Name: 라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 살아있는 초파리 난소 조직에서 여포 줄기 세포 계보의 세포내 pH를 정량적 형광 이미징으로 측정하는 방법을. 이 기술은 줄기 세포 행동과 발달 생물학 연구에 중요한 도구를 제공합니다.

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원고에 대 한 제안에 대 한 프로토콜 및 다이앤이 발사에 기여에 감사 Bryne Ulmschneider 하 고. 이 작품은 건강 그랜트 GM116384 T.G. Nystul 및 듀얼이 발사의 국가 학회에 의해 투자 되었다.

참고: FSC 혈통에 피 측정, 하 우리는 FSCs, pFCs, 및 생리 적 조건에 여 포 세포에서 mCherry에 pHluorin의 형광 강렬의 비율을 계산 하 고 표준 피 값으로 비율을 변환 각 셀에 대 한 교정 곡선 7을 입력합니다. 첫째, 라이브 이미징 실험 pHluorin 및 germaria NaHCO 3, 생리 적 조건 1 , 모방을 포함 하는 버퍼에 해 부에 mCherry의 형광 강도 측정 하기 위해 수행 됩니다. 7. 다음, 표준 곡선에서 Na + pHluorin 및 mCherry 형광 강도 측정 하 여 생성 됩니다-무료, ionophore nigericin를 포함 하는 K + 버퍼 조정 두 가지 다른 pH 값, 6.5와 7.5. Nigericin, 면 전에 서 피는 extracellular pH에 맞게 피를 일으키는 플라즈마 막에 걸쳐 버퍼의 ph equilibrates. 마지막으로, 표준 곡선 pHluorin mCherry 비율 추정된 피 값을 변환 하는 데 사용 됩니다.
 1. 사전 평가: 준비 하기 전에 측정 피에 비보 참고: vivo에서 피 측정, mCherry::pHluorin transgene 셀 종류 관심의 표현 해야 합니다. 아래에 유전자 변형 pHluorin를 생성 하는 몇 가지 일반적인 방법을 날아 FSC 혈통에 있다. MCherry::pHluorin 클론을 생성 하는 것은 특히 FSCs는 FSC 클론의 앞쪽 가장자리에 있는 식별 하는 데 유용 합니다. 조직 특정 mCherry::pHluorin는 전체 조직에 걸쳐 피를 측정 하는 데 유용 표현과 RNAi 또는 transgene의 식과 결합 시킬 때 더 편리한 이기도.
<ol>유전자 변형 pHluorin의 파리 <ol><li>mCherry::pHluorin 표시 된 FSC <li>클론 <ol><li>mCherry::pHluorin FSC 클론을 만들기 위해 주식 또는 기타 행위 Gal4 flipout UAS-mCherry::pHluorin 1 크로스 Flp/FRT 유도할 수 있는 Gal4와 재고.</li>
			<li>유도할 수 있는 클론, heatshock을 heatshock 2 일 성인 F1s 게시물 일수로 37 ° C 물 목욕, 4 번 12 헤에 약 1 시간에 대 한 빈 병에</li>
			<li>신선한 젖은 누 룩을 제공 하 여 파리가이 기간 동안 정상적인 성장과 oogenesis의 최대 속도 보장 하기 위해 유지 (대략 동등한 부품 건조 베이커 &#39; s 효 모 및 물) 복제 유도 후 적어도 6 일 동안 매일.</li>
		</ol></li> <li>조직 특정 mCherry::pHluorin 식</li> <li>UAS-mCherry::pHluorin 1를 교차 하는 여 포 세포 특정 드라이버, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (블루밍턴 ID: 7023).</li>
		<li>3 일 파리 eclosing, 시작 후 수집 하 고 젖은 효 모, 해 부 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 포함 된 튜브에 넣어.</li>
	</ol></li> <li>솔루션 만들기 참고: 버퍼에서 pH와 용액 농도 시간이 지남에 따라 변경 될 수 있으므로 실험 당일 다음 버퍼를 준비 하는 것이 중요 하다.
	<li>준비 중 탄산염, nigericin, 및 해 부 버퍼 <ol>. 침전 (표 1, 표 2 및 표 3 참조)의 형성을 방지 하려면 나열 된 순서 대로 구성 요소 추가.</li>
	</ol></li></ol> 2. 시험: FSC 혈통에 피를 측정 하는 참고: 해 부, 장착, 그리고 라이브 이미징 단계 중 탄산염 버퍼와 두 개의 nigericin 버퍼 조건에 대 한 두 번 수행 해야 할 수도 있습니다: 현미경 결정을 한 때 설정 및 실험 데이터를 수집 두 번째 시간입니다. 2.2 아래의 자세한 내용은 섹션을 참조 하십시오.
