CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

이 방법은 세포사멸 및 미토콘드리아 기능 장애에 대한 이해를 포함하여 세포생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 단일 세포 내에서 로다민-123을 통해 미토콘드리아 막 전위의 실시간 모니터링을 쉽고 적절하게 수행할 수 있다는 것입니다. Text Protocol에 설명된 대로 두경부 세포 편평 암종에서 HN4 세포주를 배양합니다.

transfection 하루 전, 항생제를 투여하지 않은 배양 배지당 2ml의 세포에 0.5 백만 개의 세포를 6-well plate에 플레이트화합니다. 100피코몰의 CLIC4 소형 간섭 RNA 또는 스크램블된 소형 간섭 RNA를 250마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 부드럽게 희석합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 리포좀 시약을 250마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 희석하고 5분 동안 배양합니다.

희석된 small interfering RNA와 희석된 리포좀 시약을 결합하고 부드럽게 혼합합니다. 배지의 세포를 포함하는 각 웰에 혼합물을 추가합니다. 접시를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 섞습니다.

CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도의 세포를 배양합니다. transfection 4시간 후에 배지를 일반 성장 배지로 교체하십시오. rhodamine-123 라벨링 절차를 진행하기 전에 추가로 20시간 동안 세포를 계속 배양합니다.

6웰 플레이트에서 HN4 세포의 CLIC4 소형 간섭 RNA 처리 후 핀셋을 사용하여 새 12웰 플레이트의 바닥에 원형 커버슬립을 놓습니다. 12웰 플레이트 내부의 각 커버슬립 중간에 밀리리터당 100마이크로그램의 폴리리신 150마이크로리터를 피펫팅합니다. 2분 후 피펫터로 폴리리신을 철저히 제거합니다.

다음으로, 접시 내부의 HN4 세포의 배양 배지를 제거하고 0.25 % 트립신 1 밀리리터를 첨가하여 세포를 분리합니다. 6분 후, 트립신을 중화하기 위해 2ml의 배양 배지를 첨가합니다. 피펫으로 HN4 세포를 5회 부드럽게 혼합하고 원형 커버슬립에 세포를 파종합니다.

세포를 섭씨 37도의 5%CO2로 인큐베이터에 넣습니다. 8시간의 배양 후 로다민-123 리터당 2마이크로몰을 첨가하고 배지를 위아래로 여러 번 부드럽게 혼합하여 배지에 균일한 분포를 보장합니다. HN4 세포를 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다.

핀셋을 사용하여 커버슬립을 제거하고 예열된 NPSS 버퍼에 잠시 옮겨 남은 액체를 씻어냅니다.500마이크로리터 스테인리스강 챔버 바닥에 커버슬립을 놓고 교체 가능한 25mm 유리 커버슬립 바닥을 O-링으로 밀봉합니다. 챔버의 뚜껑을 조여 커버슬립을 제자리에 고정합니다.

조립된 챔버에 450마이크로리터의 예열된 NPSS 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 형광 현미경 또는 컨포칼 레이저 스캐닝 형광 현미경의 시야 아래에 수조를 놓습니다. 제조업체의 지침에 따라 형광 현미경을 켭니다.

이미징 시스템 소프트웨어를 열고 명령 모음에서 새 단추를 선택하여 새 실험을 시작합니다. 시야와 초점을 조정하여 백색광에서 세포의 위치를 찾습니다. 그런 다음 조명을 끄고 버튼을 눌러 백색광을 닫습니다.

명령 모음에서 초점 버튼을 클릭하고 초점 시작을 선택하여 형광을 켭니다. 507 나노미터 여기(excitation) 및 529 나노미터 장역 통과 방출 파장(long-pass emission wavelength)을 가진 현미경을 통해 세포의 위치를 다시 찾습니다. 시야를 조정하고 필요한 경우 다시 초점을 맞춥니다.

20-30개의 분리된 HN4 세포만 포함하는 시야를 선택합니다. 명확한 시야가 확보되면 초점 표시줄에서 초점을 닫습니다. 그런 다음, 명령 모음에서 하나를 획득하여 하나의 이미지 세트를 획득합니다.

그런 다음 명령 모음에서 영역을 클릭하고 확인 버튼을 클릭하여 측정 영역을 편집합니다. 개별 셀의 다른 모양에 맞추려면 추적 영역 도구를 선택합니다. 하나의 단일 셀 영역에 동그라미를 치고 완료되면 두 번 클릭합니다.

모든 셀에 원이 표시될 때까지 절차를 반복합니다. 완료를 클릭하고 이미지 저장을 선택하여 저장된 위치를 찾습니다. 제로 클럭을 클릭하고 F4를 빠르게 눌러 형광 강도의 변화를 모니터링하기 시작합니다.

5초 동안 5초마다 한 번씩 형광 강도의 실시간 변화를 기록합니다. 베이스라인이 안정되면 0.5마이크로리터의 100밀리몰 ATP와 혼합된 50마이크로리터의 NPSS를 피펫터를 통해 챔버에 추가합니다. 제조업체의 지침에 따라 컨포칼 레이저 스캐닝 형광 현미경을 켜고 번들 소프트웨어를 엽니다.

