Name: ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 학습하세요 ATAC-seq를 사용하여 인간 T 림프구에서 크로마틴 접근성을 분석하는 방법을. 고속 시퀀싱을 통해 게놈 전체 조절 요소를 식별하고 후성유전학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 이스라엘 과학 재단 (그랜트 748/14) 지원, 마리 퀴리 통합 부여 (CIG)-FP7 명 20013 CIG 618763와 난 코어 프로그램의 계획 및 예산 위원회와 이스라엘 과학 재단 부여 번호 41/11.

모든 절차의 바 Ilan 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 및 프로토콜 실험 승인 위원회에서 제공 하는 지침을 따릅니다.
 1. 정화의 순진한 사람의 CD4 + 세포 및 T 도우미 1 (Th1), Th2 세포 분극 참고: 우리가 냉동된 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)에서 시작 하는 절차를 설명 하는 여기. 첫 번째 단계는 CD4 + 세포 microbeads를 사용 하 여 격리 이루어져 있고 열 일반적으로 CD4 + 세포의 95% 보다 더 우리에 게. 그러나,이 단계는 각 실험실에서 기본 프로토콜에 따라 달라질 수 있습니다. T 세포 활성화와 양극 화에 대 한 프로토콜 Jenner 외에서 수정 된 (2009 년) 18. 절연의 CD4 + 세포 10 백만 PBMCs 제공에서 CD4 + 세포의 4-6 백만에 상승. 두 개의 플라스 크에 분할 Th1 아래 성장와 저조한 3-5 백만 Th1 및 Th2 세포 단지 1 주일 이내 조건 Th2 편광.
 참고: 시작 하기 전에 4 ° c 원심 분리기 진정.
<li>녹여 1 mL 인간 PBMCs의 <ol>(10 7 세포) 포함 하는 보충 1% 페니실린 스, 2 mM L-글루타민, 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 RPMI 매체의 10 mL 50 mL 튜브에. 500 x g 5 분 제거는 상쾌한에 centrifuge 고 보충된 RPMI 매체의 15 mL의 멸 균 25 mL 피 펫 셀 resuspend. T75 문화 플라스 크 (살 균 25 mL 피 펫)와 셀 전송.</li>
	<li>셀 (37 ° C, 5% CO 2) 습도 인큐베이터에 하룻밤 둡니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 살 균 25 mL 피 펫과 부동 셀을 전송합니다. Trypan 블루 제외 하 여 휴대폰 번호와 생존 확인.</li>
	<li>격리 CD4 + 세포 10 백만에서 라이브 CD4 + microbeads 제조 업체에 따라 열을 사용 하 여 긍정적인 선택에 의해 비 점착 PBMCs &#39; s 추천 (테이블의 재료/장비 참조) 다음으로 수정: 10 7 PBMCs 30 µ L의 PBS에 0.5 %BSA 120 µ L에서 CD4 microbeads 표시 됩니다.</li>
	<li>는 RhIL-2 (10 ng/mL), 플레이트-바인딩 안티-CD3 (5 µ g/mL) 및 수용 성 안티-CD28 (2 µ g/mL) 72 h에 대 한 CD4 + T 세포를 활성화합니다. Th1 분극에 대 한 rhIL-12 (20 ng/mL)와 안티-일리노이-4 (10 µ g/mL)를 추가 합니다. Th2 분극에 대 한 추가 rhIL-4 (40 ng/mL)와 안티-IFN-γ (10 µ g/mL).</li>
	<li>셀 추가 7 일 rhIL-2 (10 ng/mL)의 존재와 동일한 편광 cytokines (rhIL-12 Th1 및 Th2 rhIL-4)에 대 한 문화.</li>
</ol> 2. 핵 격리 참고: ATAC seq 그대로 핵 하 여 수행 됩니다. 세포의 용 해 버퍼 포함 0.05 %nonylphenyl 폴 리 에틸렌 글리콜 기본 인간 Th1 및 Th2 세포에서 핵을 격리 하기 위한 보정 되었다 (참조 테이블의 재료/장비). 이 단계는 실험실 시 약 및 셀 보정 하는 것이 좋습니다. 부족 한 세제에서 그대로 세포의 과잉 이항 반응의 효율성을 줄인다. 세포 세포의 용 해 효율 셀의 총 수를 기준으로 핵 (trypan 블루 긍정적인 세포)의 수에 의해 결정 됩니다. 
참고: 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 m m NaCl, 3 m m MgCl 2)를 준비 합니다. 4 스윙 물통 회전자는 원심 분리기에 진정 ° C. 판 고정된 각도 원심 분리기 대신 스윙 양동이 원심 분리기에 셀 셀/핵 손실을 감소. 핵 또는 셀 손실, 삭제는 상쾌한 때에 신중 하 게 피펫으로 피하려고.
<li>추가 <ol>신선한 nonylphenyl 폴 리 에틸렌 글리콜 (0.05%의 최종 농도) 하 고 protease 억제제 (1 x의 최종 농도)을 사용 하기 전에 즉시 차가운 세포의 용 해 버퍼를 x 100. 얼음에 버퍼를 유지</li>
	<li>그들의 양과 trypan 블루 메서드를 사용 하 여 생존 능력 결정 하 수 T 세포. 더 높은 일반적인 소화에 90%의 결과 보다 낮은 생존.</li>
	<li>1.5 mL microtubes 전송 0.5 x 10 6 T 세포 (Th1 또는 Th2). 4에서 5 분 동안 500 x g에서 스핀 다운 ° c.</li>
	<li>찬 인산 버퍼 (PBS) 염의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 4에서 5 분 동안 500 x g에서 스핀 다운 ° c.</li>
	<li>감기 resuspend 셀 펠 릿 1 mL에 lysis 버퍼 (nonylphenyl 폴 리 에틸렌 글리콜 및 protease 억제제 포함). 얼음에 튜브를 유지. 핵을 방해 하지 않으려면 부드럽게 피 펫.</li>
	<li>신속 하 게 10 µ L을 자동된 셀 카운터 셀 개수 구하기 lysed 세포 microtube 얼음에 있는 동안. 이 단계는 핵의 손상을 방지 하려면 5 분을 넘지 말아야 한다. 셀의 최소 80 %lysed 한다.</li>
	<li>계속 이항 반응으로 즉시입니다. 얼음에 준비 된 핵을 계속</li>
</ol> 3. 이항 반응 참고:이 단계에서 격리 된 핵은 알을 품을 간결한 Tn5 transposase (TDE1) 로드 NGS 시퀀싱에 대 한 어댑터와 함께. 활동적인 Tn5는 동시에 DNA를 조각 하 고 게놈 (tagmentation 프로세스)의 접근 가능한 지역으로 어댑터를 ligates. 핵 및 Tn5 transposase 사이의 비율은 액세스할 수 chromatin에서 우선 분열에 대 한 중요 합니다. 이 프로토콜은 100 μ 반응 볼륨에 100000 핵에 대 한 보정 됩니다. 그러나, 반응 확장할 수 있습니다.
<ol><li>37 열 통에 온도 설정 ° c.</li>
	<li>1.5 mL microtube 전송 100000 핵.</li>
	<li>부드럽게와 4 ° C에서 10 분 동안 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 제거.</li>
