Name: 유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 배우세요 Streptococcus mutans 유전자 교란 균주를 생성하는 신속하고 비용 효율적인 방법을. 이 기술은 다른 세균 종에도 적용 가능하여 미생물학 유전 연구를 가속화합니다.

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이 작품은 과학의 승진 [부여 번호 16 K 15860 T.M. 15 K 15777 햄프셔를]에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다.

1. 뇌관 디자인 <ol><li>뇌관 2 단계 융합 PCR 및 유전자 장애의 확인에 대 한 준비. 
	주: 표 1이 프로토콜에 사용 되는 뇌관 시퀀스를 보여 줍니다. 그림 1 S. mutans Δ gtfC를 생성 하는 데 사용 하는 2 단계 융합 PCR 방법의 개요 그림을 보여준다.
	<li>디자인 뇌관 spectinomycin 저항 유전자 (spc r) 7 게놈에 대상 영역의 교체에 대 한 <ol>. 이 프로토콜 spc r gtfC 유전자의 코딩 지역 전체 바꿉니다.</li>
		<li>5에서 15 기지 spc r의 위쪽과 아래쪽 끝에 보완을 포함 &#39; 최대 역의 지역 및 다운-앞으로 뇌관, 각각. 마찬가지로, 5에서 15 베이스 gtfC의 업스트림 측면에 서 영역의 아래쪽 끝 및 gtfC의 다운스트림 측면에 서 영역의 위쪽 끝에 보완을 포함 &#39; spc r의 지역-앞으로 및 spc r -반전 뇌관, 각각 ( 그림 1A). 
		참고: 시퀀스의 최대 반전, 아래-앞으로, spc r-앞으로, 및 spc r-반전 뇌관 중단 구성의 사이트에 따라 자동으로 결정 됩니다.</li>
		<li>구성에 최대-앞으로 및 다운 반전 뇌관 디자인 &#62; 1 kb 업스트림 및 다운스트림 측면 gtfC 유전자의 지역 각각. 최대-앞으로의 녹는 온도 (T m)을 설정 하 고 다운-반전 뇌관 최대 반전 및 다운-앞으로 뇌관의 녹는 온도 따라 각각 ( 그림 1A). 
		참고: T m을 결정 하는 다음 수식에 참조: T m (° C) 2 = (* 나 + * NT) + 4 (* 노스캐롤라이나 + * NG)-5, 어디 * N (A, T, C, 또는 G) 지정 된 id 가진 뇌관 뉴클레오티드의 수를 나타냅니다.</li>
		<li>디자인 2 차 PCR ( 그림 1B)에 대 한 중첩 된 뇌관 (N_up-앞으로 및 N_up 역). 
		참고: 바깥쪽 뇌관 쌍 (최대-앞으로 및 역방향 다운) 2 차 PCR 뇌관으로 사용 될 수 있습니다, 있지만 중첩 된 뇌관 (N_up-앞으로 및 N_up 역)이이 프로토콜에 설계 되었습니다. 중첩 된 뇌관은 자주 필요 2 차 PCR, 대표 결과에 설명된대로.</li>
		<li>디자인 뇌관 spc r에 대 한 특정. GtfC 장애에 대 한 화면으로 식민지 PCR에 사용 되는 뇌관.</li>
		<li>GtfC의 확인에 대 한 디자인 뇌관 중단. 
		참고: 이러한 뇌관을 사용 하 여 증폭 PCR 제품 gtfC 또는 spc r 상류 또는 하류 측면 gtfC의 지역 사이 국경에 걸쳐져. 뇌관 세트 &#39; gtfC 최대-앞으로 및 gtfC 최대 역 &#39;와 &#39; gtfC 다운-앞으로 및 gtfC 다운 역 &#39; gtfC에 대 한 특정 및 &#39; gtfC 최대-앞으로 및 spc r 2 -역 &#39;와 &#39; spc r 2-앞으로 및 gtfC 다운 역 &#39; spc r에 대 한 특정 있다.</li>
	</ol></li></ol> 2. S. mutans에서 게놈 DNA 추출 <ol><li>행진 주식 S. 뮤턴트의 UA159 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 한 접시에. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 접시를 품 어.</li>
	<li>소독된 이쑤시개를 사용 하 여 단일 식민지를 데리 고 BHI 국물의 5 mL에 접종. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 S. 뮤턴트의 문화를 품 어.</li>
