서 설명한 대로 4 ° C에서 투 석 하 여 아무 환 원제를 포함 하는 최종 실험 버퍼에 단백질 교환. 적용 절차에 대 한 집중 ~1.5 mL 단백질 샘플을 &lt; 0.5 mL 이후에 실험 버퍼와 같은 집중에 희석. 반복이 농도 희석 단계 2 추가 번 총 exchange는 최소 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. EFSAM, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5mm CaCl 2, 실험적인 버퍼 pH 7.5 사용.</li>
	<li>투 석 또는 한 exchange 25 m m 염화 중 탄산염 또는 25 mM 암모늄 아세테이트로 각각 4.2와 4.5, 단계에서 설명한 대로 의해 분무 이온화 질량 분석에 대 한 샘플을 준비 합니다. 투를 사용 하 여, 모든 잔여 NaCl와 CaCl 2 소금 제거를 적어도 세 번을 교환 확인.</li>
	<li>정확한 질량을 결정 (예: ± 1 다) 분무 이온화를 사용 하 여 관심사의 단백질의 대량 분석 48 , 49. Methanethiosulfonate 화학 281.3 다 단백질에 추가를 통해 Cys thiol 각 공유 포도 당 뿐만 아니라 기대 질량 (360.4 다 포도 당 5 MTS에 대 한 추가 및 공유 하는 동안 그룹 2 떠나 그래서 채널 3 79.1 다 빼기 첨부 파일).</li>
</ol> 5. Modif 솔루션 NMR 평가ication 효율성과 구조 섭.
<li>확인 수정 된의 농도 <ol>단백질은 &gt; 포도 당 첨부 파일 및 최종 버퍼 교환 후 100 μ M. EFSAM에 대 한 추정 단백질 농도 UV 소멸 계수를 사용 하 여 280에서 1.54 (mg mL - 1) cm - 1 nm.</ol></li>
	<li>메우는 및 펄스 교정 및 10% (v/v) D 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic 산 (DSS)의 보충 60 μ M와 단백질 해결책 2 O 신호 잠금에 대 한. 높은 신호-잡음 사용 주파수 일치 5mm NMR 튜브에 600 μ 샘플, 트리플 공명 HCN 극저온 프로브를 갖춘 최소 600mhz 분석기에 삽입.</li>
	<li>이전 상세한 50 , 51 온도, 1 H와 15 N 청소 폭, 변이 및 증가에서 표준 1 H-15 N HSQC 스펙트럼 수집 특정 샘플에 대 한 적합 한 설정입니다. EFSAM 스펙트럼, 사용 20 ° C, 256 1 H 과도, 64 15 N 차원 증가 1 H 15 N 그런 후 폭 8, 000와 1800 헤르쯔, 각각 설정.</li>
	<li>당화 단백질 스펙트럼의 인수에 따라 추가 dithiothreitol (DTT) NMR 샘플 15 m m의 최종 농도를 1 M 주식에서. DTT 이황화 중재 첨부의 감소에 의해 단백질에서 포도 당 moiety를 제거 합니다.</li>
	<li>두 번째 1 H-15 N HSQC 수정 효율성 및 구조적 섭 포도 당 첨부 파일에 의해 발생을 평가 하기 위해 참조 스펙트럼 제공이 감소/수정 되지 않은 조건 하에서 취득.</li>
	<li>이전 52 자세한 NMRPipe를 사용 하 여 NMR 데이터 처리. 최소한 처리 데이터 변환, 단계적으로, 용 매 억제, 푸리에 변환 및 스펙트럼의 초기 시각화 포함 되어 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>아 미드 피크 농도 및 카라 53에 NEASY 플러그인을 사용 하 여 수정 및 감소 된 스펙트럼에 화학 변화 값을 측정 하 여 평가 수정 효율성. 모두는 포도 당에 연결 하 고 스펙트럼을 감소 Cys 아 미드의 피크 강도 평가를 확인 합니다. Cys 아 미드 두 스펙트럼에 안정적으로 있을 수 없습니다, 경우는 Cys에 인접 한 잔류물의 농도 사용 하 여 한 판독으로.</li>
	<li>Cys 감소 (즉, DTT 취급) 스펙트럼에서 아 미드의 강도 나눈 Cys 수정 스펙트럼에서 아 미드의 농도로 효율 계산 100 곱한: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq1.jpg">, 어디 내가 M Cys 수정 스펙트럼에 아 미드의 농도 이며 나 R Cys 감소 스펙트럼에 아 미드의 농도. 또는, 여러 아 미드 봉우리 위에 평균 효율 평가: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq2.jpg"> 효율성 i가 별도로 결정된 효율성 각 계산, 잔류물, 나, 그리고 n 계산에 사용 하는 잔류물의 총 수입니다.</li>
	<li>계산 화학 변화 차이 두 스펙트럼 15 N과 각 피크의 1 H 치수에서 관찰 하 고 더 큰 15 N 화학 변화 범위 사용에 대 한 정상화에서 화학 이동 섭 (CSP)는 다음 방정식: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq3.jpg">, 어디 ΔH 양성자 차원에 ppm 변화 이며 ΔN 질소 차원에서 ppm 변화.</li>