	<li>에 지정 된 표 1 핵 전위 반응 구성 요소를 추가.</li>
	<li>부드러운 pipetting으로 resuspend.</li>
	<li>부드러운 떨고 (500 rpm)와 함께 30 분 동안 37 ° C에서 열 통에 이항 반응을 품 어. 
	참고: DNA 정리 고체 상 가역 immobilization 구슬 19에 의해 수행 됩니다 (참조 테이블의 재료/장비) 또는 PCR 정화 열. 정리의 끝에, 10 mM Tris HCl, pH 8의 20 µ L에 DNA 파편을 elute. 차입 버퍼에 EDTA를 방지.</li>
</ol> 4. ATAC seq 라이브러리의 PCR 농축 참고:이 단계 삽입 어댑터 ATAC seq 라이브러리 즉, DNA 파편을 증폭 하는 목적 이다. 같은 차세대 시퀀싱 레인에서 여러 ATAC seq 라이브러리의 혼합 수 있도록 (&#34; 멀티플렉싱 &#34;) 사용 unindexed 모든 샘플에 대 한 입문서 1 (Ad1_noMx) 1와 다른 색인 (바코드) 뇌관 2 (광고 2.1-2.24) 각 샘플에 대 한 1. 뇌관 시퀀스 테이블의 재료/장비 보충된 제공 됩니다.
<ol><li>초기 PCR 증폭 참고: 뇌관 1 (Ad1_noMx) 및 뇌관 2 작업 농도 25 µ M. 모든 프라이 머는 25 µ m에서 100 µ M의 원래 재고 희석. PCR 반응의 모든, 뇌관 1 (Ad1_noMx) 및 인덱싱된 뇌관 2 중 하나만 사용 합니다.
	<ol><li>추가할 PCR 반응의 구성 요소에 지정 된 표 2로 살 균 PCR 튜브.</li>
		<li>장소 PCR 열 cycler에 튜브와 표 3에 사이클링 조건을 사용 하 여 PCR 증폭을 수행.</li>
	</ol></li> <li>추가 확대 주기의 수의 평가 참고: 추가 PCR 주기 수 도서관 조각 f의 충분 한 금액을 산출 해야 한다또는 성공적인 차세대 시퀀싱 실행, GC를 방지 하 고 바이어스 20 크기를 최소화 하는 동안. 최적의 라이브러리 단편 증폭에 필요한 PCR 주기 (N)의 수의 결심 정량 PCR (정량)에 의해 이루어집니다.
	<ol><li>희석 뇌관 1 (Ad1_noMx)과 2 (초기 라이브러리 증폭에 사용) 25 µ M에서 6.25 µ m.</li>
		<li>표 4에서 제시 된 대로 광학 PCR 튜브 또는 접시에 구성 요소 추가.</li>
		<li>정량 악기과 사이클에 지정 된 테이블 5.</li>
		<li>추가 확대 주기 (N)의 필요한 수를 예상 하려면 x 축 및 y 축에 상대 형광 (RFU)에 주기 수 플롯.</li>
		<li>추가 확대의 수 주기 (N)를 정량 반응에 고원에 도달 하는 사이클의 수의 1/3 이다. 그림 2는 RFU (두꺼운 녹색 선) ~ 2,350 상대 형광 단위, 정점에 도달 하는 3 개의 ATAC seq 라이브러리에 대 한 예제를 제공 합니다. 최대 금액 (783 RFU, y 축에 표시 된)의 1/3은 증폭 된다 PCR 주기 수 8 사이클 라이브러리 (빨간색과 파란색 증폭 곡선)의 두 및 9 PCR 주기 세 번째 라이브러리 (분홍색)에 해당.</li>
	</ol></li> <li>최종 PCR 증폭 <ol><li>PCR 반응의 나머지 45 µ L를 증폭. 증폭 반응 단계 4.1.2 열 cycler에서에서를 포함 하는 PCR 튜브를 놓습니다. 표 6에 설명 된 PCR 프로그램을 실행 합니다. 증폭 사이클 (N)의 이전 결정된 (단계 4.2.5) 번호를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 5. ATAC Seq 라이브러리 선택 크기 참고: 우리의 경험, 증폭된 ATAC seq 라이브러리의 크기 선택 향상 차세대 시퀀싱 결과 그것에서 높은 분자량 도서관 파편을 제거 하기 때문에 최종 ATAC seq 라이브러리. 
참고: 실 온 사용 하기 전에 30 분 따뜻한 자석 구슬 수. 
신선한 70% 에탄올 nuclease 무료 물에 준비.
<ol><li>혼합 하 여 자석 구슬 resuspend.</li>
	<li>Nuclease 무료 물 ATAC seq 라이브러리 (단계 4.3.1에서에서 얻은)에 추가 하 고 최대 100 µ L를가지고.</li>
	<li>추가 50 µ L (0.5 x) resuspended DNA 바인딩 자석 구슬 증폭된 라이브러리의 100 µ L의. 적어도 10 배를 위아래로 pipetting으로 혼합. 실 온에서 5 분에 대 한 샘플을 품 어. 필요한 경우, 신속 하 게는 microtubes 아래로 회전.</li>
	<li>는 상쾌한 자석 구슬 구분 2 분에 대 한 적절 한 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓습니다. 2 분 후에 상쾌한 새로운 microtube 전송.</li>
	<li>Pipetting는 상쾌한의 볼륨을 측정 하 고 자석 구슬의 0.7 x를 추가 합니다. 10 번 이상 아래로 pipetting으로 믹스.</li>
	<li>실 온에서 5 분을 품 어. 2 분에 대 한 마그네틱 스탠드에</li>
	<li>후 2 분 외피는 상쾌한을 삭제 합니다. 추가 200 µ L 갓 만든 70% 에탄올 튜브 마그네틱 스탠드에 있는 동안 구슬 씻어.</li>
	<li>계속 30에 대 한 자석에 microtube s 고 삭제 에탄올. 반복 단계 5.7.for 2 개의 최종 에탄올 세척.</li>
	<li>완전히 제거 나머지 에탄올 튜브 자석에은 구슬 5 분 동안 건조 하자. 필요한 경우, 짧게는 microtube 스핀. P10 피 펫 팁과 에탄올의 흔적 제거.</li>
	<li>자석에서는 microtube를 제거 하 고 22 µ L 10 mM Tris HCl, pH 8의 추가. EDTA를 포함 하는 버퍼에서 ATAC seq 라이브러리 elute 하지 마십시오.</li>
	<li>실 온에서 2 분 동안 튜브를 품 어 그리고 마그네틱 스탠드에 장소.</li>
	<li>솔루션은 분명 때 새로운 살 균 microtube eluted 라이브러리의 20 µ L 전송.</li>
	<li>저장소 크기 선택 ATAC seq 라이브러리-20에 ° c.</li>