	<li>2000 × g.에서 15 분 동안 원심 분리기 세균성 세포 배양의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 mL에 셀 펠 릿 Resuspend.</li>
	<li>2000 × g.에서 15 분 동안 원심 분리기 PBS의 200 µ L에서 셀 펠 릿 Resuspend.</li>
	<li>제조업체에서 제공 하는 지침에 따라 비드 박동 베이스 게놈 DNA 추출 키트를 사용 하 여 정지에서 게놈 DNA를 추출.
	유리 구슬 (키트에 포함)를 포함 하는 <ol><li>전송 현 탁 액 2.0 mL 샘플 튜브. 세포 현 탁 액을 세포 솔루션 (키트에 포함)의 750 µ L을 추가.</li>
		<li>단단히 뚜껑과 구슬 박동 장애 기구의 튜브 홀더에 대칭으로 튜브를 놓습니다. 5 분에 대 한 최대 속도에서 프로세스입니다. 10000 × g.에 1 분 동안 구슬 구타 원심 분리기 샘플 2.0 mL 컬렉션 튜브 및 7000 × g .에서 1 분 동안 원심 분리기에서 회전 필터 (키트에 포함)에 상쾌한 전송</li>
		<li>추가 1200 µ L의 DNA 바인딩 버퍼 (키트에 포함)는 여과 액입니다. 10000 × g.에 1 분 동안 원심 분리기를 2.0 mL 컬렉션 튜브 (키트에 포함) 스핀 열에 혼합물의 800 µ L를 전송</li>
		<li>흐름을 통해 삭제 열 매트릭스를 세척 하 고 10000 × g. 흐름 통해 삭제에서 1 분 동안 원심, 스핀에 500 µ L 워시 버퍼 (키트에 포함)의 추가 스핀 열 미리 세척 버퍼 (키트에 포함)의 200 µ L을 추가 열 열 매트릭스를 세척 하 고 10000 × g.에 1 분 동안 원심을</li>
		<li>스핀 열 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 놓고 열 매트릭스를 100 µ L 차입 버퍼 (키트에 포함)의 추가.</li>
		<li>30 대 분리기 elute 게놈 DNA를 10000 × g에서 s. 260에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 농도 및 순도 추정 nm 및 280 nmusing 분 광 광도 계는 A 260 /A 280 비율이 1.8 보다 크면 확인 하십시오.</li>
	</ol></li></ol> 3. PCR 증폭 <ol><li>수행 1 세인트 PCR PCR 템플릿 (표 1 참조)으로 미 뮤턴트의 WT 게놈 및 합성 spc r 유전자를 사용 하 여. GtfC 유전자의 측면에 서 상류 지역, gtfC 유전자와 뇌관 당로 ( 그림 1A), 위에서 설명한의 3 세트를 사용 하 여 spc r 유전자의 측면에 서 하류 지역 증폭 표 2 및 표 3. 
	참고: PCR 뇌관, 시 약, 및 증폭 사이클에서 요약 된다 표 1, 표 2 및 표 3, 각각.</li>
	<li>1 %agarose 젤에 PCR 제품 각 충분치 고 젤 밴드 커터를 사용 하 여 해당 밴드 소비 세.</li>
	<li>스핀 열 및 실리 카 멤브레인 기반 젤 추출 키트를 사용 하 여 젤에서 각 증폭된 DNA 제품을 정화.
	<ol><li>전송 깨끗 한 microcentrifuge에 젤 조각 튜브와 500 µ L 바인딩 버퍼 (키트에 포함)와 혼합. 젤 조각 완전히 해산 될 때까지 15 분 동안 55 ° C에 혼합물을 품 어.</li>
		<li>(키트에 포함) 스핀 열 컬렉션 튜브 (키트에 포함)로, 스핀 열에 샘플 로드 놓고 30 원심 11000 × g에서 s. 통해 흐름, 워시 버퍼 (키트에 포함)의 600 µ L를 실리 카 막 씻어 30 원심 회전 열 추가 11000 × g에서 s.</li>
		<li>흐름을 통해 및 실리 카 막 건조 11000 × g에서 2 분 동안 원심 분리기 삭제.</li>
		<li>스핀 열 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브로, 50 µ L을 추가 차입 버퍼 (키트에 포함), 2 분에 대 한 실 온에서 품 어와</li>