<ol>절 개 및 장착 <li> 참고:이 단계를 수행 하는 데 필요한 자료 그림 1과 테이블의 자료를 참조 하십시오. 3D 인쇄 장착 챔버, 3D 프린터 파일 추가 파일 1과 파일 2 보충으로 제공 됩니다.
	<ol><li>해 부: <ol><li>3D의 편평한 측을 진공 그리스의 얇은 코팅을 적용 하 여 준비 장착 챔버 장착 챔버 인쇄. 22 x 40mm coverslip 장착 챔버에 coverslip 인감에 그 측을 두십시오.</li>
		</ol></li> <li>500 µ L 해 부 버퍼 (중 탄산염 또는 nigericin 버퍼, 표 3)에서 여성 성인 파리에서 난소 부 <ol><li>CO 2 가스를 사용 하 여 3-4 파리 Anesthetize를 전송 ㈜ 끼얹는다 플라이 패드에 2 가스.</li>
			<li>집게와 해 부 미디어로 장소는 마 취 비행 데리.</li>
			<li>의 난소 노출 되는 때까지 그것의 복 부의 끝에 잡아 당 겼는 동안 하나의 forcep으로 파리의 흉부를 꼬집어.</li>
			<li>다른 장기에서 난소를 분리 후 애타게 떨어져 22 1/2 주사기 바늘을 사용 하 여 ovarioles. 신중 하 게 별도 근육에서 난소와 ovarioles의 클러스터에서 별도 개별 ovarioles 칼 집. Ovarioles 클러스터의 앞쪽 끝에 장소에서 그리고 단일 ovarioles의 길이 따라 아래쪽으로 치기 한 주사기 바늘을 사용 하는 근육 덮개를 분리 하는 효과적인 기술.</li>
			<li>완전히 nigericin 해 부 미디어의 ph equilibrate 셀의 피에 대 한 충분 한 시간이 되도록 설치 단계를 진행 하기 전에 정확히 10 분에 대 한 해 부 미디어에서 해 부 난소를 품 어. 
			주: 근육 덮개는 ovarioles에서 제거 됩니다 확인 하십시오. 근육 칼 집 하기가 어렵습니다 사용 하 여 개별 셀을 식별 하는 형광 신호를 약하게 수 있습니다 Concanavilin-A, ovarioles 라이브 이미징 동안 자발적으로 이동 될 수 있습니다.</li>
		</ol></li> <li>장착 <ol><li>챔버 내부에 장착 해 부 미디어 유리 coverslip에의 작은 방울을 배치.</li>
			<li>전송 분리 집게를 사용 하 여 ovarioles.</li>
			<li>이전 단계 계란 챔버와 연결 된 germaria에서 나중 단계 계란 챔버를 분리 하 고 해 부 germaria 해 부 미디어 드롭의 중심에 배치 됩니다 시도.</li>
			<li>라운드 12 mm coverslip의 반대편에 매니큐어의 두 개의 작은 방울을 추가 하 고 그것은 약 10 건조 한 공기 보자 s.</li>
			에 포함 된 해 부 미디어 드롭 <li>장소 라운드 coverslip germaria 분리 같은 매니큐어와 측면 직면 하 고 해 부 미디어 연락처. 평평 하 고 안전한 위치에 germaria를 매니큐어와 가장자리의 부분에 아래로 누릅니다. 그것은 얼룩는 coverslip의 표면으로 그것은 장소에 확보 되 고 더 적은 때문에 오래 된 매니큐어를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
			<li>추가 해 부 미디어 장착 챔버를 입력합니다. 챔버를 채우기 위해 Concanavalin A 염료를 포함 하지 않는 조건 특정 버퍼를 사용할 수 있습니다. 
			참고: 총 시간 동안 해 부 고 장착 15 분을 초과 하지 않아야 합니다. 이것은 조직 손상의 영향을 최소화 하는 것이 중요 세포 죽음.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>라이브 이미징: 참고:이 단계에서 먼저 중 탄산염 조건과 적절 한 현미경 설정을 결정 하기 위해 두 개의 nigericin 조건에서 이미지를 수집, 현미경 설정을 필요에 따라 조정 그리고 실험 데이터에 대 한 이미지를 수집 합니다. 3 채널에서 confocal 현미경 이미징의 능력을 사용 하 여: GFP (475 여기/509 방출), mCherry (575 여기/610 방출), 및 빨강 (633 여기/647 방출). 
