October 23rd, 2017
우리 유전자 교란 구 mutans 의 생성에 대 한 손쉬운, 신속한, 그리고 상대적으로 저렴 한 방법 설명 변종; 이 기술은 다양 한 종의 유전자 교란 종자의 생성에 대 한 적용할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 2단계 융합 PCR 및 전기천공법을 사용하여 표적 유전자 파괴 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것입니다. 이 방법은 관심 유전자가 어떻게 작용하는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않으며 전기천공을 위한 유능한 세포 준비가 매우 간단하다는 것입니다. 이 방법은 연쇄상구균 뮤탄스 유전자 파괴 기술에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 황색포도상구균과 같은 다른 미생물 종에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 새로운 개인은 두 번째 PCR에 대한 중첩 프라이머의 효과에 익숙하지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 시연은 우리 연구실의 연구 강사인 Ayako Okada 박사가 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 S.mutans UA159를 뇌, 심장 주입 또는 BHI 한천 플레이트에 줄무늬를 삽입하고 무산소 조건에서 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날에는 멸균된 이쑤시개를 사용하여 단일 집락을 선택하고 5ml의 BHI 육수에 접종합니다. 혐기성 조건에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 S.mutans 배양을 배양합니다. 다음으로, 2000배 G에서 15분 동안 배양물을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 PBS 5ml에 재현탁합니다. 다시 2000회 G로 15분 동안 원심분리기를 사용합니다. 생성된 세포 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. bead-beating 기반 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 현탁액에서 게놈 DNA를 추출합니다. 먼저 세포 현탁액을 유리 구슬이 들어 있는 2mm 샘플 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 750마이크로리터의 용해 용액을 세포 현탁액에 추가합니다. 튜브를 단단히 덮고 비드 비팅 파괴 장치의 튜브 홀더에 대칭으로 놓습니다. 5분 동안 최대 속도로 처리합니다. 구슬 두들겨 맞은 표본을 10, 1 분 동안 000 시간 G에 분리기. 상층액을 2ml 수집 튜브의 스핀 컬럼으로 옮기고 7000배 G로 1분 동안 원심분리합니다. 여과액에 1200마이크로리터의 DNA 결합 완충액을 추가하고 혼합물 800마이크로리터를 2밀리리터 수집 튜브의 스핀 컬럼으로 전달합니다. 10, 000 시간 G에 분리기 1 분. 플로우 스루를 폐기합니다. 스핀 컬럼에 200마이크로리터의 사전 세척 버퍼를 추가하여 1분 동안 10, 000회 G의 컬럼 매트릭스와 원심분리기를 세척합니다. 플로우 스루(flow-through)를 버리고 스핀 컬럼에 500마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하여 컬럼 매트릭스를 세척하고 다시 원심분리합니다. 각 스핀 컬럼을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 컬럼 매트릭스에 100마이크로리터의 용리 완충액을 추가합니다. 게놈 DNA를 용리하기 위하여 10, 000배 G에 30 초 동안 분리기. 분광 광도계를 사용하여 260 나노미터 및 280 나노미터에서 흡광도를 측정하여 DNA 농도와 순도를 추정합니다. 첫 번째 PCR은 S.mutans 야생형 게놈과 합성 스트렙토마이신 내성 유전자를 PCR 주형으로 사용하여 수행됩니다. 3세트의 프라이머를 사용하여 각각 glycosyltransferase C 또는 gtfC 유전자의 상류 측면 영역, gtfC 유전자의 하류 측면 영역, gtfC 유전자 및 스펙티노마이신 내성 유전자를 증폭합니다. 각 PCR 산물을 1% 아가로스 겔로 분획합니다. 첫 번째 PCR의 각 산물의 크기는 약 1KB여야 합니다. 겔 밴드 커터를 사용하여 해당 밴드를 절제하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 증폭된 각 DNA 산물을 정제합니다. 다음 단계는 거의 동일한 3개의 어금니 단편을 PCR 템플릿으로 사용하여 두 번째 PCR을 수행하는 것입니다. 이러한 단편은 적절한 프라이머를 사용하여 증폭되고 접합되어 파괴 구조를 생성합니다. 이 절차의 성공 여부는 2차 PCR에 의한 파괴 구축물의 증폭에 의존하기 때문에 전기영동으로 2차 PCR 산물을 확인하는 것이 중요합니다. PCR 반응 혼합물의 1/10을 0.8% 아가로스 겔에 로드하여 생성된 앰플리콘이 예측된 밴드 크기를 갖는지 확인합니다. 이 예에서는 중첩된 프라이머가 훨씬 더 나은 증폭을 제공했습니다. 남은 PCR 혼합물을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 55마이크로리터의 초순수를 추가하여 총 부피를 100마이크로리터로 조정합니다. 3개의 어금니 아세트산 나트륨 PH 5.2의 1/10 양을 추가하고, 100%에타놀 및 mix.Freeze의 2.5 양을 30 분 동안 영하 80 온도에 섞습니다. 15, 000 번 G에서 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리기. 원심분리가 완료되면 튜브 바닥에 펠릿이 있는지 확인합니다. 상등액을 버리십시오. 70%ethanol의 1 밀리리터를 가진 펠릿을 세척하고 15, 5 분 동안 4 섭씨 온도에 G 000 시간 G를 원심 분리기로 세척하십시오. 상층액을 버리고 펠릿을 약 30분 동안 자연 건조시킵니다. 마지막으로 펠릿을 10마이크로리터의 초순수로 용해시킵니다. 유능한 S.mutans UA159 세포는 이전에 섭씨 영하 80도에서 50마이크로리터 분취량으로 준비 및 저장되었으며, 얼음처럼 차가운 유능한 세포의 각 50마이크로리터 분취액과 5마이크로리터의 파괴 구조체를 혼합합니다. 전극 사이의 거리가 0.2cm인 전기천공(electroporation) 큐벳에 혼합물을 추가합니다. 전기천공계의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 모드를 사용하여 전기천공법을 수행합니다. 전기천공법 직후, 500마이크로리터의 BHI 배지에 세포를 현탁시키고 50마이크로리터의 현탁액을 스펙티노마이신 함유 BHI 한천 플레이트에 첨가합니다. 37에서 2-6일 동안 플레이트를 배양합니다.
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이 기사는 Streptococcus mutans의 유전자 파괴 변종을 생성하는 신속하고 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 이 기술은 다양한 박테리아 종에 사용할 수 있으며, 미생물학 분야의 유전학 연구를 발전시킬 수 있습니다.
Rapid, cloning-free gene disruption in Streptococcus mutans enables efficient functional genomics and accelerates target validation in microbial systems. This streamlined workflow reduces technical barriers and cycle times, supporting early-stage discovery and mechanistic de-risking for anti-infective R&D portfolios. The method's adaptability to other bacterial species enhances its strategic value for cross-species genetic interrogation.
This method integrates at the early discovery and target validation stage, providing a foundation for downstream screening and translational research in microbial genetics.