		<li>11000에서 2 분 동안 원심 분리기 × g elute 증폭 된 DNA를. 260에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 농도 및 순도 추정 nm 및 280 nmusing 분 광 광도 계는 A 260 /A 280 비율이 1.8 보다 크면 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>수행 2 nd 2 단계 융합 표 2에 의하여 PCR 템플릿으로 세 약 아데닌 파편을 사용 하 여 PCR PCR < /st룽 > 및 표 3. 
	참고: 이러한 증폭 된 조각과 중첩 된 뇌관을 사용 하 여 접합 &#39; N_up-N_down-리버스와 &#39; 또는 바깥쪽 뇌관 &#39; 최대-앞으로 및 역방향 다운 &#39; ( 그림 1B). PCR 뇌관, 시 약, 및 증폭 주기 각각 표 1, 표 2 및 표 3에 요약 됩니다.</li>
	<li>0.8 %agarose 젤에 PCR 반응 혼합물 (5 µ L)의 1/10을 로드 하 고 적절 한 amplicon ( 그림 1C)의 생성을 확인 하려면 예상된 밴드 크기와 증폭된 밴드 크기 비교.</li>
	<li>정화 없이 에탄올 강 수에 의해 나머지 최종 PCR 제품 집중.
	<ol><li>추가 55 µ L의 울트라 순수 물 100 µL.Add에 총 볼륨을 조정 하려면 남은 PCR 혼합물에 3m 나트륨 아세테이트 (10 µ L), pH 5.2, 뒤에 100% 에탄올 (250 µ L)의 2.5 볼륨의 1/10 볼륨. 혼합 하 고 30 분-80에 대 한 동결 ° c.</li>
		<li>4 ° C에서 15000 × g에서 20 분 동안 원심 분리기 튜브의 하단에 펠 릿에 대 한 확인 하 고 삭제는 상쾌한. 70% 에탄올, 4 ° C에서 15000 × g에서 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL와 펠 릿을 세척 하 고는 상쾌한 삭제. 약 30 분 동안 펠 릿 건조 및 매우 순수한 물 10 µ L로 분해.</li>
	</ol></li></ol> 4. 유능한 세포 준비 및 셀 변환 <ol><li>행진 주식 S. 뮤턴트의 UA159 BHI 한 천 격판덮개에. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 접시를 품 어.</li>
	<li>소독된 이쑤시개를 사용 하 여 단일 식민지를 데리 고 BHI 국물의 5 mL에 접종. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 S. 뮤턴트의 문화를 품 어.</li>
	<li>뮤턴트 S. s 문화 2 mL 50 mL BHI 국물의 전송 및 6-8 h 600에서 광학 밀도를 37 ° C에서 품 어 혐 기성 조건 하에서 0.2-0.4 nm (OD 600).</li>
	<li>4 ° C에서 2000 × g에서 15 분 동안 세포를 원심, 상쾌한, 폐기 및 40 mL 40 mL 10% 글리세롤의 뒤 차가운 물로 두 번 셀 세척. 
	참고: 잔여 물질에 영향을 미칠 후속 electroporation.</li>
	<li>발음 파스퇴르 피 펫으로 신중 하 게 상쾌한 10% 글리세롤에 셀 펠 릿의 부착 감소. 신선한 10% 글리세롤의 1 mL에 셀 resuspend, 각 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 정지의 50 µ L를 분배 하 고 사용 직전까지-80 ° C에 저장.</li>
	<li>믹스 50 µ L 약 수 차가운 유능한 세포의 파괴의 5 µ L로 구성 섹션 3에에서 위에서 설명한. (전극 사이의 0.2 cm 거리)와 큐 벳 electroporation에 혼합물을 추가 합니다. 황색 포도상구균 모드 사용 (1.8 k v, 600 Ω, 10 µ F, 1 펄스)의 electroporate electroporation 기구.</li>
	<li>Electroporation 직후 BHI 국물의 500 µ L에서 세포를 일시 중단 하 고 spectinomycin 포함 된 BHI-한 천 배지를 현 탁 액의 50 µ L을 추가. 