</ol> 6. ATAC Seq 라이브러리의 품질 분석 <ol><li>실시간 PCR에 의해 ATAC seq 라이브러리의 품질의 유효성 검사 참고: 신호 대 소음 비의 다음-세대 이전 ATAC seq 라이브러리를 평가 하는 것이 중요 하다 시퀀싱. 이렇게 양이 많은 PCR (정량)를 사용 하 여 접근 가능 하 고 액세스할 수 loci에서 DNA 파편의 상대적인 양을 결정 합니다. 액세스할 수 없는 loci (부정적인 제어, chr1:48, 137, 860-48,137,934 및 chr1:193, 093, 748-193,093,827) 뇌관 쌍 1와 2에 의해 증폭 됩니다. 액세스 가능한 loci (긍정적인 제어, chr19:30, 336, 166-30,336,253와 chr19:11546154-11546237) 뇌관 쌍 3와 4에 의해 증폭 됩니다. 긍정적이 고 부정적인 loci 인간의 CD4 + 세포 (인코딩 accessions ENCSR000EQE 및 ENCSR000EQG)의 chromatin 접근성 (국토 안보 부-seq) 프로필에서 정의 되었다. 네거티브 뇌관 1 큰 heterochromatic intergenic 지역 (230 kb TRADB2와 FOXD2에서 88 킬로바이트)에 위치 해 있습니다. 부정적인 통제 지역 2 CDC73 유전자의 첫 번째 intron 이내입니다. 뇌관 쌍 3는 오픈 chromatin 지역 내 긍정적인 긍정적인 뇌관 쌍 4 동안  E (CCNE1) 유전자의 하류 중심 이다 단백질 키 니 아 제 C 기판 80 K-H (PRKCSH)의 발기인 내. 중요 한 것은, 이러한 제어 loci 인코딩 프로젝트 3에서 그들은 광범위 한 종류의 인간 세포에서에서 ATAC seq 라이브러리 모니터링에 적용할 수 있는 제안 다른 인간 세포 종류에 접근의 유사한 패턴을 표시 합니다. 뇌관 효율성과 모든 뇌관 쌍의 특이성은 정량 (인간의 Th 세포)에서 게놈 DNA의 직렬 희석 및 획득된 증폭된 제품의 녹는 곡선 분석에 의해 확인 했습니다.
	<ol><li>게놈 DNA를 상업적으로 사용할 수를 사용 하 여 격리 (참조 테이블의 재료/장비) 키트.</li>
		<li>증폭된 ATAC seq 희석 도서관 1:10 (1 µ L 도서관 + nuclease 무료 물 9 µ L)와 ~ 5 ng / µ L을 genomic DNA.</li>
		<li>반응 혼합물 (표 7) 3 중에서 반응을 수행 하는 계정으로 각 긍정적이 고 부정적인 제어 뇌관 쌍에 대 한 준비.</li>
		<li>정량 마스터 혼합 공급 업체에서 권장 하는 프로토콜에 따라 정량 Pcr 열 cycler에서 품.</li>
		<li>분석 정량 악기에 결과 &#39; s 소프트웨어 (테이블의 재료/장비 참조). 컨트롤 샘플으로 게놈 DNA를 선택 합니다. 얻은 값 액세스할 수 영역 (긍정적인 제어 뇌관에 의해 증폭)의 농축을 나타냅니다. 예를 들어 표 8에 표시 됩니다. 
		참고: 평균 라이브러리 크기와 농도의 추정: ATAC seq 라이브러리에서 DNA 파편의 크기 분포는 제조 업체에 따라 높은 감도 자동된 전기 영동 시스템에 의해 결정 됩니다 &#39; s 지시. 그것은 dsDNA 고감도 키트 및 각 DNA 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 fluorometer에 샘플 농도 측정 하는 것이 좋습니다. 
		참고: 다음-세대 시퀀싱-수식을 사용 하 여 각 ATAC seq 라이브러리의 몰 라이브러리 멀티플렉싱, 이전 계산: (ng / µ L x 10 6) / (평균 라이브러리 x 660 조각 길이). 목표로 &#62; 오픈 chromatin를 평가 하기 위해 각 ATAC seq 라이브러리의 30 백만 읽기 인간의 샘플의 영역입니다. 라이브러리 NGS 시퀀싱을 위해 충분히 좋은 인지 확인 하려는 경우 처음 10 백만 ~ 읽기 (빠른 실행된 모드에서 DNA 시퀀싱 장비에서 시퀀싱 레인의 5%)을 목표로 합니다. 유추 nucleosome 위치, 쌍-엔드 시퀀싱은 필요 1.</li>
	</ol></li></ol> 7. 얻은 다음-세대 시퀀싱 결과 분석 <ol><li>별도로 모든 라이브러리에 대 한 FastQC 파일을 검사 하 여 시퀀싱 읽기의 품질을 유추할.</li>
	<li>는 Bowtie 21 소프트웨어를 사용 하 여 유닉스/리눅스 환경에서 인간의 참조 게놈 (hg19 어셈블리)을 읽기를 맞춥니다. 명령은 &#39; bowtie-m 1-q-S 게놈 디렉터리 reads.fastq output_aligned.sam &#39;. 게놈 디렉터리 Bowtie의 게놈 인덱스 저장 되는 폴더에 대 한 의미 합니다. 매개 변수-m 1의 게놈에 있는 하나 이상의 장소에 맞춤을 허용 하지입니다-q fastq 형식 이어야 하는 입력된 파일에 대 한,-S는 샘 형식 출력.</li>
	<li>중복 읽기 SAMtools 22 rmdup 옵션을 사용 하 여 유닉스/리눅스 환경에서 제거 합니다. 명령은 &#39; samtools 볼-S output_aligned.sam b | samtools 정렬-o-output_aligned &#62; output_aligned.bam &#39;, samtools rmdup-s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam &#39;. 첫 번째 명령은, 보기, 정렬 다음 BAM 형식으로 샘 포맷을 변경 합니다. Rmdup 옵션이 정렬 된 BAM 파일에 적용 됩니다. 원래 ATAC seq 종이 1에 설명 된 대로 필요에 따라 하나 transposon 삽입 사이트에 대 한 읽기를 조정할 수 있습니다. 이렇게 BEDtools를 사용 하 여 명령 유닉스/리눅스 환경에서 23. 명령은 &#39; bamToBed-i output_aligned _rmdup.bam &#62; output_aligned _rmdup.bed &#39;, &#39; shiftBed-i output_aligned _rmdup.bed-p 4 m-5-g 게놈 &#62; output_aligned _rmdup_adjusted.bed &#39;. 첫 번째 명령은, bamTobed, shiftBed 명령에 대 한 사용할 수 있는 침대 형식으로 BAM 포맷을 변경 합니다. 게놈 파일은 게놈에 있는 각 염색체의 길이 포함 하는 탭 구분된 파일이입니다. 파일은 일반적으로 BEDtools 디렉터리에 추가 됩니다.</li>
	<li>수행 피크 전화 칩 seq (MACS2) 24 소프트웨어의 모델 기반 분석을 사용 하 여 다음 매개 변수는 이동된 침대 파일에 유닉스/리눅스 환경에서:-nomodel-extsize-75-30을 이동. 이러한 매개 변수는 transposon 삽입 사이트는 각 연속 읽기는 읽기를 조정 하는 데 사용 됩니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 ATAC seq 프로토콜은 성공적으로 고용 되었다 액세스할 수 chromatin의 분석에 대 한 1 차 셀에서 (인간의 Th1, Th2 세포와 B 세포) 교양된 셀 라인 (MCF10A 인간의 유방암 세포와 U261 세포종 세포) 뿐만 아니라. 다른 세포 유형 ATAC seq 적용 일부 프로토콜 최적화, 특히 세포 단계에서에서 필요할 수 있습니다. 비 이온 세제의 농도가 너무 높은 경우에, 높은 비율의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 수 있습니다. 이 핵 수확량을 감소 하지 않고 세포의 용 해 버퍼에 세제 농도 감소 하 여 줄일 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 세포의 용 해 버퍼 세제의 0.05%를 가장 만족 스러운 결과 주었다. 또한, 고정된 각으로 터 펠 릿에 미토 콘 드리 아 감소 500 G 힘을 감소 허용 대신 스윙 양동이에 핵 회전. 연구원은 또한 세제, 예를 들어 digitonin17의 다른 종류를 테스트할 수 있습니다. 그러나, 최적화 된 세포의 용 해 조건,...