	참고: 설정된 현미경 설정: 수집 하는 이미지의 픽셀 농도 각 이미지 세트에서 신호 강도 값이 너무 낮은 것도 포화 중요 하다 그래서 피의 견적을 확인 하 정해질 것입니다. 이미지에서 캡처할 수 수 농도의 범위는 이미지 비트 깊이 의해 정의 됩니다. 대부분의 경우, 8 비트 이미지는 기본적으로 생성 된 하지만 더 넓은 동적 범위는 16-비트 이미지 데이터를 취득 하는 것이 좋습니다. 그것은 형광 채널간 크로스 토크를 최소화, 설정을 방출 스펙트럼 수집에서 조정 한다 그래서 각 fluorophore 겹치지 않도록 보장 해야 합니다. 이러한 설정을 테스트 하려면 GFP에 대 한 여기 스펙트럼을 사용 하 여 샘플 이미지와 mCherry와 반대로 방출 스펙트럼에서 수집 합니다. 경우에 설정을 제대로 조정 되었습니다, 어느 경우에 신호 있어야 합니다 합니다. 이미지 파일의 동적 범위 내에 있는 모든 3 개의 이미지 세트에 신호의 픽셀 농도 현미경 설정 (즉, confocal 레이저 스캐닝 전압 설정, 레이저 파워 및 작은 구멍 크기)를 설정 합니다. 우리의 모든 실험 40 x 목적으로 confocal 현미경 검사는 백색 빛 레이저 필요에 따라 우리는 모든 실험에 대 한 전압 이득을 최적화 하는 동안 1024 × 1024 형식, 16-비트 이미지를 얻으려고 사용 했습니다. 예를 들어 한 실험에서 우리는 GFP, mCherry, 전압 이득 설정 및 빨강 37.8%, 72.9%, 및 260%, 각각.
	<ol><li>Nigericin 해 부 버퍼 pH 6.5에서에서 ovarioles 이미지 하 고는 pHluorin와 mCherry 이미지의 픽셀 농도 낮은, 하지만 카메라의 검출 한계 아래의 설정을 조정.</li>
		<li>PH 7.5에 nigericin 해 부 버퍼에서 ovarioles의 다른 세트를 이미지 하 고 pHluorin 및 mCherry 이미지의 픽셀 농도 높은, 하지만 하지 포화 되도록 설정을 조정.</li>
		<li>이미지 난소 중 탄산염 해 부를 버퍼링 하 고 pHluorin 및 mCherry 이미지의 픽셀 농도 선택한 설정으로 포화 되지 확인 하십시오. 픽셀이 포화 되는 경우 필요에 따라 설정을 조정. 
		참고: 현미경 설정 매개 변수는 다를 수 있습니다 사용 되 고, 정확한 현미경 설치에 따라 그리고 각 실험에 대 한 최적화 해야 합니다. 현미경 후 설정 설정, 실험의 나머지를 위해 그들을 변경 하지 마십시오. 설정 제어 및 실험 조건에서 일관 되어야 합니다. 우리의 초기 피 실험에서 2, 3 포인트 nigericin 교정 곡선을 생성 하 고 메서드 중 하나를 사용 하 여 계산 된 피 사이의 큰 차이 발견. 그러나, 일반적으로, 보정 곡선에 더 많은 포인트의 추가 정확도 향상 시킬 예정 이라고. 따라서, 얼마나 많은 실험 조건의 주어진된 세트에 필요한 결정 하는 포인트의 서로 다른 숫자와 커브를 생성 좋습니다.</li>
	</ol></li> <li>데이터 수집: <ol><li>해 부, 장착, 그리고 중 탄산염 및 nigericin 버퍼 조건에서 샘플의 이미지를 수행. 해 부 및 장착, 최대 시간 보낸 후 샘플 한 세트를 이미징 초과할 수 없는 형광 강도 측정, 건강 한 조직에서 만들어진다 되도록 45 분.</li>
		<li>각 조건에 대해 적어도 5 germaria에 대 한 이미지를 수집.</li>
	</ol></li></ol> 3. -재판: 이미지 분석 <ol><li>FSCs, pFCs, 및 여 포 세포에서 형광 강도 측정 <ol><li>배경 빼기: <ol><li>오픈 처리 되지 않은 각 채널을 별도 창 (피지에서 이미지 그림 4C).</li>
			<li>관심 (ROI) 영역을 그리려면 사각형 도구를 사용 하 여 신호 없이 이미지의 부분에서 pHluorin 채널 창에서.</li>
			<li>옵션 단계: 배경 아래 강도 값과 함께 픽셀은 제외 하 고 최대 임계값의 상한값을 설정 임계값의 하한값을 설정. 임계값 설정 하면이 방식으로, 신호 없이 이미지의 분야는 주로 파란색 이며 신호가 명확 하 게 보이는 ( 그림 4A).</li>
			<li>투자 수익의 말은 형광 강도 측정합니다. 3 단계에서 임계값을 설정 하는 경우를 체크 해야는 &#34; 임계값 제한 &#34; 측정 설정 대화 상자에서 상자.</li>
			<li>각 채널 및 빼기 기능, 과정에서 발견을 사용 하 여 이미지의 조각에서 측정 된 배경 강도 빼기 &#8594; 수학 메뉴.</li>
			<li>반복 단계 3.1.1.2-6 단계 3.1.1.2에서,를 제외 하 고 mCherry 채널 창에 대 한 사각형 도구로 새로운 사각형 그리기 대신 복원 선택 함수 사용 하 여, 편집에 &#8594;와 같은 사각형을 추가 하려면 선택 메뉴 크기와 이미지에 위치.</li>