단백질 glycosylation 설탕 covalently 주로 아미노산 사이드 체인 관계를 통해 polypeptides에 연결 된 포스트 번역 상 수정입니다. 많은 포유류 단백질의 50%는 당화 54, 당화 단백질 수 이후에 있는 다양 한 바이오 바인딩 선호도 변경에서 효과, 단백질 폴딩, 채널 활동을 변경, 대상에 영향을 미치는 저하 및 셀룰러 (33에서 검토 한 결과) 몇 가지 이름을, 인신 매매에 대 한 분자. 포유류의 생리학에서 glycosylation의 중요 한 역할 구축 포유류 glycan 구조 33의 전체 다양성을 진화 하는 단백질의 몇몇 수백에 의해 분명 하다. 변경 N-및 O-glycosylation 패턴 연관 수많은 질병 전립선 (증가 감소), 유 방 (증가 감소)를 포함 하 여 간 (증가), 난소 (증가), 췌 장 (증가) 그리고 위 암 (증가) <s...

운영된 칼슘 (캘리포니아2 +) 저장 항목 (SOCE)는 면역 세포는 cytosol로 세포 외 공간에서 캘리포니아2 + 을 차지 하는 주요 통로 이다. T 세포, T 세포 수용 체 (오후) 원형질 막에 있는 항 원 단백질 tyrosine kinases ( 1,2,3검토)을 활성화 하는 바인딩합니다. 인 산화 폭포 phospholipase-γ (PLCγ)는 이후 diacylglycerol 및 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate (IP3에 막 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)의 가수분해를 중재의 활성화로 연결 ). IP3 은 응급실에서 농도 기온 변화도 아래로 흐름 IP3 수용 체 (IP3R) 바인딩과 그물 (ER)에 그로 인하여이 수용 체 수로 열고 허용 캘리포니아2 + 바인딩하는 작은 diffusible 메신저 cytosol ( 4에서검토)에 루멘. 수용 체 G 단백질 결합 및 다양 한 기타 고르기 및 비 고르기 셀 유형 리드에에서 티로신 키 니 아 제 수용 체에서 IP3 의 동일한 생산 및 IP3Rs의 활성화 신호.
유한 캘리포니아2 + 의 저장 용량은 응급실, IP3인-중재 릴리스 및 cytosolic 캘리포니아2 + 에서 결과 증가 일시적;만 그러나, 응급실 luminal 캘리포니아2 + 이 고갈 뿌리깊은 stromal 상호 작용 분자-1 (STIM1), 유형 효과-난 막 횡단 (TM) 단백질은 주로 응급실 막 5,,67에 발견. STIM1 루멘 지향 Ca2 + 감지 도메인을 EF-손 쌍과 마른 α-주제 (EFSAM) 구성 포함 되어 있습니다. Cytosolic 지향 코일 코일 도메인 3 개 ( 8에서 검토) 단일 TM 도메인에서 EFSAM에서 분리 된다. ER luminal 캘리포니아2 + 고갈, 시 EFSAM TM 및 코일 코일 도메인 10의 구조상 재배열을 일으키는 원인이 되는 불안정 결합 oligomerization 7,9 을 겪 습. 이러한 구조 변화 응급실 오후 접속점 11,12,13,14 오후 phosphoinositides 15, 와 상호 작용을 통해 STIM1의 트랩에 달 하다 16 및 Orai1 소 단위 17,18. Orai1 단백질은 조립 형태로 캘리포니아2 + 채널 19,20,,2122는 오후 소 단위. ER-오후 접합에서 STIM1 Orai1 상호 작용 촉진는 오픈 캘리포니아2 + 릴리스 활성화 캘리포니아2 + (CRAC) 채널 구조의 높은 농도에서 cytosol에 캘리포니아2 + 의 움직임을 가능 하 게 합니다 세포 외 공간입니다. 면역 세포에는 지속적인된 cytosolic 캘리포니아2 + 고도 CRAC 채널을 통해 유도 캘리포니아2 +-calmodulin/calcineurin 종속 dephosphorylation 이후 핵을 입력 하면 활성화 된 T-세포의 핵 요인의 고 T 세포 활성화 1,3를 홍보 하는 유전자의 transcriptional 규칙을 시작 합니다. STIM1 23,24 주 작동 근 유도 응급실 luminal 캘리포니아2 + 고갈 통해 결과 지속적인된 cytosolic 캘리포니아2 + 고도로 CRAC 채널 활성화의 과정은 공동으로 SOCE 25불린다. T-세포에 SOCE의 중요 한 역할은 STIM1와 Orai1에서 상속 변이 심한 결합 된 면역 결핍 증후군 3,,1926, 를 발생할 수 있습니다 입증 하는 연구에 의해 분명 하다 27. 정식 EF-손에서 궁극적으로 자체 협회 불안 결합 7, 로 이어지는 Ca2 + 조정의 손실을 통해 응급실 luminal 캘리포니아2 + 고갈 감지 후 SOCE를 시작 하는 EFSAM 28,29.