ATAC seq1,2 규제3 오픈 chromatin 지역과 nucleosome 포지셔닝의 식별을 가능 하 게 하는 강력한 방법입니다. 이 정보는 위치, id, 및 녹음 방송 요인의 활동을 유추 적용 됩니다. Chromatin 구조 양적 변화를 측정 하기 위한 방법의 감도 chromatin 요인, RNA 중 합 효소 II1의 transcriptional 활동 뿐만 아니라 chromatin remodelers 및 한정자를 포함 하 여 활동의 연구 수 있습니다. 따라서 ATAC seq 모든 세포 유형의 관심에 transcriptional 규칙을 제어 하는 메커니즘을 해독에 대 한 강력 하 고 공평한 접근을 제공 합니다. 우리는 기본 인간의 Th1 및 Th2 세포 ATAC seq의 적응을 설명합니다.
ATAC seq에 활동적인 Tn5 transposase 어댑터 (즉, "tagmentation" 과정)1DNA의 태그와 차세대 시퀀싱 (NGS) 커플 DNA 파편에 대 한 어댑터 로드. PCR 증폭, 다음 결과 DNA 라이브러리는 다음-세대 시퀀싱 (그림 1)에 대 한 준비가 됩니다. 액세스할 수 chromatin의 우선 tagmentation는 ATAC seq 시퀀싱 읽기의 지역 농축의 분석에 의해 검출 된다.
짧은 실험 절차와 chromatin 접근성 및 DNase seq4, 시 키-seq5, MNase-seq6, 등 nucleosomal 위치를 측정 하기 위한 다른 방법에 상대적으로 더 적은 시작 물자에 대 한 요구는 여러 생물 학적 시스템 등 인간의 기본 셀1,7 및 임상 샘플8, 단 세포 유기 체9,10, 식물 과일 파리11에서에서 ATAC seq의 사용을 추진 , 그리고 다양 한 포유류12.
녹음 방송 요인 접근 가능한 loci에 바인딩되는 chromatin immunoprecipitation (칩) 뒤에 높은 처리량 DNA 시퀀싱 (ATAC seq 결합 또는 그들의 바인딩 시퀀스 모티프의 농축을 분석 하 여 발견 될 수 있다의 정체성 ChIP-seq). 이 방법은 마우스13조에 대 한 중요 한 계보 특정 녹음 방송 요인의 식별을 사용할 수 있습니다. ATAC seq의 공평 하 고 글로벌 자연 유기 체는 칩 분석에 대 한 항 체 등 시 약은 사용할 수 없습니다에 있는 유전자 규칙을 공부 하 고 있습니다. Cis진화 변화 예를 들어-두개골 신경 크레스트 셀에서 인간과 침팬지14, 초기 마우스 동안 규제 요소 발달 변화를 공부 하 여 규제 지역 확인 되었습니다 embryogenesis15, 단 세포 C. owzarzaki의 라이프 사이클 동안 규제에 변경9및 발기인 및 20 포유동물 종12에서 강화의 진화.
ATAC seq도 따라서 공개 변화 세포 인구에서 일반적으로 게놈 넓은 연구7,16evades는 단일 셀에 chromatin 접근성을 측정 하기 위한 수단이 되었습니다. 또한, ATAC seq DNA 샘플 드물다 질병 조건에서 규제 지역에서 발생 하는 변화를 공부 하 사용할 수 있습니다. ATAC seq 급성 골수성 백혈병 (AML)17 또는 Ras의 발병 기간 동안 규정에 변화를 공부 하는 예를 들어-발암11을 구동.