		</ol></li> <li>식별 FSCs, pFCs, 및 여 포 세포: <ol><li>FSCs, pFCs, 여 포 세포 형태학 및 위치 Concanavalin A 얼룩 사용 하 여 셀 경계 ( 그림 2)를 찾을 수 파악.</li>
			<li>FSCs 얇은 삼각형 셀 영역 2a/2b 국경에 germarium의 가장자리에 위치 하 고 있습니다. MCherry::pHluorin는 FSC에서에서 표현 하는 경우 금감위는 클론의 앞쪽 대부분 셀으로 식별할 수도 있습니다.</li>
			<li>pFCs는 불규칙 한 모양의 셀 영역 2b, 즉시 인접 하 고 다운스트림 FSCs.</li>
			<li>여 포 세포는 지역 3에서 생식 세포 낭종을 둘러싸고 있는 사각형 또는 열 셀.</li>
		</ol></li> <li>취득 형광 강렬 비율 <ol><li>관심의 셀 mCherry 채널에서 가장 높은 형광 강도가지고 있는 하나 이상의 분할 영역을 선택 하 고 있는지 확인에서 Concanavalin A 얼룩, 빨강 채널에서 본 foc에 선택한 슬라이스 내 우리.</li>
			<li>각 FSC와 pHluorin와 mCherry 모두의 평균 형광 강도 측정을 위해 선택한 조각 측정 ROI 그릴.</li>
			<li>MCherry 형광에 pHluorin의 비율을 계산 하기 위해 mCherry 채널의 평균 형광 강도 의해 pHluorin 채널의 평균 형광 강도 나눕니다.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>파생 피 값 하 고 pseudocolored 이미지를 생성 <ol><li>파생 피 값 <ol><li>모든 경우에 선형 회귀 곡선 생성 같은 유전자 형의 파리에서 난소를 사용 하 여 두 실험 조건 제어. 두 개의 nigericin 버퍼 조건 ( 그림 3)에서 데이터를 사용 하 여 각 셀 형식에 대 한 선형 회귀 곡선을 생성 합니다. Excel에서이 그래프에 데이터를 플롯과 선형 추세선을 추가 하 여 수행할 수 있습니다. 또는 참조:</li> <li>기울기와 y 절편 선형 회귀 곡선의 nigericin 조건 및 라인의 방정식에서 계산 하는 사용 (y = mx + b)는 pHluorin mCherry 비율 값으로 변환 하는 중 탄산염의 샘플에서 계산 조건 pH 값입니다. 이 방정식에서 b에 대 한 사면 양식 (y-절편)을 대체, x에 비율 값을 입력 하 고 영에 대 한 해결</li>
		</ol></li> <li>피지에 비율 값을 반영 하는 pseudocolored 이미지 생성.
		<ol><li>배경 빼기 (단계 3에 대 한 위의 절차에 따라.1.1 및 그림 4).</li>
			<li>는 프로세스 메뉴에 이미지 계산기 기능을 사용 하 여 mCherry 채널에서 pHluorin로 나눕니다. 반드시는 &#34; 만들기 새 창 &#34; 및 &#34; 32 비트 (부동 소수점) 결과 &#34; 체크 박스 모두 선택. 룩 업 테이블 (LUT)을 변경, 열 또는 선택의 LUT 이미지 메뉴에서 발견. 다른 적합 한 옵션에 대 한 그림 4를 참조 하십시오.</li>
			<li>조정 밝기 및 대비 대화 상자에서 (이미지 &#8594; 조정 &#8594; 밝기/대비), 클릭에 &#34; 설정 &#34; 버튼. 세트는 최소 0 값을 표시 하 고 최대 표시 값 캡처 최고의 비율을 데이터, 일반적으로 1.0-2.0 ( 그림 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리가 wildtype 조직 내의 FSC 혈통에 셀의 피를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 개발 되어 있으며 우리가 처음 초파리 난소 조직에 피를 공부 하기 시작 했다 이후 지난 5 년간 정제 된. 그 시간 동안, 프로토콜 성공적으로 여러 조사 연구소에서 하 고 적어도 4 개의 다른 회전 디스크와 레이저 스캔 현미경에 의해 사용 되었습니다. 우리의 원래 관찰, 그 피 증가 FSC 계보에서 셀 여 포 세포 주를 pFC에 줄기 세포에서 분화로 여러 실험을 통해 보여 모두의 재현성이 생물 학적 현상은 강력 하 고 방법론은 안정적입니다. 그러나, 우리의 경험에서는, 이것은 마스터에 도전 절차입니다. 그것은 모든 단계에서 세부 사항 및 해 부, 설치, 및 이미징 단계의 급속 한, 매우 능숙 하 게 실행에 세심 한 관심을 요구 한다. 해 부 및 장착 절차 포함 10 분 부 화 하지만 총 15 분을 넘지 말아야 한다 프로토콜에서 설명 했 듯이, 그리고 45 분에 이미징 절차를 완료 해야 합니다. 이상적인 ...