Glycosylation 공유 첨부 파일 올리고 당 구조, 일컬어 glycans, ER 및 Golgi ( 30,,3233검토) 다양 한 생 합성 단계를 통해의 처리입니다. 진핵생물에서 glycosylation의 두 가지 주된 유형이 있다: N-연결 된 및 O-연결, 특정 아미노산 및 atom 가교 결합에 따라. N-glycosylation에서 glycans, Asn의 사이드 체인 아 미드에 연결 그리고 개시 단계 응급실에서 발생 하는 대부분의 경우에는 polypeptide 사슬 루멘 34로 이동. N-glycosylation의 첫 번째 단계는 포도 당 (Glc)만 노 오 스 (남자), 및 N-acetylglucosamine (GlcNAc) (예: Glc3남자9GlcNAc2)는 ER에서 만들어진 14 설탕 코어 구조 이전 oligosaccharyltransferase 35,36여 막 지질. 분열 또는 포도 당 잔류물의 양도 등의 더 단계는 특정 glycosidases와 glycosyltransferases 응급실에서 촉매. 응급실을 두고는 골으로 이동 하는 일부 단백질은 처리 37추가 될 수 있습니다. Oglycosylation Ser 또는 Thr 잔류물의 사이드 체인 수 산 기 그룹에 일반적으로 glycans의 추가를 참조 하 고이 수정 골 복잡 한 33,34에서 전적으로 발생 합니다. Nacetylglucosamine, fucose, 갈 락 토스, 구성 될 수 있는 여러 오-glycan 구조 이며 각 단 당 류와 sialic acid 33순차적으로 추가.
아니 특정 순서 Oglycosylation의 많은 종류에 대 한 사전 요구 사항 확인 되었습니다 동안 일반적인 합의 순서 N와 연결 되었습니다-수정 연결: Asn-X-Ser/Thr/Cys, X 어떤 아미노산을 될 수 있는 프로 33제외 하 고. STIM1 EFSAM 두 이러한 합의 N-glycosylation 사이트 포함: Asn131-Trp132-Thr133와 Asn171-Thr172-Thr173. 실제로, 이전 연구 EFSAM Asn131 및 Asn171 38,39,,4041에서 포유류 세포에서 N-당화 수 나타났습니다. 그러나, 이전 연구의 SOCE에서 Nglycosylation의 결과 되었다 합동, 제안 억제, potentiated 또는 SOCE 활성화 38, 에이 포스트 번역 상 수정에 의해 영향을 주지 않습니다"외부 참조" = > 39,,4041. 따라서, EFSAM Nglycosylation의 기본, 생화학, 생물 및 구조 결과 대 한 연구는이 수정의 규제 효과 이해 하는 중요 한. 이러한 생체 외에서 실험에 균질 단백질의 높은 수준에 대 한 요구 사항으로 인해 포도 당 moieties EFSAM covalently 연결할 사이트 선택적 접근 방식을 적용 했다. 흥미롭게도, Asn131 및 Asn171 glycosylation EFSAM 코어 내 수렴을 홍보 STIM1이 중재 SOCE 42생물 속성 강화 구조 변경 발생 합니다.
Cys thiols glycosyl 그룹의 화학 첨부 파일 정액 작품 처음 시연 단백질 기능 43 , glycosylation의 사이트 효과 이해 하 고이 효소 무료로 접근의 유틸리티에 의해 잘 설립 되었습니다. , 44. 최근에 STIM1에 관하여 Asn131과 Asn171 잔류물 했다 Cys을 돌연변이 glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] covalently 무료 thiols 42에 포도 당을 연결 하는 데 사용 되었다. 여기, 우리 뿐만 아니라 mutagenesis 통합 수정에 대 한 사이트 특정 Cys의 잔류물을 사용 하지만 빠르게 수정 효율성 및 구조적 평가 솔루션 핵 자기 공명 (NMR) 분광학은 또한 적용 됩니다이 이렇게 설명 섭은 glycosylation 결과로입니다. 특히,이 일반적인 방법론 중 O-의 효과 연구에 쉽게 적응 또는 N-glycosylation의 recombinantly 단백질을 생산.