획득 메뉴에서 대물렌즈를 클릭하여 63X 1.4 개구수 오일 대물렌즈를 선택합니다. 표본을 관찰하고 라이트 필드 아래에서 선명한 시야를 찾으십시오. 조명 선택 버튼을 눌러 형광 모드로 전환하고 올바른 형광 필터를 선택하여 현미경을 통해 어둠 속에서 세포의 위치를 찾습니다.

관찰이 완료되면 셔터를 눌러 표본을 보호하십시오. 획득 메뉴에서 적절한 PMT 채널을 조정하고 달성을 클릭하여 정착된 광학 경로를 활성화합니다. 구성 메뉴를 클릭하고 레이저를 선택하여 필요한 레이저 유형을 결정합니다.

실시간 이미지를 얻으려면 라이브를 클릭하고 시야에 20-30개의 분리된 HN4 세포만 포함되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 획득 메뉴 아래의 수집 하위 메뉴에서 수집 모드에서 XYT를 선택합니다. 시간 간격은 5초, 지속 시간은 20분으로 설정합니다.

모든 매개변수가 정산되면 적용을 클릭합니다. quantify 메뉴에서 draw polyline 도구를 사용하여 각 셀의 기록 영역에 원을 그립니다. 라인 프로파일을 선택하고 관찰 시작을 선택합니다.

5분 동안 형광 강도의 실시간 변화를 기록합니다. 기준선이 안정되면 피펫터를 통해 0.5마이크로리터의 ATP 100밀리몰과 혼합된 50마이크로리터의 NPSS를 챔버에 추가합니다. 일반적인 형광 현미경을 사용하여 통계 분석을 수행하려면 이미징 시스템 소프트웨어를 열고 명령 모음에서 열기 버튼을 선택하여 저장된 실험을 엽니다.

명령 모음에서 영역을 클릭하고 확인 버튼을 클릭하여 측정 영역을 편집합니다. 추적 영역 도구를 선택합니다. 하나의 단일 셀 영역에 원을 치고 완료되면 두 번 클릭합니다.

모든 셀에 원이 그어질 때까지 절차를 반복합니다. 완료를 클릭하고 F4 앞으로 버튼을 선택하여 형광 강도를 보여주는 트레이스를 얻습니다. 완료되면 그래프의 오른쪽 아래 모서리에 있는 아래쪽 화살표 버튼을 클릭하고 그래프 데이터 표시를 클릭합니다.

확인을 두 번 클릭하고 로그 데이터 버튼을 선택하여 데이터 처리 소프트웨어의 인터페이스를 엽니다. 그런 다음 로그 데이터를 다시 클릭하여 스프레드시트에 나타나는 형광 강도의 실시간 변동 기록을 찾습니다. 다음은 일반적인 형광 현미경 검사로 해결된 것과 같은 다양한 개입 하에서 HN4 세포에서 ATP에 의해 유도된 미토콘드리아 탈분극의 변화를 보여주는 대표적인 결과입니다.

ATP 치료 후 미토콘드리아 막 탈분극이 급격히 증가하여 두 그룹 모두에서 점차 정상 수준으로 회복되었습니다. 로다민-123 형광 강도의 대표적인 흔적은 대조군과 비교했을 때 CLIC4 small interfering RNA의 MMP 처리가 미토콘드리아 탈분극을 향상시켰음을 보여줍니다. 대표적인 히스토그램은 CLIC4의 녹다운이 대조군에 비해 미토콘드리아 탈분극을 향상시켰다는 것을 추가로 밝혔습니다.

여기서, 대표적인 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 결과는 또한 다른 개입 하에서 HN4 세포에서 ATP에 의해 유도된 미토콘드리아 탈분극의 변화를 보여줍니다. 미토콘드리아 막 탈분극은 ATP 치료 후 급격히 증가하고 두 그룹 모두에서 점차 정상 수준으로 회복됩니다. 로다민-123 형광 강도의 대표적인 흔적은 CLIC4 small interfering RNA의 MMP 처리가 대조군에 비해 미토콘드리아 탈분극을 향상시켰음을 보여줍니다.

유사하게, 대표 히스토그램은 CLIC4의 녹다운이 대조군에 비해 미토콘드리아 탈분극을 향상시켰다는 것을 추가로 밝혔습니다. 이 비디오를 시청하면 로다민-123을 사용하여 일반 형광 현미경과 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 모두에서 미토콘드리아 막 전위를 실시간으로 모니터링하는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다. 로다민-123을 사용한 이 현미경 검사 기법을 완전히 익히면 제대로 수행된다면 샘플 1개에 대해 20분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 스캐닝 프로세스를 기다리는 주입 중에 챔버와 접촉하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 Western Blot 및 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 세포사멸 또는 괴사가 발생했는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 살아있는 과학 분야의 연구자들이 미토콘드리아 기능 장애를 탐구하고 다양한 살아있는 세포에서 세포 자멸사에 대한 확실한 증거를 찾을 수 있는 길을 열었습니다.

로다민-123으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 안면 마스크를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.