Name: CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 배우세요 CLIC4 유전자 침묵화로 유도된 HN4 세포의 apoptosis에서 미토콘드리아 막 전위를 로다민 123 형광 염료로 실시간 측정하는 방법을. 이 기술은 암 세포에서 미토콘드리아 기능 이상과 세포 사멸 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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친절 하 게 우리는 세포 배양에 대 한 씨 차오 팡 감사합니다. 이 작품은 중국 (보조금 번호 81570403, 81371284);의 자연 과학 재단에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다 안후이 성 자연 과학 재단 (보조금 번호 1408085MH158); 안후이 의과대학;의 뛰어난 젊은 수 사관 안후이 성의 대학에 우수한 젊은 인재에 대 한 프로그램을 지원합니다.

1. 세포 배양과 Transfection
<ol><li>
세포 배양 참고: HN4, HNSCC 셀 라인, HNSCC14를 가진 환자에서 파생 되었다.<ol>
<li>Dulbecco의 문화 HN4 셀이 글 중간 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 항생제 (100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스) 보완 수정. 셀 5% CO2와 37 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 transfection
	<ol>
<li>Transfection, 전에 1 일 플레이트 5 x 105 셀 2 mL/6 잘 플레이트에 항생제 없이 문화 매체의.</li>
		<li>부드럽게 100 pmol CLIC4 siRNA 또는 감소 된 혈 청 미디어의 250 µ L에 스크램블 된 SiRNA를 희석. 감소 된 혈 청 미디어의 250 µ L에 5 µ L liposome 시 약을 희석 하 고 5 분 결합 희석된 liposome 시 약으로 희석된 siRNA에 품 어, 부드럽게, 혼합 실 온에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>각 잘 셀 및 매체를 포함 하는 혼합물을 추가 합니다. 뒤로-및-앞뒤 판 락으로 부드럽게 혼합. 다음 Rh123 라벨링 절차를 진행 하기 전에 24 h에 대 한 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 세포를 품 어. Transfection 후 정상적인 성장 매체 4 h와 매체를 교체 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Rh123 라벨
참고: Rh123 HN4 셀1MMP를 측정 하기 위하여 이용 되었다.
<ol><li>CLIC4 siRNA 치료 (제 1), 후 HN4 셀 6 잘 플레이트를 사용 하 여 다음과 같은 치료에 대 한. 각 HN4 셀의 양을 잘 coverslips에 10 번 실험을 반복에 충분 하다.</li>
	<li>새로운 12-잘 접시의 하단에 원형 coverslips를 넣어 핀셋을 사용 합니다. 격판덮개의 수는 실험 설계 (그림 1A)에 따라 설정 됩니다.</li>
	<li>12-잘 접시 안에 모든 coverslip의 중간에 100 µ g/mL polylysine의 150 µ L를 넣고 2 분 넣지는 coverslips 외부 polylysine에 주의 기 다. 다음 pipettor 여 polylysine를 철저 하 게 제거 (그림 1B).</li>
	<li>접시 안에 HN4 세포의 문화 매체를 제거 하 고 세포 분리를 1 mL 0.25 %trypsin 추가. 6 분 후 중화는 트립 신 2 mL 문화 매체를 추가 합니다. 부드럽게 믹스 pipettor에 의해 HN4 셀 5 번 및 씨앗 2-6 х 104 셀 원형 coverslips에. 5% CO2 (그림 1C) 37 ° C에는 인큐베이터에 배치 합니다.</li>
	<li>8 h 부 화 후 37 ° c.에 40 분 동안 2 µ / l Rh123 HN4 셀을 품 어 부드럽게 혼합 매체 (그림 1D)에 Rh123의 동등한 배급을 보장 하기 위해 중간 위아래 여러 번.</li>
