Name: 생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 학습하세요 생체 외에서 골수 유래 대식세포의 미엘린 파편 식균 작용을 평가하는 방법을. 형광 표지 기술과 지방 방울 염색을 활용하여 신경 외상 연구에 활용할 수 있는 효율적인 프로토콜입니다.

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저자는 글렌 생어 Hodgson, 비디오 제작, 편집, 및 음성에 그의 모든 작품에 대 한 의학의 FSU 대학에 미디어 전문가 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 국립 보건원 (R01GM100474 및 R01GM072611)에 의해 지원 되었다.

방법 여기에 설명 된 플로리다 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 제 2에서 고 관리 및 실험 동물의 사용, 8번째 버전에 대 한 가이드에에서 제시 된 지침을 따릅니다. . 모든 동물 들이이 프로토콜에 사용 되는 전용된 실험실 동물 시설에는 집 사용 까지입니다. 아니 vivo에서 실험 수행된 전에 희생 했다. 동물 숫자를 사용 하 여 평균 셀 및 myelin 컬렉션 가이드로 사용을 최소화 하기 위해 실험 필요에 근거 했다.
참고: 골 수 유래 세포 (BMDMs) (제 1), 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 myelin 파편 (제 2), myelin 파편 식 균 작용 (제 3), 분석 하기 위한 일반적인 절차의 준비의 생성이이 프로토콜에 설명 합니다 및 myelin 파편 지질 축적 (제 4)의 분석에 대 한 일반적인 절차. 시 약 준비, 셀 수확 및 조작, myelin 컬렉션 및 라벨, 성과 분석 결과 층 류 공기 biosafety 캐비닛에 완료 되어야 한다.
1. 기본 골 수 유래 세포의 생성
<ol>
	<li>완전 한 대 식 세포 배양 (CMCM)의 준비 참고: 골에서 대 식 세포 생성 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 사용 해야 합니다. 이 준비 M-CSF의 소스로 L929 murine 구와 조건 미디어를 활용합니다.<ol>
		<li>145 m m 요리 50 mL의 높은 포도 당 (4500 mg/L L-포도 당) Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 7 일 동안 5% 새로운 태어난된 송아지 혈 청 (NCS)와 페니실린/스 보충으로 자란 세포에 의해 L929 murine 구와 단련 미디어를 생성 합니다.</li>
		<li>3500 x g, 4 ° c.에 30 분 동안 50 mL 원뿔 원심 분리기 및 원심 분리기로 문화에서 미디어를 수집</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 supernatants 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링. 바른된 미디어-80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>높은 포도 당 DMEM, 추가 5 %vol / vol NCS, 15 %vol / vol L929 murine 구와 조절 된 DMEM, 및 1% 페니실린/스. 2-3 개월 동안 4 ° C에서 미디어를 저장할 수 있습니다. 사용 하기 전에 37 ° C에 따뜻한.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>기본 골 수 세포와 대 식 세포 유도의 컬렉션 
	참고: 이 프로토콜 한 마우스를 사용 하 여 약 20 백만 골 수 유래 세포 (BMDMs)을 생성 합니다.<ol>
		<li>8 10 주 오래 된 마우스 표준 공동2 질 지침을 사용 하 여 다음 자 궁 경부 전위의 원하는 수 안락사</li>
		<li>70% (vol/vol) 에탄올: h 조2O를 사용 하 여, 포화 모피 동물을 청소.</li>
		<li>복 부에 작은 오프닝 고 신중 하 게 다시 기본 조직을 공개 피부를 당겨. 복 막 구멍을 찌를 하지 주의 하십시오.</li>
		<li>엉덩이에서 시작 하 고 발목에서 끝나는 두 뒷 다리를 제거 합니다. 장소 5-10 mL의 멸 균 인산 염을 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 수집 된 조직 버퍼링 식 염 수 (PBS) 보충 1% 페니실린/스. 
		참고: 때 처리 하는 여러 동물 조직 저하를 제한 하는 얼음 요리 계속 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>메스를 사용 하 여 뼈에서 근육과 결합 조직을 제거 합니다. 대 퇴 골과 경골을 사용 하는 셀의 컬렉션에 대 한 비 골 삭제 될 수 있습니다.</li>
		<li>메스와 각 끝에서 작은 부분을 트리밍에 의해 수집 된 뼈의 골 수 구멍을 노출 합니다.</li>
		<li>25g 바늘을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 CMCM와 골 수 구멍 플러시. 일단 그들은 충분히 플러시될 뼈 흰색 표시 됩니다.</li>
		<li>컬렉션 완료 되 면 생성 된 단일 세포 현 탁 액을 30-90 s 18 g 바늘 aspirates 교 반 하십시오. 