	참고: 추가 보육 시간 후 electroporation 필요 하지 않습니다. 그러나, electroporation 후 1-2 h에 대 한 보육 변환 효율을 향상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 2-6 일 동안 접시를 품 어. 
	참고: 위에서 설명한 대로 S. mutans Δ gtfB가 생성 됩니다. GtfB 유전자의 전체 코딩 영역이 S. mutans Δ에 리스로 마이 신 저항 유전자 8 대체 gtfB. 각 S. mutans 긴장은 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 BHI 국물에 교양.</li>
</ol> 5. 유전자 장애 및 스토리지의 확인 <ol><li>임의의 식민지를 선택 하 고 식민지 PCR 표 2와 표 3을 수행을 PCR 혼합에 그들을 예방. PCR 뇌관, 시 약, 및 증폭 주기 각각 표 1, 표 2 및 표 3에 요약 됩니다.</li>
	<li>Spc r 것인지 1 %agarose 젤에 PCR 반응 혼합물을 로드-특정 DNA 밴드.</li>
	<li>혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 2 일 동안 소독된 이쑤시개와 spectinomycin 포함 된 BHI의 10 mL에 2 차 배양 세포를 사용 하 여 긍정적인 식민지 국물 선택.</li>
	<li>S. mutans Δ의 생성을 확인 gtfC.
	<ol><li>세포 현 탁 액을 동등 하 게 분할. 위에서 설명한 세포에서 게놈 DNA를 추출 (2.3 단계. 2.5.5에.). GtfC 장애 표 2와 표 3 (표 1)의 확인에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 PCR 템플릿으로 게놈 dna는 PCR을 수행. 
		참고: PCR 뇌관, 시 약, 및 증폭 사이클에서 요약 된다 표 1, 표 2 및 표 3, 각각.</li>
		<li>2 %agarose 젤에 PCR 혼합물을 로드 하 고 적절 한 amplicon .의 생성을 확인 하려면 예상된 밴드 크기와 증폭된 밴드 크기 비교</li>
		<li>4 2000 × g에서 15 분 동안 나머지 세포 현 탁 액을 원심 ° C. PBS의 5 mL에 셀 펠 릿 Resuspend.</li>
		<li>4 2000 × g에서 15 분 동안 원심 분리기 ° C. Resuspend 셀 포함 하는 25% 글리세롤 BHI 국물 1.5 mL에 작은 고-80 ° 오호-20 ° C에에서 저장</li>
	</ol></li></ol> 6. Phenotypic 분석 BHI 천 배지에 <ol><li>행진 각 S. 뮤턴트의 스트레인. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 접시를 품 어.</li>
	<li>소독된 이쑤시개를 사용 하 여 단일 콜로 니를 선택 하 고 적절 한 항생제 없이 BHI 국물의 2 개 mL에 접종. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>하룻밤 문화 서 스 펜 션의 20 µ L 유리 시험관에 항생제 없이 1% 또는 5% 자당을 포함 된 BHI 국물의 2 개 mL에 접종, 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 경사 위치에 테스트 튜브 셀 문화.</li>
	<li>소용돌이 유리 시험관 10 s 및 문화 현 탁 액을 가만히 따르다. 시험관 증류수로 세 번 세척. 0.25 %Coomassie 화려한 튜브 벽에 있는 biofilms 얼룩 (CBB) 블루 하 고 다음 1 분에 대 한 품 어의 1 mL을 추가</li>
	<li>얼룩 솔루션을 가만히 따르다, 증류수와 세 번 시험관을 세척 하 고 건조 테스트 튜브.</li>
	<li>색상 밀도 CBB 스테인드-biofilm phenotypic 분석에서 biofilm을 형성 하는 능력을 결정 하는 시각의 확장을 모두 평가.</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