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA 중합효소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>1.3단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1163</td><td>1.6단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>DpnI 제한 효소</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>1.8단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>Presto 미니 플라스미드 키트</td><td>GeneAid, Inc.</td><td>PDH300</td><td>1.16단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>BL21 DE3 코돈 (+) 대장균</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>230280</td><td>2.1단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>DH5a 대장균</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>1.9단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>0.22mm 주사기 필터</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>2.3단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>HisPur Ni2+-NTA 아가로스 수지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88221</td><td>3.3단계에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>3,500 Da MWCO 투석 튜브</td><td>BioDesign, Inc.</td><td>D306</td><td>3.8, 3.16, 4.2, 4.5 및 4.6단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>소 트롬빈</td><td>BioPharm 연구소, Inc.</td><td>SKU91-055</td><td>3.9단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>5mL HiTrap Q FF 음이온 교환 컬럼</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td><td>3.11단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>포도당 -5-MTS</td><td>토론토 연구 화학, Inc.</td><td>G441000</td><td>4.1단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 한외여과 원심 농축기</td><td>Sartorius, Inc.</td><td>VS2001</td><td>3.11, 4.2, 4.5 및 4.6 단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>PageRuler 염색되지 않은 광범위한 단백질 사다리</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26630</td><td>3.7, 3.10 및 3.15단계에서 사용</td></tr><tr><td>HiTrap Q FF 음이온 교환 컬럼</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td><td>3.12단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>AKTA 순수 고속 단백질 액체 크로마그래프 시스템</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>29018224</td><td>3.14단계에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>600MHz Varian Inova NMR 분광계</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>5.2단계 및 5.5단계에서 사용합니다.</td></tr></tbody></table>

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 glycosylation에 대 한 대상 시스테인 thiols