최근 연구 결과 세포 감 별 법 그리고 발육 이상 vivo에서1,중2피에 변화에 대 한 역할을 밝혔다. 이러한 연구 발견 그 피는 차별화의 동일한 단계에서 동일한 유형의 세포에서 현저 하 게 일관 하지만 과도 한 단계에서 다른 셀으로 변경. 경우에 따라 차별화, 피에 변화 세포 운명에 변화의 결과 그냥 아니다 하지만 대신 세포 운명, pH에 민감한 규제에 영향을 통해 변화를 촉진 하는 데 도움이 방해 피에서 변화를 부분적으로 차단 단백질 또는 차별화에 필요한 화학 반응입니다. 미래 연구 피 역학에서 vivo에서의 여러 가지 역할에 더 많은 통찰력을 가능성이 있다. 그러나, 피의 정확한 측정을 얻는 이다 vivo에서 분화 하는 동안 피를 공부 하는 과제 중 하나. 분화, 세포 형태학 및 유전자 발현에 변화 등의 다른 기능과 달리 피는 고정 되어 있고 표준 방법으로 permeabilized 셀에 유지 되지 않고 셀의 정한 화학 재산입니다. 또한, 강조 하는 셀에 안정 또는 실험적인 조작으로 인해 죽어가는 피 않을 수 있습니다. 따라서, 피를 측정할 때 살아 있고 가능한 건강 한 세포를 유지 하는 것이 중요 하다. 몇 가지 중요 한 염료는 vivo에서 깊이 또는 균등 하 게 조직 침투 하지 않습니다 그들은 때문에 공부에 대 한 그들이 경우 셀 문화3, 그러나 많은 피 측정을 위해 잘 작동 적합 하지 않습니다 사용할 수 있는 정확한 측정을 제공 하기 위해 .
우회 가난한 염료 침투의 문제, 우리와 다른 사용 유전자 인코딩된 프로브, mCherry::pHluorin4,5,,67, 특히 셀에에서 표현할 수 있는 관심과 살아있는 조직에 몇 군데의 종류입니다. pHluorin는 높은 pKa와 GFP의 변종 (~ 대 7.0 ~ 4.0)을 더 쉽게 더 높은 pH;에 주름 그래서 셀에 pHluorin 분자의 인구에서 방출 된 총 형광 강도 피8증가 함께 증가 합니다. 중요 한 것은, 형광은 정상 범위 내에 cytosolic 피 값의 선형. 반면, mCherry의 형광 (pKa ~ 4.5) cytosolic 범위 내에서 pH 변화에 민감 하지 않습니다. 이 두 기자 covalently 함께 그래서 그들은 항상 동일한 금액에 존재 한 열려있는 독서 프레임으로 인코딩된 단일 공상 단백질으로 연결 됩니다. 따라서, mCherry 형광 강도 pHluorin의 비율 피 각 셀에 프로브 농도를 정상화 하는 측정을 제공 합니다. 비율 다음 알려진된 pH 값에 equilibrated 조직에서 mCherry 비율에는 pHluorin를 취득 하 여 생성 되는 표준 곡선을 사용 하 여 피 값의 견적을 변환할 수 있습니다.
여기, 우리 mCherry::pHluorin를 사용 하 여 초파리 난소의 상피 FSC 혈통의 피를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 특징이 잘 조직 상피 생물학, 줄기 세포 자체 갱신 및 차별화9,10,11, 집단 셀 마이그레이션12 등의 다양 한 측면을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. , 개발 및 세포 극성13,14의 유지 보수. 여 포 상피 조직의 앞쪽 가장자리에 germarium15,16라고 하는 구조에 있는 2 개의 FSCs에 의해 생산 됩니다. Prefollicle 셀 (pFCs), 다시 틈새를 입력 하 고는 FSC 될 하거나 세 다른 여 포 세포 유형 중 하나에 차별화 라는 자손을 생산 하 고 자기 갱신 성인 기 동안 정기적으로 이러한 세포 분열: 극 지 세포, 줄기 세포, 또는 본체 여 포 세포입니다. 우리 보여주었다 이전 wildtype 조직에는 피 차별화, pFCs에서 7.0 FSCs에 약 6.8의 피에서 여 포 세포27.3에의 초기 단계 동안 꾸준히 증가. 심각 하 게 손상 pFC 차별화 편 표현된 나트륨/양성자 교환기, DNhe2의 RNAi 최저에 의해이 증가 차단, DNhe2 의 overexpression에 의해 피를 증가 하는 반면 약한 과도 차별화 하면 표현 형입니다. 이러한 결과 피 초기 FSC 혈통에 안정적으로 유지 되 고 실험적으로 될 수 있는 증가 또는 vivo에서감소를 보여 줍니다. 여기에 설명 된 방법은 wildtype 조직 또는 돌연변이 조직, RNAi 최저 또는 overexpression Gal4 관심과 mitotic 클론을 사용 하 여를 포함 하 여 다양 한 형태의 피 측정을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Fly Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::p Hluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*; P{GawB}10930/CyO</td><td>블루밍턴 주식 센터</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 플립아웃 주식</td><td>블루밍턴 주식 센터</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Chemicals for Buffer preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>, <td>시그마, 알드리치</td>, <td>S5886</td><td></td></tr>, <tr><td>KCl</td>, <td>시그마, 알드리치</td>, <td>P-3911</td><td></td></tr>, <tr><td>포도당</td>, <td>말린크로트,</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES,</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td>, <td>BP310</td><td></td></tr>, <tr><td>MgSO4</td>, <td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>M63</td><td></td></tr>, <tr><td>CaCl2</td>, <td>시그마 알드리치</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td>, <td>시그마, 알드리치</td><td>S-5761</td><td></td></tr>, <tr><td>MgCl2</td>, <td>시그마, 알드리치</td><td>M-9272</td><td></td></tr>, <tr><td>NMDG+</td><td>시그마, 알드리치</td><td>M-2004</td><td></td></tr>, <tr><td>K2HPO4</td>, <td>Mallinckrodt</td><td>7088</td>, <td>KHPO4, pH 7.4</td></tr>, <tr><td>KH2PO4</td>, <td>Thermo Fisher, Scientific</td><td>BP362</td>, <td>KHPO4, pH 7.4</td></tr>, <tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647, Conjugate</td><td>Thermo Fisher 만들기 위해 사용 Scientific</td><td>C21421</td><td>0.25 mg/ml 희석</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>해부 및 장착 도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox 집게(크기 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 23게이지 주사기 바늘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9웰 유리 해부 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM 유리 커버 슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>원형 유리 커버 슬립, 직경 12mm, 두께 0.13-0.16mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3-D 마운팅 챔버</td> <td>추가 파일로 포함된 3-D 프린터용 맞춤형 제조</td><td></td><td></td>.stl 및 .ipt 파일</tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>기타 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>모델: Accumet AB15</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>모델: SZ2-ST</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 또는 SP8 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 40&times; 대물렌즈, 개구수가 1.3</td></tr></tbody></table>인