<table><tbody><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Lumitron</td><td>LUM-CFT011500-P</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Axygen Inc</td><td>MCT-175-C</td><td>는 다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>25 mL 혈청학 피펫</td><td>Corning Costar</td><td>4489</td><td>다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크</td><td>Lumitron</td><td>LUM-TCF-012-250-P</td><td>다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Countes Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td></td></tr><tr><td>말초 혈액 단핵 세포&nbsp;( PBMC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; PCS&수줍음; 800&샤이; 011</td><td>다른 공급업체에서 가져올 수 있습니다.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td>다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>L-글루타민 용액 (200 mM)</td><td>생물 산업</td><td>03-020-1B</td><td>다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>생물학 산업</td><td>03-031-1B</td><td>다른 공급업체에서 가져올 수 있습니다.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS),&nbsp; 열 비활성화, 유럽 등급</td><td>생물 산업</td><td>04-127-1</td><td>다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MACS CD4 마이크로비즈, 인간</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD4 FITC</td><td>Biogems</td><td>06121-50</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG1 이소타입 제어 FITC</td><td>Biogems</td><td>44212-50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 (OKT3)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>40-0037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD28 SAFIRE 정제</td><td>Biogems</td><td>10311-25</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL4</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL12 p70</td><td>Peprotech</td><td>200-12</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)</td><td>Tonbo</td><td>40-7048</td><td></td></tr><tr><td>LEAF&nbsp; 정제 된 안티 휴먼 IFN-&gamma;</td><td>BioLegend</td><td>506513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 분석 등급</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td>다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>염화마그네슘, 헥사하이드레이트, 분자생물학 등급</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>800682</td><td>다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tris, 초순수, 99.9% 순수</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NP-40 대체품(노닐페닐 폴리에틸렌 글리콜)</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>시그마</td><td>P2714</td><td>이 프로테아제 억제제 코테일은 분말입니다. 100 x 용액을 분자 생물학 등급의 물 1mL에 희석합니다.</td></tr><tr><td>자기 고체상 역 고정 비드: AMPure XP 비드</td><td>Beckman</td><td>63881</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>HyLabs</td><td>EX-GP200</td><td>다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Nextera DNA 라이브러리 준비 키트 (TDE1 트랜스포사제 및 TD 버퍼)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2 x PCR 마스터 믹스</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Q5 핫 스타트 HiFi PCR 마스터 믹스</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CFX Connect 실시간 PCR&nbsp; 탐지&nbsp; System</td><td>Bio-rad</td><td>185-5200</td><td>다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>CFX Manager Software</td><td>Bio-rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>qPCR용 마스터 믹스: iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>172-5124</td><td>다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Qubit 형광측정기 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>에펜도르프 튜브용 자석</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>15 mL falcon tube 및 eppendorf tube용 버킷이 있는 스윙 버킷 냉각 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004527</td>는 <td>다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다. eppendorf tube용 버킷이 있어야 합니다.</td></tr><tr><td>써모 셰이커</td><td>MRC</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>고감도 D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>고감도 D1000 시약</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>테이프 기반 플랫폼 전기영동</td></tr><tr><td>고감도 DNA 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>시약용 고감도 TapeStation 분석</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프라이머 이름 및 서열</td><td>회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad1-noMx: 5'-P5 서열-전이효소 서열-3'Ad2.1_TAAGGCGA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.1_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.2_CGTACTAG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.2_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'</td></tr><tr><td>Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.3_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.4_TCCTGAGC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGAcggcatacga< > AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.4_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.5_GGACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.5_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.6_TAGGCATG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGAcggcatacga GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.6_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.7_CTCTCTAC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.7_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'</td></tr><tr><td>Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.8_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.9_GCTACGCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.9_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.10_CGAGGCTG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.10_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.11_AAGAGGCA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.11_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.12_GTAGAGGA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.12_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'</td></tr><tr><td>Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.13_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.14_ACCACTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGAcggcatacga GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.14_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.15_TGGATCTG</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.15_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.16_CCGTTTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.16_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.17_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.18_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.19_AGGTTGGG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.19_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.20_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.21_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.22_TGGTCACA</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.22_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.23_TTGACCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.23_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'Ad2.24_CCACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.24_expected 인덱스 시퀀스 읽기: 5'-P7 시퀀스-[인덱스 시퀀스]-트랜스포사제 시퀀스-3'F1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