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal 상호 작용 분자-1 (STIM1)은-내가 막 횡단 단백질 바인딩과 그물 (ER) 및 플라즈마 막 (오후)에 위치 해 있습니다. ER-상주 STIM1 오후 Orai1 채널 알려져 주 캘리포니아2 + 신호 과정 면역 응답을 구동 하는 운영된 칼슘 (캘리포니아2 +) 항목을 저장 하는 과정에서의 활동을 통제 한다. STIM1 Ca2 + 감지의 도메인 내에서 분자 두 luminal Asn 사이트에 닢 Nglycosylation를 겪 습. 그러나,는 생화학, 생물, 그리고 N-당화 STIM1의 구조 생물학적 효과 쉽게 균질 N-당화 단백질의 높은 수준을 얻을 수 없음 인해 최근까지 제대로 이해 했다. 여기, 우리가 시험관에 화학 접근의 단백질 구조와 메커니즘에 Nglycosylation의 기본 효과 이해 하는 데 적용 하는 특정 단백질 사이트로 포도 moieties 부착 구현을 설명 합니다. 우리 모두 효율성의 수정 뿐만 아니라 단일 샘플 포도 당 첨부 파일의 구조 결과 평가 솔루션 핵 자기 공명 분광학을 사용 하 여. 이 이렇게 자연에서 발견 하는 무수 한 당화 단백질 연구를 쉽게 적응 수 있습니다.

이 방법의 첫 번째 단계 하려면 포도 당-5-MTS. EFSAM를 사용 하 여 수정할 수 있는 Cys의 잔류물을 후보 glycosylation 잔류물의 mutagenesis 아무 특별 한 고려 사항 이전에 만들어질 필요가 없는 생 Cys 잔류물에는 mutagenesis입니다. 그러나, 네이티브 Cys 잔류물 설명된 화학을 수행 하기 전에 수정 불가능 잔류물을 변경 해야 합니다. 최소한 기본 구조 효과, 우리 관심사의 단백질의 글로벌 시퀀스 정렬 수행 제안 하 고 가장 자주 생 Cys에서 position(s) 발견 다른 잔류물 확인. 다른 유기 체에서 자연스럽 게 발생 하는 이러한 다른 잔류물에 Cys 돌연변이 단백질 구조에 최소 영향을 할 수 있습니다. 생 Cys의 잔류물이 엄격 하 게 보존 하는 경우는 가장 구조적으로 유사한 Cys Ser을 변경 하는 것이 좋습니다. 그림 1 에서는 일반적인 PCR mutagenes...