	<li>준비 하는 충분 한 정상 생리 염 분 해결책 (NPSS); 만들려고 NPSS (mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 포도 당, 및 5 HEPES, pH 7.4). 물 욕조에 37 ° C로 예 열.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 제거 하는 coverslips 고 나머지 세척 간단 preheated NPBS 버퍼 (그림 1E)에 coverslips를 배치를 통해 액체.</li>
	<li>500 µ L 스테인레스 스틸 챔버의 하단에는 coverslips를 배치 ( 재료의 표참조) 교체 25 m m 유리 coverslip 바닥 o-ring에 의해 장소에서 봉인. (그림 1E) 약 실의 뚜껑을 강화 하 여 그것을 해결.</li>
	<li>450 µ L NPSS 버퍼 조립된 챔버에 preheated confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경 (그림 1E) 형광 현미경의 시야에서 목욕을 넣어 추가 합니다.</li>
</ol>3입니다.는 MMP의 탐지
<ol><li>
일반적인 형광 현미경
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 형광 현미경을 켭니다. 참고: 일반적인 형광 현미경 수은 램프 fiberoptic 광원, FITC 필터 Rh123에 대 한 설정으로 달성 되었다 (480/40 여기 필터, 505 LP dichroic 거울 및 535/40 방출 필터) 실내 온도에. 20 X 목표 수행 라이브 셀 이미징에 사용 되었다.</li>
		<li>이미징 시스템 소프트웨어를 열고 (그림 2A) 새로운 실험을 시작 하려면 명령 모음에서 "새로 만들기" 버튼을 선택 합니다.</li>
		<li>시야와 하얀 빛에 셀의 위치를 찾는 데 초점을 조정 합니다.</li>
		<li>하얀 빛을 버튼을 빛을 끄고. 명령 모음에서 "초점" 버튼을 클릭 하 고 "시작 초점" 형광에 스위치를 선택 합니다. 507 nm 여기와 529 nm 긴 패스 방출 현미경을 통해 다시 셀의 위치를 찾아 파장 (실험 하기 전에 설정). (그림 2B) 필요한 경우 다시 시야 및 초점 조정 합니다.</li>
		<li>만 20 ~ 30 분리 HN4 셀을 포함 하는 visual 필드를 선택 합니다. 각 셀에 대 한 세포내 형광 신호 변화는 정확 하 게 기록 됩니다.</li>
		<li>일단 명확한 시야 달성 클릭 "닫기 초점" 초점 바에서. 한 세트의 이미지를 얻으려고 명령 모음에서 "취득 한"을 클릭 합니다. 명령 모음에서 "지역"을 클릭 하 고 측정 영역을 편집 하 고 "확인" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 편집 영역 바에서 다른 지역 모양 연구에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>개별 셀의 다른 모양에 맞게 "추적 영역" 도구와 동그라미 하나의 단일 셀의 영역 선택한 끝나면 두 번 클릭 합니다. 모든 셀 때까지 절차 동그라미 (그림 2C)를 반복 합니다. "완료"를 클릭 하 고 저장 된 위치를 찾으려면 "이미지 저장"을 선택 합니다.</li>
		<li>클릭 "Zeroclock"그리고 신속 하 게 형광 강도의 변화를 모니터링을 시작 하려면 f 4를 밀어. 레코드는 실시간 변경 형광 강도의 모든 5 번 5 분 (그림 2D)에 대 한 s.</li>
		<li>때 초기 안정 되 고, 추가 50 µ L NPSS pipettor 통해 상공 100 mmol/L ATP의 0.5 µ L와 혼합. 시야 (그림 2E)를 제거 하지 않으려면 챔버를 만지지를 기억 하십시오. 참고: 20 분 기록 됩니다 형광 이미지 하 고 실험 수동 작업을 통해 고용할 수 있습니다. 시간 기간 정기적으로 전체를 관찰 하기 위해 20 분에 대 한 정착 형광 변화. 그러나, 예기치 않은 요인 때 전체 과정은 20 분 미만 또는 곡선의 안정성에 영향을 미칠 때 캡처를 중지 하려면 수동 작업이 적용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경
	<ol>
<li>공초점 레이저 형광 현미경 제조업체의 지침에 따라 스캔 켜고 번들된 소프트웨어를 엽니다. 참고: 여기, Rh123 488에서 설정 하는 아르곤 레이저에 의해 흥분 했다 및 내보낸된 신호 TD488/543/633 필터의 응용을 통해 545-700 nm의 범위에서 기록 되었다.</li>