atac seq에 의해 기본 인간 t 림프 톨에 게놈 넓은 접근 chromatin 매핑

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq) Transposase 액세스할 수 Chromatin에 대 한 분석 결과 chromatin의 오픈 (액세스) 지역의 식별에 사용 되는 방법 이다. 이 지역 규제 DNA 요소를 (예를 들면, 발기인, 증강, 로커 스 제어 영역, 절연체) 요인 바인딩하는 전사를 나타냅니다. 매핑 액세스할 수 chromatin 프리 게놈에서 잠복 활성 규제 요소에 대 한 강력한 접근 이다. 이 정보는 관련 된 녹음 방송 요인의 네트워크 및 유전자 식 프로그램을 제어 하는 chromatin 구조의 메커니즘을 발견에 대 한 편견된 접근 역할을 합니다. ATAC seq는 DNase 강력 하 고 중요 한 대안이 나 과민 증 분석 다음-세대 시퀀싱 (DNase-seq)와 포 름 알 데히드 기반 격리 chromatin의 게놈 넓은 분석에 대 한 규제 요소 (시 키-seq)의 결합 내게 필요한 옵션을 micrococcal nuclease 민감한 사이트 (MNase-seq) nucleosome 위치 결정의 연속. 선물이 상세한 ATAC seq 프로토콜 최적화 된 인간의 기본 면역 세포 즉, CD4 + 세포 (T 도우미 1 (Th1) 및 Th2 세포). 이 포괄적인 프로토콜 셀 수확 시작 chromatin tagmentation, 다음-세대 시퀀싱에 대 한 샘플 준비의 분자 절차에 설명 합니다 그리고 또한 포함 하는 방법 및 전산 분석 하는 데 사용에 대 한 고려 사항 결과 해석 합니다. 또한, 시간과 비용을 절약 하기 위해 우리는 시퀀싱 전에 ATAC seq 라이브러리를 평가 하기 위해 품질 관리 측정을 소개 했다. 중요 한 것은,이 프로토콜에 원리 다른 인간의 면역 및 비 면역 1 차 셀 및 셀 라인에 그것의 적응을 수 있습니다. 이러한 지침은 다음-세대 시퀀싱 방법 숙달 되지 않은 실험실을 위한 또한 유용할 것 이다.