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 ph에 대 한 방법

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

세포내 pH (피)에 변화 많은 세포 기능, 대사, 확산, 차별화 등의 규칙에 중요 한 역할을 재생 합니다. 일반적으로, 피 역학 순종 측정 하 고 실험적으로 피를 조작 하는 경작된 한 세포에 결정 됩니다. 그러나, 새로운 도구와 방법론의 최근 개발 그대로, 살아있는 조직 내에서 피 역학 공부를 가능 하 게 했다. 초파리 연구를 위한 하나의 중요 한 발전은 들고 피 바이오 센서는 유전자 변형 라인의 세대 mCherry::pHluorin. 여기, 우리는 우리가 일상적으로 사용 하 여 이미징 라이브 초파리 ovarioles에 대 한 mCherry::pHluorin 유전자 변형 야생 타입 라인;의 상피 뿌리 줄기 세포 (FSC) 혈통에 피를 측정 하는 프로토콜 설명 그러나, 여기에 설명 된 방법을 날개 디스크와 눈 상피를 포함 하 여 다른 조직에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리는 라이브 이미징, 및 취득 및 피 값을 가져올 이미지를 분석 하는 동안 난소 조직을 유지 하 FSC 혈통에 mCherry::pHluorin를 표현 하기 위한 기법을 설명 합니다.