		<li>63 X를 선택 하 고 "취득" 메뉴에서 "목표"를 클릭 / 1.4 렌즈 없음 오일. 표본을 관찰 하 고 가벼운 분야에서 명확한 시야를 찾을.</li>
		<li>형광 모드로 전환 하 여 현미경을 통해 어둠에서 셀의 위치를 찾을 올바른 형광 필터 선택 "TL/IL" 버튼을 눌러. "셔터" 표본 관찰이 끝나면 보호를 밀어.</li>
		<li>"취득" 메뉴에서 적합 한 PMT 채널 조정 하 고 "달성" 정착된 광학 경로 (그림 3A) 활성화를 클릭 합니다. "구성" 메뉴에서 클릭 하 고 필요한 레이저 종류를 확인 하려면 "레이저"를 선택 하십시오. "아르곤" (그림 3B)이이 프로토콜에 대 한 것이 좋습니다.</li>
		<li>"라이브" 실시간 이미지 고 시야만 20 ~ 30 분리 HN4 셀이 들어 있는지 확인을 클릭 합니다. 각 셀에 대 한 세포내 형광 신호 변화는 정확 하 게 기록 됩니다.</li>
		<li>(그림 3C) "취득" 메뉴에서 "인수" 하위 메뉴에 획득 모드에서 "xyt"를 선택 합니다. 설정 5 s와 20 분 시간 간격 및 기간, 각각. 클릭"적용" 모든 매개 변수는 침전 하는 때.</li>
		<li>"계량" 메뉴 아래 "폴리라인 그리기" 도구 사용 하 여 각 셀의 기록 영역을 원형. "선 프로 파일"을 선택 하 고 "시작" 관찰을 선택 합니다. 5 분 (그림 3D-E)에 대 한 형광 강도의 실시간 변화를 기록 합니다.</li>
		<li>때 초기 안정 되 고, 추가 50 µ L NPSS pipettor 통해 상공 100 mmol/L ATP의 0.5 µ L와 혼합. 시야를 제거 하지 않으려면 챔버를 만지지를 기억 하십시오. 참고: 형광 이미지 20 분 기록 됩니다 및 실험의 완료 다음.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 통계 분석
<ol><li>
일반적인 형광 현미경
	<ol>
<li>연산자의 설명서에 따라 정기적으로 형광 현미경을 켭니다. 이미징 시스템 소프트웨어 열고 저장 된 실험을 열려면 명령 모음에서 "열기" 버튼을 선택 합니다. ' 명령 모음 '에서 "지역"을 클릭 하 고 측정 영역을 편집 하려면 "확인" 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>"추적 영역" 도구 선택 및 동그라미 하나의 단일 셀의 영역을 더블 클릭 할 때. 절차를 반복 하 여 모든 셀 원이 되었습니다. "완료"를 클릭 하 고 선택 합니다 "F4: 앞으로"를 형광 강도 보여주는 추적 버튼.</li>
		<li>완료 되 면, 그래프의 오른쪽 아래 모서리에 있는 아래쪽 화살표 단추를 클릭 하 고 "그래프 데이터 표시" (그림 2F)을 클릭 합니다. "확인"을 두 번 클릭 하 고 데이터 처리 소프트웨어의 인터페이스를 열고 "로그 데이터" 버튼을 선택 합니다. "로그 데이터"를 다시 클릭 하 고 실시간으로 변동 형광 강도의 레코드가 스프레드시트에 찾을. 참고: 각 셀에 대 한 MMP에 변화 ATP 또는 TG (F1/F0)의 응용 프로그램 전에 강도 기준으로 형광의 비로 표시 했다. 형광 강도 데이터 각 20-30 셀의 평균 했다. Rh123에 대 한 데이터는 평균 ± SE. 결과 2 그룹에서 양측 독립 t 검정 및 P 값에 의해 테스트로 제시 < 0.05 통계적 의미도 고려 되었다. 통계 분석 소프트웨어는이 실험에서 통계 분석을 적용 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경
	<ol>
<li>공초점 레이저 현미경 켜고 제조업체의 지침에 따라 번들된 소프트웨어에 로그인.</li>
		<li>"화재" 기록 된 실험을 열을 선택 합니다.</li>
		<li>"계량" 메뉴 아래 "스택 프로 파일" 도구를 선택, 선택 "모두 하나" "채널 및 ROIs 정렬 차트."에서</li>
		<li>원 셀 영역 "무승부 다각형" 도구를 사용 하 여 관찰에 대 한.</li>
		<li>"그래프" 메뉴를 선택 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 "excel로 내보내기" 선택 스프레드시트 형광 강도의 값을 추가 하려면. 다음과 같은 분석은 일반 형광 현미경 (그림 3F) 일치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