이 프로토콜의 최종 결과 일반적으로 3 ~ 20 ng / µ L의 ATAC seq 라이브러리입니다. DNA 무결성 분석 시스템에서 실행할 때 (참조 테이블의 재료/장비), 그들은 쇼 사다리 같은 모습2 (그림 3A). DNA 파편의 평균 크기는 일반적으로 ~ 450 530 혈압.
차세대 시퀀싱을 수행 하기 전에 ATAC seq 라이브러리의 적절 한 품질 관리는 시간과 돈을 절약 해야 합니다. 우리 때는 라이브러리 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 적합 한 긍정적인 컨트롤의 농축은 이상 25-그리고 75 배 (뇌관을 위한 쌍 3, 4, 각각) 부정적인 컨트롤 (그림 3B)을 기준으로 하 ...

높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq)와 결합 하 여 염색 하는 Transposase 액세스할 수 질에 대 한 분석 결과 액세스할 수 chromatin를 폭로 하는 게놈 넓은 방법입니다. 이 인간의 세포 (Th1/Th2)에 최적화 된 최종 계산 분석, 분자에서 단계별 ATAC seq 프로토콜입니다. 이 프로토콜 차세대 시퀀싱 방법 사전 경험 없이 연구자에 의해 채택 될 수 있다.

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

트랜스포사제(transposase)를 사용하는 이 고처리량 방법의 전반적인 목표는 인간 게놈에서 접근 가능한 염색질 영역을 식별하는 것입니다. 이 방법은 조절 요소의 게놈 전체 위치와 같은 후성유전체 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 견고하고 상대적으로 짧으며 DNase-seq 또는 FAIRE-seq와 같은 염색질 접근성을 측정하는 다른 방법에 비해 시작 물질이 덜 필요하다는 것입니다.이 방법은 인간 T 림프구의 조절 환경에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 인간 일차 세포, 암 세포, 인간 임상 샘플, 다른 포유류 및 유기체의 세포와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 1,000만 개의 인간 PBMC가 담긴 1밀리리터 분취액을 해동하여 10밀리리터의 RPMI 배지가 들어 있는 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그들은 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 세포를 원심분리합니다.다음으로, 상층액을 제거하고 15ml의 보충된 RPMI 배지에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 T-75 배양 플라스크로 옮기고 가습으로 밤새 배양합니다. 다음 날, 멸균 25ml 피펫으로 부유 셀을 50ml 튜브로 옮깁니다.그런 다음 트리판 블루 제외를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다. 다음으로, 마이크로비드 분리 컬럼을 사용하여 1,000만 개의 살아 있는 비부착성 PBMC에서 CD4 양성 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 텍스트 프로토콜에 따라 Th1 및 Th2 분극 조건에서 T 세포를 플레이트화하고 활성화한 다음 핵을 분리합니다.그러기 위해, 신선한 용해 완충액을 준비하고 얼음에 식힌 상태로 보관하십시오. 또한 전치 반응을 준비하기 위해 열 셰이커를 섭씨 37도까지 가열합니다. 다음으로, 50만 개의 T 세포를 1.5밀리리터 마이크로튜브에 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 500Gs로 스핀다운합니다.다음으로, 1ml의 차가운 PBS로 세포를 세척하고 스핀 주기를 반복하되 이제 1ml의 저온 용해 버퍼에 세포를 현탁시킵니다. 세포가 너무 많이 파괴되지 않도록 부드러운 피펫팅으로 세포를 혼합합니다. 그런 다음 10마이크로리터 분취액을 빠르게 취하여 세포의 분율을 관찰합니다.세포를 차갑게 유지하고 빠르게 작업하십시오. 5분 이내에 전치 반응을 진행합니다. 먼저 100,000개의 핵을 1.5ml 마이크로튜브로 옮기고 차가운 원심분리기에서 10분 동안 500Gs로 샘플을 스핀다운합니다.그런 다음 상층액을 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 전위 반응 성분을 핵에 추가합니다. 그런 다음 부드러운 피펫팅으로 핵을 재현탁하고 500 RMP에서 30분 동안 열 셰이커에서 핵을 배양하여 전위 반응을 완료합니다.다음으로, DNA 정리 단계를 수행하고 20마이크로리터의 Tris hydrochloride에서 DNA 단편을 용리합니다. 그런 다음 PCR을 사용하여 ATAC 염기서열분석 라이브러리의 초기 증폭을 만듭니다. 다음으로, 정량적 PCR에 의한 최종 증폭에 필요한 최적의 추가 주기 수를 평가합니다.측정된 결과에서 ATAC-염기서열분석 라이브러리의 최종 PCR 증폭에 필요한 사이클 수를 결정합니다. 그런 다음 최종 증폭을 수행합니다. DNA 라이브러리 단편의 최적 크기를 설정하면 차세대 염기서열분석을 개선할 수 있습니다.먼저 마그네틱 비드를 실온으로 예열하고 뉴클레아제가 없는 물에 신선한 70% 에탄올을 준비합니다. 다음으로, 뉴클레아제가 없는 물을 ATAC 염기서열분석 라이브러리에 100마이크로리터 부피로 추가합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 재현탁된 DNA 결합 마그네틱 비드를 추가합니다.비드를 DNA에 최소 10회 피펫으로 삽입하고 5분 동안 기다립니다. 튜브 벽이나 뚜껑에 구슬 방울이 끼면 튜브를 짧게 돌립니다. 이제 샘플을 자석 옆에 2분 동안 놓고 상층액을 새 마이크로튜브로 옮깁니다.컬렉션의 부피를 측정하고 70% 부피의 마그네틱 비드 현탁액을 추가합니다. 이전과 같이 구슬을 섞고 5분 동안 배양한 후 계속 진행합니다. 그런 다음 자석을 사용하여 비드를 2분 동안 분리하고 이제 상층액을 버립니다.자석에 대항하는 동안 비드에 70% 에탄올 200마이크로리터를 추가합니다. 30초 동안 기다린 다음 에탄올을 버리고 에탄올 세척을 한 번 더 반복합니다. 남은 에탄올을 완전히 제거하고 비드를 자석에서 5분 동안 자연 건조시켜 세척을 마칩니다.필요한 경우 튜브를 짧게 돌리고 10마이크로리터 피펫으로 눈에 보이는 에탄올을 흡입합니다. 이제 자석에서 튜브를 제거하고 22 마이크로 리터의 Tris hydrochloride를 첨가하십시오. 2분 후 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 넣고 용액을 제거합니다.그런 다음 준비된 라이브러리를 포함하는 20마이크로리터의 용리액을 수집하고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 마이크로리터당 3-20나노그램인 ATAC 염기서열분석 라이브러리를 생성합니다. DNA 무결성 분석을 위해 시스템에서 실행하면 사다리와 같은 모양이 됩니다.무엇보다도 또 다른 중요한 품질 관리는 양성 대조군의 농축입니다. 음성 대조군에 비해 프라이머 쌍 3은 최소 25배 농축되어야 하고 프라이머 쌍 4는 최소 75배 농축되어야 합니다. 초기 1,000만 회 판독 후 샘플이 FastQC 보고서 파일의 모든 중요한 매개변수를 통과하고 피크 호출에서 1, 000에서 2, 000개의 피크를 얻은 경우 3,000만 회 이상의 판독을 위해 라이브러리를 더 심층적으로 염기서열화할 수 있습니다.품질 표준을 충족하는 라이브러리에서는 판독값의 6-20%만이 미토콘드리아 게놈에 매핑됩니다. 나머지 고유 판독은 참조 인간 게놈에 매핑되며 7-12%는 ATAC 염기서열분석 피크 내에 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 ATAC-seq 라이브러리를 만드는 방법, 배급 시퀀싱을 제출 및 제공하는 방법, 얻은 데이터를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.일단 마스터하면 ATAC-seq 라이브러리 준비를 영업일 기준 하루 또는 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 핵 분리 단계에서 세포의 수 및 용해 완충액의 구성과 같은 일부 단계를 먼저 최적화해야 할 수도 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 염색질 면역침전과 같은 다른 방법을 수행하여 검사된 샘플의 열린 염색질 영역에 어떤 전사 인자가 결합하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 단백질 결합 염색질 단편의 선택적 면역침전을 통해 희소돌기아교세포 전구체 세포의 게놈 DNA의 특정 영역에서 단백질 결합 부위를 식별하는 염색질 면역침전 기술을 보여줍니다. 이 방법은 유전자 조절에 관여하는 전사 인자를 포함한 여러 조절 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