당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

이 절차의 전반적인 목표는 천연 글리코실화된 부위에서 부위 유도 돌연변이 유발을 통해 단백질에 시스테인 잔기를 통합하고 체외 포도당 부착 및 평가 접근 방식을 사용하여 글리코실화의 효율성과 구조적 효과를 평가하는 것입니다. 이 방법은 단백질 당화(glycosylation)의 구조적 결과는 무엇이며 이러한 변형이 기능의 기본 메커니즘에 어떤 영향을 미치는지와 같은 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 당화(glycosylation)를 연구하거나 처리하는 데 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다.이는 매우 효율적이며 구조 섭동과 효율성을 모두 신속하게 평가할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 변형된 당화 패턴이 여러 암 및 신경 퇴행성 질환과 관련이 있기 때문에 질병 치료로 확장됩니다. 이 방법은 천연 글리코실화된 단백질의 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 이러한 범위의 질병에 기여할 수 있는 당화(glycosylation) 패턴을 변경하는 방법에 대한 매우 필요한 정보를 제공할 수도 있습니다.발현 벡터에 단일 시스테인 돌연변이를 도입하려면 두 개의 개별 PCR 반응 튜브를 준비합니다. 첫 번째 튜브에는 전방 돌연변이 유발 프라이머를 추가하고 두 번째 튜브에는 역 돌연변이 유발 프라이머를 추가합니다. 두 튜브에 1X PCR 완충액의 최종 농도를 추가합니다.그런 다음 두 개의 개별 PCR 반응 튜브에 대한 5주기 프로그램을 설정합니다. 다섯 번째 주기가 끝날 때 섭씨 72도에서 7분 30초의 연장 시간을 추가합니다. 5 사이클이 완료된 후 단일 튜브에 두 개의 개별 PCR 반응을 혼합하고 튜브를 약 3 초 동안 원심 분리 한 다음 동일한 PCR 조건에 따라 추가로 20 사이클을 반복합니다.다음으로, 120 볼트에서 1% DNA 아가로스 겔에 15마이크로리터의 샘플을 40분 동안 실행합니다. 그런 다음 밀리리터당 0.5mg의 브롬화 에티듐이 함유된 물에 젤을 담그고 실온에서 30분 동안 흔듭니다. 그런 다음 302나노미터 파장의 자외선 아래에서 템플릿의 증폭을 확인합니다.그 후, 나머지 25 마이크로 리터의 PCR 반응 혼합물에 0.5 마이크로 리터의 DPN1 제한 효소를 첨가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 30분 동안 배양하여 메틸화된 템플릿 DNA를 소화합니다. 그런 다음, 약 5-10 마이크로리터의 분해된 혼합물을 100 마이크로리터의 열 충격 가능 대장균 세포에 첨가하고 얼음 위에서 60분 동안 배양합니다.그런 다음 건식 열 블록에서 섭씨 42도에서 45초 동안 세포-DNA 혼합물에 열 충격을 가합니다. 그런 다음 즉시 혼합물을 얼음에서 3분 동안 배양합니다. 다음으로, 900마이크로리터의 LB 육수를 세포에 첨가하고 현탁액을 멸균된 14밀리리터의 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.섭씨 37도에서 190rpm으로 90분 동안 계속 흔들면서 배양합니다. 그런 다음 원심분리된 세포 펠릿을 항생제가 보충된 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다.다음 날, 플레이트의 단일 콜로니를 5ml의 항생제가 보충된 LB 배지에 무균 접종합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 지속적으로 흔들면서 배양을 성장시킵니다. 열 충격 처리를 통해 시스테인 잔류 돌연변이 플라스미드를 E.coli 세포로 전환한 다음 항생제가 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양액을 성장시킵니다.다음날, 카나마이신이 보충된 LB 한천 플레이트에 150마이크로리터의 세포 현탁액을 직접 펴고 하룻밤 배양을 위해 플레이트를 섭씨 37도에서 유지합니다. 다음 날, 삼각 플라스크에서 20ml의 LB 배지에 단일 콜로니를 무균으로 옮기고 섭씨 37도에서 하룻밤 배양을 위해 떠납니다. 다음날, 하룻밤 배양을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.그런 다음, 하룻밤 동안 액체 배양을 2, 400 배 G에서 15 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화합니다. 다음으로, 10 밀리리터의 M9 최소 배지를 세포 펠릿에 첨가 한 다음 세포 혼합물을 카나마이신을 함유 한 1 리터의 M9 배지에 현탁시킵니다. 600나노미터의 광학 밀도가 약 0.6-0.8에 도달할 때까지 약 190rpm에서 지속적으로 흔들면서 섭씨 37도에서 M9 액체 배양을 계속 성장시킵니다.그런 다음 단백질 발현을 유도하기 위해 M9 배양액에 200마이크로몰의 IPTG를 추가하고 배양액이 하룻밤 동안 자라도록 둡니다. 