현재 프로토콜 1세인트 PCR 뇌관 상류와 하류 측면 게놈에서 대상 영역의 영역 약 1kb를 증폭 설계 되어야 합니다. 이러한 긴 측면에 서 시퀀스는 동종 재결합의 효율성을 개선 하는 데 필요한.
뇌관의 시퀀스 (최대 반전, 아래-앞으로, spcr-앞으로, 및 spcr-리버스)이이 프로토콜에서 자동으로 결정 되었다 중단 구성의 사이트에 따라. 각 뇌관 15 기초 5' 영역에서 2차 PCR 서식 파일의 끝에 보완을 포함 되어 있습니다. 더 이상 바인딩 사이트 중단 건설의 보다 효율적인 생산을 수 있습니다. 각 뇌관의 5' 영역에서 적어도 10 보완 기지의 포함9것이 좋습니다.
중첩 된 뇌관 (N_up-앞으로 및 N_up 역) 바깥쪽 뇌관 (최대-앞으로 및 다운 역) 보다는 2<su...

유전자 기능 분석은 일반적으로 야생-타입 긴장과 긴장에 관심사의 특정 유전자 중단 되었습니다 phenotypic 비교를 포함 한다. 이 유전자-중단 기술은 다양 한 포유 동물에 박테리아에서 taxa에에서 유전자 기능 분석에 대 한 활용 되었습니다. 유전자 장애 개념은 유전자 교란 스트레인;의 생성에 필요한 이 deoxyribonucleic 산 (DNA) 구문 업스트림 및 다운스트림 영역 대상 유전자의 측면에 융합 항생제 내성 표시 유전자의 구성 되어 있으며 동종 재결합을 통해 게놈으로 통합 됩니다. 유전자 교란 스트레인 항생제를 포함 하는 선택적 미디어를 사용 하 여 격리 될 수 있습니다. 유전자 교란 스트레인의 건설에 사용 되는 기존의 방법 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR), 적당 한 플라스 미드, 제한 된 소화에 유전자의 결 찰에 의해 대상 유전자의 증폭 등의 복잡 한 단계 필요 효소, 그리고 항생제-저항 마커 유전자 삽입을 religation. 이 과정은 시간이 많이 걸리는, 각 단계의 성공에 따라 몇 주 몇 일 복용. 또한, 장애 구문 디자인 대상 유전자의 금지 효소 사이트에 따라 달라 집니다. 이러한 문제를 해결 하려면 DNA PCR 기반 접합 방법1,2 Dictyostelium discoideum3 , Synechocystis sp. PCC68034 의 돌연변이 유전자 교란의 디자인에 대 한 보고 되었습니다. 현재 연구에서 메서드는 상대적으로 손쉬운, 신속 하 고 저렴 한 방식으로, 파괴의 건설에 대 한 수정 된 PCR 기반 방법 (지정 2 단계 융합 PCR)을 이용 하 여 유전자 교란 연쇄 구 균 긴장을 생성 하 개발 되었다 구문 및 electroporation 유전자 변환에 대 한입니다.
PCR는 적절 하 게 genomic DNA, PCR 템플릿으로 항생제 내성 표시 유전자 및 4 쌍의 필요 2 단계 융합 oligonucleotide 뇌관 설계 되었습니다. 첫 번째 단계 (1세인트 PCR), 1 kb 업스트림 측면에 서 지역 1 kb 다운스트림 측면에 서 지역 대상의 대상 유전자의 유전자, 그리고 항생제-저항 마커 유전자 PCR에 의해 증폭 됩니다. 역방향 뇌관 및 증폭의 상류와 하류에 대 한 앞으로 뇌관의 5' 지역 지역, 각각, 측면 15 기지 마커 유전자의 끝에 보완을 포함 됩니다. 5' 영역 마커 유전자 증폭에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 비슷하게 포함 15 기초 대상 유전자의 상류 측면에 서 영역의 아래쪽 끝 고 대상 유전자의 하류 측면에 서 영역의 위쪽 끝을 보완 각각. 따라서, 3 개의 증폭 된 파편 퓨전 사이트에서 겹치는 30-기본적인 쌍 지역 포함. 두 번째 단계 (2차 PCR), 1세인트 PCR 템플릿으로 의해 증폭 3 조각을 사용 하 여 중첩된 한 PCR 뇌관으로 PCR 수행 됩니다. 서식 파일의 상호 보완적인 영역 또한 2차 PCR을 통해 서로 연결 됩니다. 마지막으로, 동종 재결합에 대 한 구문 electroporation 야생-타입 스트레인에 소개 된다. 성공적인 유전자 장애 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 확인 될 수 있습니다. 중단 구조는 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 증폭, 비록 추가 효소 반응, DNA 결 찰 등 DNA 소화, 구조를 생성 하기 위해 필요 하지 않습니다. 또한, 게놈에 삭제 또는 보존 지역 뇌관 디자인에 따라 유연 하 게 선택할 수 있습니다.
현재 작업에서 glucosyltransferase mutans 연쇄 상 구 균에에서 인코딩하는 gtfC 유전자의 전체 코딩 영역의 삭제 연쇄 구 균 종에서 신속 하 고 쉽게 유전자 장애 메서드를 보여 주기 위해 수행 되었다. 또한, gtfB-방해 스트레인 같은 방식으로 생성 된. GtfC 와 gtfB 에 의해 glucosyltransferases cariogenic 치과 biofilm 개발5,6에 기여 한다. 야생-타입의 biofilm 형성 능력 스트레인 (S. mutans WT), gtfC-스트레인 (S. mutans ΔgtfC), 및 gtfB중단-방해 스트레인 (S. mutans ΔgtfB) 평가 했다 대 한 비교 phenotypic 분석. 이 프로토콜 추가 종 유전자 장애에 대 한 2 단계 방법의 응용 프로그램을 확장 하 고 taxa의 넓은 범위에서 유전자 기능 연구에 대 한 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>실험실의 Streptococus mutans</td><td>Stock 균주.</td><td></td><td>야생형 균주(균주 UA159)</td></tr><tr><td>게놈 DNA 추출 키트</td><td>자이모 리서치</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>비드 박동 파괴 장치</td><td>타이텍</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>합성 유전자</td><td>유로핀 유전체학</td><td>맞춤형</td><td>주문 스펙티노마이신 및 에리트로마이신 내성 유전자</td></tr><tr><td>열 순환기</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머</td><td>Eurofins Genomics</td><td>맞춤 주문</td><td>35개 염기 길이</td></tr><tr><td>DNA 중합효소</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>고충실도 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>겔 추출 키트</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>아가로스 겔에서 DNA 추출</td></tr><tr><td>겔 밴드 커터</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>0.2cm 갭</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>혐기성 배양 시스템</td></tr><tr><td>뇌 심장 주입 국물</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>박테리아 배양 매체</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>항생제</td></tr><tr><td>에리스로마이신</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>항생제</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>생물막 현상용</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>생물막 염색용</td></tr></tbody></table>