잘 Cl− 채널 hemostasis 내부 환경의 유지에 필수적 이며 세포 증식 및 apoptosis15,16에 중요 한 역할을 문서화 되어있다. 따라서, 다양 한 암17에 대 한 더 나은 치료 방법의 찾을 큰 필요와 중요성의은 이온 채널 대상 개입 및 apoptosis의 관계를 이해. 미토 콘 드리 아 세포의 정상적인 생물학적 상태를 유지 하 고 기능 높은 막 침투성 및 막 횡단 잠재력에 관한. 암, 떨어져 축적 neuropathological 조사 문서화 미토 콘 드리 아 이상 myopathy, 심혈 관 질환, 감각 청각, 소 뇌 운동 실 조, 치 매 등 신경 증상에 기여 그리고 간 질18,19. 이러한 모든 임상 치료를 개량 하는 개입 대상으로 미토 콘 드...

Rh123 막 횡단 잠재력을 위한 지시자로 봉사 하는 양이온 형광 염료 이다. Rh123은 세포 막을 관통 하 고 막1내외의 잠재적인 차이 따라 미토 콘 드리 아 매트릭스 입력 가능 합니다. Apoptosis는 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성의 손상으로 이어집니다. Mitochondrion 침투성 전환 기 공 (MPTP) 열고에 미토 콘 드리 아의 바깥쪽에 Rh123의 방출 귀착되는 MMP의 축소로 이어질 것 이다. 마지막으로, 형광 현미경 강한 녹색 형광 신호를 감지 됩니다. 그것은 잘 MMP와 높은 막 침투성의 고갈 세포 apoptosis2의 초기 징후는 문서화 되어있다. 따라서, Rh123는 MMP 변화의 검출 및 세포 apoptosis의 발생에 적용할 수 있습니다.
세계에서 여섯번째 가장 일반적인 암으로 머리와 목 암 심각 하 게 사람의 건강3악화. 있지만 많은 접근은 최근 몇 년 동안에 개발 되었다, 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에서 고통 받는 환자에 대 한 치료의 임상 결과 여전히 이상4. 새로운 치료 방법을 탐구 하는 것은 HNSCC5에 대 한 치료를 개선할 수 있습니다. 수많은 생물 학적 프로세스를 포함 하는 이온 채널 다른 암6의 개발에 중요 한 역할을 표시 합니다. Cl- 채널의 부분 또는 전체 참여 매우 활성 마이그레이션, 확산 및 침해의 높은 비율을 포함 하 여 종양 약의 다양 한 속성에 포함 된다. 이 비추어 클릭, 비 발한 단백질 가족, 암 치료6,7에 대 한 치료 목표의 유망한 클래스 나열 되었습니다. 최근 연구는 계시 했다 CLIC1, CLIC4, CLIC5, 등 클릭 가족의 심장 미토 콘 드리 아를 지역화 반응성 산소 종 (선생님) 레벨 이며 CLIC5에 의해 upregulated Cl 있는 미토 콘 드리 아의 기능 역할을 나타내는 - apoptotic 응답8채널. CLIC4, (일컬어 mtCLIC, P64H1, 및 RS43), 클릭 가족의 한 구성원을 가장 광범위 하 게 암 세포 및 subcellular 위치 등 골, 바인딩과 그물 mitochondrion 인간의 apoptotic 규칙 속성에 대 한 공부 하고있다 keratinocytes7,,910. CLIC4의 식 프로필 종양 괴 사 인자-α (TNF-α), P53, 그리고 외부 자극에 의해 규제 했다. Overexpression 및 CLIC4의 downregulation Bcl-2 가족 구성원의 불균형 caspase 캐스케이드의 활성화 및 시 토 크롬 C11, 의 출시와 함께 미토 콘 드리 아 통로 통해 주로 apoptotic 응답 방 아 쇠 12 , 13. 따라서, MMP 측정 하는 중요 한 탐구 CLIC4 관련 apoptosis 그리고 Rh123 이상적인 형광 표시기로 제공.
현재 연구 HN4 셀에 CLIC4 최저 유도 된 apoptosis를 공부 하는 MMP의 검출에 대 한 자세한 프로토콜을 설명 합니다. Rh123 형광 프로브로는 MMP의 변화를 관찰 하는 데 사용 됩니다. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변동 해결 될 수 있습니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 자세히, 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여. 이 프로토콜도 다른 apoptosis 관련 연구에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HNSCC 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3241</td><td></td></tr><tr><td>폴리리신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P4981</td><td></td></tr><tr>human CLIC4 <td>Biomics</td><td>를</td> <td>위한 특이적 siRNA</td> NM_013943<td>(등록 번호, NM_013943; cDNA 서열에 해당 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) 및 스크램블 siRNA(5 ACGCGUAACGCGGGAAUUUU-3)는 Biomics Company</td></tr><tr><td>에서 설계 및 획득하였습니다.Lipofectamine 2000 트랜스펙션 시약&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-015</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 배지, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123, FluoroPure grede</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R22420</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 변형 이글 배지 (DMEM, 4.5 g/L 포도당)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 적격, 호주 원산지</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액</td><td>Beyotime</td><td>C0201</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>LEICA. SP5-DMI6000-DIC</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metaflour, v7.5.0.0</td><td>Universal Imaging Corporation</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Leica 응용 프로그램 제품군, v2.6.0.7266</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel 2007</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Plot 12.5</td><td>Systat 소프트웨어</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>아토플루오르 세포 챔버</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td></td></tr></tbody></table>