다음날, 대략 10, 000 시간 G에 대략 10, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 원심 분리해서 밤새 배양에서 박테리아 세포를 펠릿으로 만든다. 10 밀리리터 전동 이송 피펫을 사용하여 약 40 밀리리터의 균질화 완충액에서 동결된 박테리아 세포 펠릿을 균질화합니다.그런 다음 균질액을 혼성화 오븐에서 일정한 회전으로 90분 동안 배양합니다. 대략 15, 불용해성 펠릿에서 녹는 단백질 조각을 분리하기 위하여 40 분 동안 8 섭씨 온도에 G 대략 15, 000 시간 G에 혼합물을 분리기로 만드십시오. 그런 다음, 상등액에 50 % 부피 니켈 니트릴로 트리아세트산 아가로 오스 비드 슬러리를 첨가하고 실온에서 90 분 동안 혼성화 오븐에서 반전으로 배양한다.다음으로, 중력 흐름 단백질 정제 컬럼을 사용하여 니켈에 헥사히스티딘 태그가 붙은 단백질이 부착된 아가로스 비드를 수집합니다. 마지막으로 수집된 아가로스 구슬을 세 번 씻습니다. 단백질을 일련의 2밀리리터 분획으로 용리합니다.다음으로, Coomassie blue stained SDS-PAGE 겔을 실행하여 용출된 분획에서 정제된 hexahistidine 태그가 지정된 단백질을 확인합니다. 용출된 단백질 분획을 3, 500 달톤 분자량 컷오프를 가진 투석막에 모으고 자기 교반으로 하룻밤 동안 섭씨 4도의 재접힘 완충액에서 배양합니다. 그런 다음 단백질 1mg당 약 1단위의 트롬빈을 투석막의 고형 단백질에 추가하고 다시 섭씨 4도에서 하루 동안 배양합니다.다음날, 투석 부대에서 단백질을 제거하고 10, 000 daltons 분자량 커트오프를 가진 초여과 장치 원심 집중 장치를 사용하여 대략 10배 집중하십시오. 그런 다음 단백질 농축액을 염화나트륨이 없는 재접힘 완충액에서 약 20배 다시 희석합니다. 단백질을 정제하려면 동일한 무염화나트륨 완충액으로 평형을 이룬 사전 포장된 음이온 교환 컬럼에 단백질을 로드합니다.refolding buffer를 포함하는 1몰 sodium chloride의 0-60% gradient에서 단백질을 용리하기 시작합니다. 합쳐진 단백질 분획을 투석 백에 옮깁니다. 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 투석 단계를 수행하여 단백질을 최적의 염화나트륨 몰 농도로 실험용 재접힘 완충액으로 교환합니다.먼저, 단백질의 당화(glycosylation)를 위해 1.5ml의 약 60마이크로몰 단백질을 1리터의 변형 완충액으로 투석합니다. 24시간 후 섭씨 4도에서 변형된 단백질을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 DMSO 가용화 포도당-5-MTS를 최종 농도인 2밀리몰에 첨가합니다. 10분마다 마이크로 원심분리기 튜브를 가볍게 두드리면서 주변 온도에서 한 시간 동안 어두운 곳에서 샘플을 배양합니다.배양 후 섭씨 4도에서 투석을 수행하여 단백질을 최종 실험용 완충액으로 재교환합니다. 전기 분무 이온화 질량 분석법을 사용하여 단백질의 정확한 질량을 측정합니다. 마지막으로, 용액 NMR을 사용하여 변형 효율을 계산하고 단백질에서 당화 낭 잔기의 구조적 변화를 식별합니다.성공적인 돌연변이 PCR 증폭 템플릿 DNA가 이 대표적인 1%DNA 아가로스 겔에 표시되어 있습니다. PCR 에 의해 증폭되지 않은 DNA ladder 및 동등한 양의 template DNA가 겔의 대조군으로 사용됩니다. 고강도 에티듐 브로마이드 염색이 있는 최상부 밴드는 원하는 크기의 증폭된 템플릿을 보여줍니다.다음으로, 단백질을 음이온 교환 컬럼을 사용하여 정제하였다. 크로마토그램은 280나노미터에서 관찰된 파란색의 용리 프로파일을 보여주며, 0.6 어금니까지 농도가 증가하면서 빨간색으로 표시된 염화나트륨 구배에 대해 용리되는 3개의 피크를 나타냅니다. 하단 패널은 단백질 분획의 Coomassie 파란색 염색 SDS-PAGE 젤을 보여줍니다.시스테인 잔기의 당화(glycosylation)는 전기 분무 이온화 질량 분석법에 의해 결정되었습니다. 크로마토그램은 시스테인 잔류물의 당화(glycosylation) 전후의 변형되지 않은 단백질과 변형된 단백질의 질량을 보여줍니다. 확인을 위해, 잔류 특이적 아미드 화학적 이동의 HSQC 스펙트럼 오버레이를 보여주는 용액 NMR을 수행하여 글리코실화 단백질의 변형 및 구조적 섭동을 모두 표시했습니다.마스터링되면 돌연변이 유발에서 NMR 평가에 이르는 모든 단계를 프라이머 합성, DNA 염기서열 분석 및 질량 분광 서비스를 위한 대기 시간을 제외하고 약 12일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 기준선 제어 측정으로 티올 변형이 없는 경우 시스테인 돌연변이의 구조적 및 생물물리학적 영향을 평가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 안정성, 2차 구조, 이온 결합, 단백질-단백질 상호 작용 평가와 같은 다른 방법을 수행하여 기본 단백질 기능의 생물물리학적 특성이 당화에 의해 어떻게 영향을 받는지 밝힐 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 칼슘 신호 전달 분야의 연구자들이 아스파라긴 131 및 아스파라긴 171의 역할과 저장 작동 칼슘 진입과 관련된 기질 상호 작용 분자 1 칼슘 신호에서 글리코실화의 역할을 개별적으로 그리고 누적적으로 평가할 수 있는 길을 열었습니다.