여기 우리는 몇 가지 단계를 포함 하 여 포 상피에 피를 측정 하는 과정을 설명 했습니다. 먼저, 난소는 해 부 및 설치 도구를 사용 하 여 적절 한 유전자 (그림 1)의 파리에서 해 부. ovarioles는 다음 양적 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데 하 고 이미지를 피 측정 분석. 각 이미지에 대 한 관심의 세포 유형 섹션 3.1 (그림 2)에 설명 된 대로 식별 됩니다. GFP와 mCherry 채널에서 형광 강렬 비율 섹션 3.2에 설명 된 대로 표준 곡선 (그림 3A)를 사용 하 여 피 값으로 변환 됩니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 그 피 초기 FSC 혈통, FSCs에 6.8에서 7.0 prefollicle 세포, 모 근 세포 (그림 3B</stron...

우리는 살아있는 초파리 난소 조직에는 상피 줄기 세포 계보의 세포내 pH를 이미징에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 유전자 변형 파리 양적 형광 이미징 사용 하 여 바이오 센서는 pH 바이오 센서, mCherry::pHluorin, 이미지를 표현 생성 하 고 표준 곡선, 생성 한 형광 강도 값을 pH 값으로 변환 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 이식된 초파리 난소 조직 내 난포 세포의 세포 내 pH를 측정하는 것입니다. 이 방법은 세포 내 pH의 변화가 황산염 결정에 어떻게 기여하는지와 같은 줄기 세포 및 발달 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 온전한 조직 내의 pH를 정확하게 정량화할 수 있다는 것입니다.실험을 시작하려면 3D 프린팅 장착 챔버의 평평한 면에 진공 그리스를 얇게 코팅하여 장착 챔버를 준비합니다. 22 x 40mm 커버 슬립에 평평한 면을 놓고 커버 슬립을 장착 챔버에 밀봉합니다. 다음으로, 500마이크로리터의 박리 완충액에서 암컷 성충파리의 난소를 해부합니다.CO2 가스를 사용하여 3-4마리의 파리를 마취하고 파리를 플라이 패드로 옮깁니다. 집게를 사용하여 파리를 선택하고 해부 매체에 놓습니다. 파리의 흉부를 집게 한 쌍으로 꼬집으면서 난소가 드러날 때까지 복부 끝을 잡아당긴다.타이머를 정확히 10분으로 설정합니다. 난소를 다른 장기에서 분리한 후 22 및 반 게이지 주사기 바늘을 사용하여 난소를 분리하십시오. 주사기 바늘 하나를 사용하여 난소 다발을 앞쪽 끝에 고정하고 단일 난소의 길이를 따라 아래쪽으로 스트로크하여 난소에서 근육초를 조심스럽게 분리합니다.절개된 난소를 타이머의 나머지 시간 동안 박리 매체에서 배양합니다. 세포에 충분한 시간을 제공하기 위해 난소가 정확히 10분 동안 박리 매체에 남아 있는 것이 중요합니다. 마운팅 챔버 내부의 유리 커버 슬립에 작은 해부 매체 한 방울을 떨어뜨립니다.분리된 난소를 겸자를 사용하여 이식합니다. 초기 단계의 난실과 관련된 germaria에서 후기 단계의 난실을 분리하고 절개된 germaria가 해부 매체 드롭의 중앙에 배치되도록 합니다. 약 12mm 커버 슬립의 반대쪽에 매니큐어 두 방울을 떨어뜨리고 약 10초 동안 자연 건조시킵니다.분리된 저마리아가 포함된 해부 매체의 드롭에 둥근 덮개 슬립을 놓고 매니큐어가 있는 면이 아래를 향하고 해부 매체와 접촉하도록 합니다. 가장자리를 아래로 눌러 게르마리아를 평평하게 하고 제자리에 고정합니다. 장착 챔버를 추가 박리 매체로 채우고 라이브 이미징으로 이동합니다.pH 6.5에서 ny 박리 완충액의 이미지 난소. pHluorin 및 mCherry 이미지의 픽셀 농도가 낮지만 카메라의 감지 한계 미만이 되지 않도록 설정을 조정합니다. 다음으로, pH 7.5에서 nygerion 박리 완충액에서 다른 난소 세트를 이미지화하고 pHluorin 및 mCherry 이미지의 픽셀 강도가 높지만 포화되지 않도록 설정을 조정합니다.이미지 난소 및 중탄산염 해부는 버퍼링하고 pHluorin 및 mCherry 이미지의 픽셀 농도가 선택한 설정으로 포화되지 않도록 합니다. 픽셀이 포화 상태이면 설정을 조정합니다. 적절한 라이브 이미징 설정을 선택한 후 각 조건에서 최소 5개의 게르마리아 이미지 수집을 진행합니다.피지에서 처리되지 않은 이미지를 별도의 창에서 각 채널과 함께 열어 배경을 뺍니다. 사각형 툴을 사용하여 pHluorin 채널 창에 관심 영역 또는 ROI를 그리고 신호가 없는 이미지의 일부를 그릴 수 있습니다. 배경 아래에 강도 값이 있는 픽셀이 제외되도록 임계값의 하한을 설정하고 임계값의 상한을 최대로 설정합니다.이러한 방식으로 임계값을 설정하면 신호가 없는 이미지 영역이 대부분 파란색이고 신호가 명확하게 보입니다. 임계값이 설정된 경우 측정값 설정 대화 상자로 이동하여 임계값 제한 상자를 선택해야 합니다. ROI에서 평균 형광 강도를 측정하고, process, math 메뉴로 이동하여 subtract 함수를 사용하여 이미지의 각 채널과 슬라이스에서 측정된 배경 강도를 뺍니다.mCherry 채널 창에 대해 단계를 반복하되, 선택 편집 메뉴에 있는 사각형 도구를 사용하여 새 사각형을 그리는 대신 선택 복원 기능을 사용하여 이미지에 동일한 크기와 위치를 가진 사각형을 추가합니다. 관심 세포가 mCherry 채널에서 가장 높은 형광 강도를 갖는 하나 이상의 슬라이스를 선택하고 원적색 채널의 콘카나발린 A 염색이 선택한 슬라이스 내에서 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 다음으로, 각 여포 줄기세포 또는 FSC 주위에 ROI를 그리고 pHluorin 및 mCherry의 평균 형광 강도와 측정을 위해 선택한 모든 슬라이스를 측정합니다.마지막으로, pHluorin 채널의 평균 형광 강도를 mCherry 채널의 평균 형광 강도로 나누어 pHluorin 대 mCherry 형광의 비율을 계산합니다. UAS mCherry pHluorin 및 10930 gal 4를 사용한 정량적 형광 현미경을 사용하여 2개의 germaria를 이미지화하고 concanavalin A 및 ROI로 염색한 여포 줄기세포 또는 FSC 또는 PFC와 여포 세포가 각 이미지에 표시됩니다. GFP 및 mCherry 채널의 형광 강도 비율은 표준 곡선을 사용하여 pH I 값으로 변환됩니다.pH I은 FSC의 6.8에서 여포 전 세포의 7.0, 여포 세포의 7.3으로 초기 FSC 계통의 분화에 따라 증가합니다. 각 세포 유형의 pH I 값은 pHluorin과 mCherry 비율의 차이를 보여주는 의사 색상 현미경 그래프로 나타낼 수 있으며, LUT에 의해 정의된 대로 이러한 색상 차이를 표시합니다. 이 절차를 시도할 때는 이 프로토콜의 많은 단계가 시간에 민감하기 때문에 모든 시약을 미리 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후,이 기술은 발달 생물학 분야의 연구자들이 세포 내 말라노 가스터의 황산염 결정에서 pH의 역할을 탐구 할 수있는 길을 열었습니다.