clic4 최저 유도 hn4 세포 apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

(MMP, ΔΨm) 잠재적인 미토 콘 드 리아 멤브레인의 고갈 apoptotic 캐스케이드에 초기 이벤트로 간주 됩니다. 그것은 심지어 핵 apoptotic 특성, chromatin 응축 및 DNA 파손 등 앞서 발생 합니다. 일단 MMP 붕괴, 세포 apoptosis 돌이킬 시작 됩니다. 질 성 양이온 염료의 일련 수 있습니다 세포 막 통과 mitochondrion, 매트릭스 내부 집계 및 MMP 변화를 평가 하기 위해 형광 마커 역할. Cl- 세포내 채널 (클릭) 가족의 6 멤버 중 하나로 CLIC4 주로 미토 콘 드리 아 통로 통해 셀 apoptotic 과정에 참여합니다. 여기 우리가 Rhodamine 123 (Rh123),이 통해 우리가 공부 CLIC4 최저에 의해 유도 된 apoptosis의 형광 변동 모니터링 통해 MMP를 측정 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 및 세부 사항에, 일반 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여.

현재 연구에서 Rh123는 MMP 감지에 적용 되었습니다. 처음, HN4 셀 다음 형광 실험을 얼룩에 대 한 교양 했다. 핀셋 6 잘 플레이트(그림 1)의 하단에 원형 coverslips를 넣어 사용 했다. 5 분에 대 한 polylysine는 coverslips 코팅 했다 고는 polylysine pipettor (그림 1B)를 통해 제거 하는 다음. 다음 HN4 셀 trypsinized 되었고 6 잘 플레이트의 하단에 배치 하는 coverslips에 시드. 다음, Rh123의 적절 한 금액은 추가 하 고 혼합 잘 (그림 1C-D). 데워 NPSS 세척, 후는 coverslip 보기 챔버로 조립 되었다. 적절 한 양의 N...