targeting-cysteine-thiols-for-vitro-site-specific-glycosylation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 하나의 세포에서 형광을 사용하여 conformational 변화의 특정 사이트 분석과 함께 막 단백질의 이온 전달의 속도론을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 이온 채널 전송기 및 이온 펌프에 적응하고 단백질 subunits 사이의 거리 제한을 결정하기 위해 이용하실 수 있습니다.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

의 시스테인 잔류의 thiol 그룹의 용매 접근성을 분석하는...

시스테인 잔류 물을 용매 접근성에 대한 분석<em&gt; 옥수수 rayado fino 바이러스</em에서 생산&gt; 바이러스 같은 입자<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLPs에 펩티드의&gt; 식물과 교차 연결

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

이 기사에서는 전자 상자성 공명 연구를 위한 5층 리간드 게이트 채널의 위치 지정 스핀 라벨링 및 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 모든 멤브레인 단백질에 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 재구성 방법은 정의된 지질 시스템에서 거시적 및 단일 채널 전류의 패치 클램프 측정에도 사용할 수 있습니다.

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

이 프로토콜은 시약 정제 반응 조건 bioconjugate 정화 및 bioconjugate 특성화를 포함하여 말레이 미드로 단백질을 함유하는 시스테인의 바이오 콘쥬 게이션에 필요한 중요한 단계를 자세히.

단백질 Bioconjugates의 합성<em&gt;를 통해</em&gt; 시스테인 - 말레이 미드 화학

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

우리 면역 글로불린 겹 biolayer 간섭계, 등온선 적정 열 량, 및 x-선 결정학에 의해 glycoproteins의 생물 및 구조적 특성에 대 한 접근 방법 제시.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

이 프로토콜에서 포드는 phenyoxadiazolyl 메 틸 sulfone 기반 시 약 쓰이므로, 특히 항 체의 thiols 화물의 사이트 선택 첨부 파일에 대 한 종합을 설명 합니다. 또한, 합성 및 포드 베어링 bifunctional chelator 및 모델 항 체에의 활용의 설명 합니다.

합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

유전코드 확장은 정의된 부위에서 담체 단백질에 바이오트호고날 기능군을 베어링하는 부자연스러운 아미노산의 도입을 위해 적용된다. 바이오트호고날 기능은 균질성 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 탄수화물 항원을 선별적으로 결합하는 데 더 많이 사용된다.

백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

배우세요 재조합 단백질의 사이트별 글리코실화 방법을 통해 단백질 구조와 기능 변화를 평가하는 기술입니다. 이 방법은 구조생물학 및 단백질 공학 연구에 효율적으로 활용됩니다.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

더 많은 동영상 탐색