유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

특정 유전자의 기능 설명에 대 한 일반적인 방법을 야생-타입 스트레인 및 관심사의 유전자 교란 되었습니다 했다 긴장의 비교 phenotypic 분석을 포함 한다. 유전자 장애 DNA 구조 적당 한 항생제 내성 표시 유전자를 포함 하는 박테리아의 변종 유전자 교란의 세대에 대 한 유용 합니다. 그러나, 전통적인 건축 방법, 유전자 복제 단계를 필요로 하는 복잡 하 고 시간이 걸리는 프로토콜을 포함 한다. 여기, 타겟된 유전자 장애 mutans 연쇄 상 구 균에 에서 대 한 상대적으로 손쉬운, 빠르고 비용 효율적인 방법을 설명 합니다. 메서드는 2 단계 융합 연쇄 반응 (PCR) 중단 구조 및 유전자 변환 위한 electroporation 생성 하 이용 한다. 이 메서드는 효소 반응, PCR, 이외의 필요 하지 않습니다 그리고 또한 중단 구성의 디자인 측면에서 더 큰 유연성을 제공 합니다. 고용 electroporation의 유능한 세포 준비를 용이 하 게 하 고 변환 효율을 향상 시킵니다. 현재 메서드는 다양 한 종의 유전자 교란 종자의 생성에 대 한 적응 수 있습니다.

그림 2 는 그 1세인트 PCR, 각 제품의 크기, 1 %agarose 젤에 관찰 했다 약 1 kb의 예상된 크기와 좋은 계약에. 그림 3 의 2차 PCR 제품의 젤 전기 이동 법 분석을 보여준다. 그림 4 는 S. mutans 식민지 붕괴 구조와 식민지 PCR 제품의 젤 전기 이동 법 분석 변환. 모든 식민지에서 amplicons 예측된 크기의 이었다. 그림 5 는 gtfC 중단 및 젤 전기 이동 법의 PCR 제품의 확인에 대 한 입문서-바인딩 사이트. GtfC-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 증폭 하 여 얻은 PCR 제품 확인 되었다 <e...