여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.

CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

이 방법은 세포사멸 및 미토콘드리아 기능 장애에 대한 이해를 포함하여 세포생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 단일 세포 내에서 로다민-123을 통해 미토콘드리아 막 전위의 실시간 모니터링을 쉽고 적절하게 수행할 수 있다는 것입니다. Text Protocol에 설명된 대로 두경부 세포 편평 암종에서 HN4 세포주를 배양합니다.transfection 하루 전, 항생제를 투여하지 않은 배양 배지당 2ml의 세포에 0.5 백만 개의 세포를 6-well plate에 플레이트화합니다. 100피코몰의 CLIC4 소형 간섭 RNA 또는 스크램블된 소형 간섭 RNA를 250마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 부드럽게 희석합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 리포좀 시약을 250마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 희석하고 5분 동안 배양합니다.희석된 small interfering RNA와 희석된 리포좀 시약을 결합하고 부드럽게 혼합합니다. 배지의 세포를 포함하는 각 웰에 혼합물을 추가합니다. 접시를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 섞습니다.CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도의 세포를 배양합니다. transfection 4시간 후에 배지를 일반 성장 배지로 교체하십시오. rhodamine-123 라벨링 절차를 진행하기 전에 추가로 20시간 동안 세포를 계속 배양합니다.6웰 플레이트에서 HN4 세포의 CLIC4 소형 간섭 RNA 처리 후 핀셋을 사용하여 새 12웰 플레이트의 바닥에 원형 커버슬립을 놓습니다. 12웰 플레이트 내부의 각 커버슬립 중간에 밀리리터당 100마이크로그램의 폴리리신 150마이크로리터를 피펫팅합니다. 2분 후 피펫터로 폴리리신을 철저히 제거합니다.다음으로, 접시 내부의 HN4 세포의 배양 배지를 제거하고 0.25 % 트립신 1 밀리리터를 첨가하여 세포를 분리합니다. 6분 후, 트립신을 중화하기 위해 2ml의 배양 배지를 첨가합니다. 피펫으로 HN4 세포를 5회 부드럽게 혼합하고 원형 커버슬립에 세포를 파종합니다.세포를 섭씨 37도의 5%CO2로 인큐베이터에 넣습니다. 8시간의 배양 후 로다민-123 리터당 2마이크로몰을 첨가하고 배지를 위아래로 여러 번 부드럽게 혼합하여 배지에 균일한 분포를 보장합니다. HN4 세포를 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다.핀셋을 사용하여 커버슬립을 제거하고 예열된 NPSS 버퍼에 잠시 옮겨 남은 액체를 씻어냅니다.500마이크로리터

detection-mitochondria-membrane-potential-to-study-clic4-knockdown

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam - MT)을 활용합니다.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를...

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.

E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

간세포에서 미토콘드리아 기능에 대한 환경 유기염소농약(OCP)의 영향을 이해하는 것은 대사 장애를 일으키는 OCP의 메커니즘을 탐구하는 데 중요합니다. 이 논문은 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다.

유기체 살충제에 노출된 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 실험 프로토콜

여기에서는 FAM83A 녹다운 절차를 보여줍니다. 자궁경부암 세포의 증식, 이동 및 침입에 대한 효과를 감지하기 위한 분석; 그리고 이 세포들이 시스플라틴에 감작됩니다. 이 연구는 자궁경부암에 대한 유망한 표적 유전자와 추가 약물 연구를 위한 참고 자료를 제공합니다.

자궁경부암 세포 성장 및 시스플라틴 감수성에서의 역할을 검증하기 위한 FAM83A 의 녹다운

배우세요 CLIC4 유전자 침묵화로 유도된 HN4 세포의 apoptosis에서 미토콘드리아 막 전위를 로다민 123 형광 염료로 실시간 측정하는 방법을. 이 기술은 암 세포에서 미토콘드리아 기능 이상과 세포 사멸 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

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