강화, 같은 DNA 규제 요소, 물리적으로 대상 유전자 발기인, 큰 게놈 거리에 걸친 장거리 염색체 상호 작용을 통해 자주 연락 하 여 유전자 발현을 제어 합니다. 발기인 캡처 안녕-C (PCHi-C) 그들의 표적 유전자를 잠재적인 규제 시퀀스의 지정을 활성화 발기인 및 원심 지역 사이 중요 한 상호 작용을 식별 합니다.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

여기, 우리는 transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq) 활성화 된 CD4 + 인간 림프 톨에 시퀀싱에 대 한 분석 결과 수행 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 새로운 세포의 용 해 버퍼의 도입을 통해 3%로 50%에서 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 최소화 하기 위해 수정 되었습니다.

ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염

여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.

암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화

우리는 핵 형광 표지가 있는 형질전환 리포터 마우스에서 분리된 지방 조직으로 핵 분류를 사용하는 지방 세포에 특히 고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용하여 전치사 효소 접근 가능한 염색질 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Fluorescence-Activated Nucleus Sorting을 사용한 지방 조직을 사용한 지방 세포 특이적 ATAC-Seq

이 원고는 최적의 호중구 생존력과 높은 라이브러리 품질을 보장하는 것을 목표로 쥐 골수에서 호중구의 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. BMC 준비, 면역자기 분류 및 라이브러리 구축에 대한 단계별 지침을 제공하여 특히 호중구 연구를 처음 접하는 사람들에게 유용한 가이드 역할을 합니다.

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils(쥐 골수 유래 호중구의 ATAC-Seq 라이브러리 준비)

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

여기에서는 세포 분리에서 염기서열분석 결과의 기본 분석에 이르기까지 게놈 전체 포유류 복제 타이밍을 매핑하기 위한 비교적 빠르고 간단한 접근 방식을 설명합니다. 대표적인 복제 프로그램의 게놈 맵은 프로토콜에 따라 제공됩니다.

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

학습하세요 ATAC-seq를 사용하여 인간 T 림프구에서 크로마틴 접근성을 분석하는 방법을. 고속 시퀀싱을 통해 게놈 전체 조절 요소를 식별하고 후성유전학 연구에 활용할 수 있습니다.

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

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