우리 유전자 교란 구 mutans 의 생성에 대 한 손쉬운, 신속한, 그리고 상대적으로 저렴 한 방법 설명 변종; 이 기술은 다양 한 종의 유전자 교란 종자의 생성에 대 한 적용할 수 있습니다.

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

이 절차의 전반적인 목표는 2단계 융합 PCR 및 전기천공법을 사용하여 표적 유전자 파괴 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것입니다. 이 방법은 관심 유전자가 어떻게 작용하는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않으며 전기천공을 위한 유능한 세포 준비가 매우 간단하다는 것입니다. 이 방법은 연쇄상구균 뮤탄스 유전자 파괴 기술에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 황색포도상구균과 같은 다른 미생물 종에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 새로운 개인은 두 번째 PCR에 대한 중첩 프라이머의 효과에 익숙하지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 시연은 우리 연구실의 연구 강사인 Ayako Okada 박사가 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 S.mutans UA159를 뇌, 심장 주입 또는 BHI 한천 플레이트에 줄무늬를 삽입하고 무산소 조건에서 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날에는 멸균된 이쑤시개를 사용하여 단일 집락을 선택하고 5ml의 BHI 육수에 접종합니다. 혐기성 조건에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 S.mutans 배양을 배양합니다. 다음으로, 2000배 G에서 15분 동안 배양물을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 PBS 5ml에 재현탁합니다. 다시 2000회 G로 15분 동안 원심분리기를 사용합니다. 생성된 세포 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. bead-beating 기반 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 현탁액에서 게놈 DNA를 추출합니다. 먼저 세포 현탁액을 유리 구슬이 들어 있는 2mm 샘플 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 750마이크로리터의 용해 용액을 세포 현탁액에 추가합니다. 튜브를 단단히 덮고 비드 비팅 파괴 장치의 튜브 홀더에 대칭으로 놓습니다. 5분 동안 최대 속도로 처리합니다. 구슬 두들겨 맞은 표본을 10, 1 분 동안 000 시간 G에 분리기. 상층액을 2ml 수집 튜브의 스핀 컬럼으로 옮기고 7000배 G로 1분 동안 원심분리합니다. 여과액에 1200마이크로리터의 DNA 결합 완충액을 추가하고 혼합물 800마이크로리터를 2밀리리터 수집 튜브의 스핀 컬럼으로 전달합니다. 10, 000 시간 G에 분리기 1 분. 플로우 스루를 폐기합니다. 스핀 컬럼에 200마이크로리터의 사전 세척 버퍼를 추가하여 1분 동안 10, 000회 G의 컬

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이...

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

효율적인 게놈 전체의 단일 유전자 돌연변이 방법은 사용하는...

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

출처: Lea-Smith, DJ, et al. 모델 시아노박테리아 종에서 마크 및 마커가 없는 돌연변이체의 생성. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이를 생성하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 시아노박테리아 배양으로 시작하여 표면 필리를 보존하는 원심분리 및 세척 단계가 이어집니다. 그런 다음 상동 서열 옆에 있는 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드를 도입합니다. 배양하는 동안 플라스미드는 필리를 통해 내재화되고 상동 재조합을 통해 표적 유전자를 대체합니다. 항생제 선택 및 재추출은 돌연변이 균주를 분리하고 정제하는 데 사용됩니다.

상동 재조합을 통한 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이체의 생성

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

시아노박테리아에 여러 게놈 변형을 도입하는 것은 산업 및 기초 연구 목적을 위한 균주 개발에 필수적인 도구입니다. 우리는 모델 시아노박테리아 종 Synechocystis sp. PCC6803에서 표시되지 않은 돌연변이와 Synechococcus sp. PCC7002에서 표시된 돌연변이를 생성하는 시스템을 설명합니다.

모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성

여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.

연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

여기서, 우리는 미국 식품의약국(FDA)에서 승인된 대장균에 비해 녹농균의 유전자 변형  균주의 감쇠를 평가하기 위해 마우스 모델의 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 상업적 응용을 위해 설명한다.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

배우세요 Streptococcus mutans 유전자 교란 균주를 생성하는 신속하고 비용 효율적인 방법을. 이 기술은 다른 세균 종에도 적용 가능하여 미생물학 유전 연구를 가속화합니다.

유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성

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