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한...

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다.

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜에 설명된 직립 이미징 방법을 사용하면 발달 중인 Drosophila melanogaster 난자의 극을 자세히 시각화할 수 있습니다.  이 최종 보기는 여포 상피에서 여러 세포 유형의 배열과 형태에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

미토콘드리아 기능의 조절 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 미토콘드리아 구조-기능 관계에 대한 분석이 필요합니다. 살아 있고 고정된 초파리 난소에서 미토콘드리아 구조와 기능을 연구하는 구체적인 방법이 이 논문에 설명되어 있고 시연됩니다.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 초파리 난소

Drosophila에서,oocyte 핵은 oogenesis 도중 microtubule 의존적인 이주를 겪습니다. 여기서, 우리는 계란 챔버 전 vivo에라이브 이미징을 수행하여 마이그레이션을 따라 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 우리의 절차는 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 다중 위치 3D 타임 랩스 영화를 취득하기 위해 12 시간 동안 살아있는 계란 챔버를 유지합니다.

드로소필라 오키테의 핵 이주

기저막은 발달 동안 조직 및 장기 형태 형성에 필수적입니다. 이 구조의 적절한 배치로 이어지는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 제시된 프로토콜은 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 상피 세포에서 기저막 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하고 특성화하는 방법을 설명합니다.

초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

배우세요 살아있는 초파리 난소 조직에서 여포 줄기 세포 계보의 세포내 pH를 정량적 형광 이미징으로 측정하는 방법을. 이 기술은 줄기 세포 행동과 발달 생물학 연구에 중요한 도구를 제공합니다.

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

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