		참고: 선택적 적혈구 (RBC) 세포 단계는이 시점에서 수행할 수 있습니다. 그것은 최근에 세포내 철 macrophage 양극 화16시 myelin 파편의 효과 영향 수 있습니다 제안 되었습니다. RBC 세포 단계의 포함에 대 한 내용은 Trouplin 외를 참조 하십시오. 17.</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 70 µ m 살 균 셀 스 트레이너를 통해 정지를 필터링 합니다.</li>
		<li>씨앗 145 mm 셀 문화 요리 15-20 mL CMCM에 균등 하 게 세포를 수집. 마우스 희생 당 약 3 개의 문화 요리를 사용 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 문화를 품 어.</li>
		<li>72 시간 한번 비 부착 한 세포를 제거 하 살 균 PBS 가진 접시 세척, 후 추가 15-20 mL 신선한 CMCM. 37 ° C, 5% CO2에서 추가 4 일 문화를 품 어. 7 일 후 총 문화, 처음 고립 된 조 혈 골 수 세포 성숙 BMDMs (그림 1) 될 것입니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 Myelin 파편의 생성
참고: 모든 시 약 4 ° C에서 1 개월까지 저장할 수 있습니다.
<ol>
	<li>Myelin 파편 수집 시 약의 준비
	<ol>
		<li>Tris· 준비 Cl 버퍼 솔루션입니다.<ol>
			<li>800 mL 증류수 이온된 H2O (ddiH2O) 추가 20 mL의 1 M Tris· Cl, 100 m m 나2EDTA (2mm 최종 농도)의 pH는 7.45 (최종 농도 20 mM) 및 20 mL</li>
			<li>PH 7.45 조정 합니다. DdiH20.2 µ m 여과 장치를 통해 오 필터 솔루션 1000ml를 볼륨을 조정 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>1 M 자당 솔루션을 준비 합니다.<ol>
			<li>Tris·의 100 ml Cl 버퍼 솔루션, 자당의 68.46 g 추가. Tris·와 200 mL에 양을 맞추십시오 Cl 버퍼 솔루션입니다. 0.2 µ m 여과 장치를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tris·와 1 M 솔루션을 diluting 하 여 0.32 M 자당 솔루션 200ml를 준비 Cl 버퍼 솔루션 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
		<li>Tris·와 1 M 솔루션을 diluting 하 여 0.83 M 자당 솔루션의 150 mL를 준비 Cl 버퍼 솔루션 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>두뇌 파생 하는 원유 myelin 파편의 컬렉션 
	참고: 여기에 설명 된 수집 방법 원유 myelin 파편의 격리입니다.<ol>
		<li>뒤에 자 궁 경부 전위 표준 공동2 질 지침을 사용 하 여 나이의 8-10 주 10-12 마우스를 안락사.</li>
		<li>두뇌를 해 부 고 0.32 M 자당 솔루션의 10 mL를 포함 하는 100 mm 접시에 그들을 배치.</li></ol></li></ol>얼음에 접시를 유지.
		<li>로 머리를 잘라 불 임 수술가 위를 사용 하 여 약 5 m m3 크기에 조각.</li>
		<li>조직 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 0.32 M 자당 솔루션의 약 30 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>부드러운 솔루션 달성 될 때까지 무 균 휴대용 로타리 균질 화기와 균질.</li>
		<li>0.32 M 자당 솔루션 90 mL의 최종 볼륨을 무 균된 두뇌를 희석.</li>
		<li>6 38.5 mL 얇은 벽 폴 리 프로필 렌 ultracentrifuge 튜브, 0.83 M 자당 솔루션의 20 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>부드럽게 두 레이어를 혼합 하지 않도록 주의 복용 0.83 M 자당 솔루션의 상단에 무 균된 뇌 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>0.32 M 자당 솔루션 각 튜브의 균형.</li>
		<li>적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 원심 분리기는 미리 ultracentrifuge로 터를 냉각. 로 터 가속 및 감속 myelin 파편 손실을 줄이기 위해 최소 값으로 설정 합니다.</li>
		<li>두 자당 밀도의 인터페이스에서 myelin 파편을 수집 합니다. 
		참고: 파편 튜브의 중심을 향해 백색 악대로 나타납니다.</li>
		<li>50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 원유 myelin 파편을 결합 하 고 대략 35 ml Tris·를 사용 하 여 볼륨 조정 Cl 버퍼 솔루션입니다.</li>
		<li>30-60 s에 대 한 살 균 휴대용 로타리 균질 화기와 원유 myelin 파편을 균질.</li>
		<li>6 깨끗 한 ultracentrifuge 튜브와 Tris·의 적절 한 양으로 균형 사이 정지를 균등 하 게 분하시오 Cl 버퍼 솔루션입니다.</li>
		<li>적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 원심 분리기는 미리 ultracentrifuge로 터를 냉각. 그들의 최대 값으로 회전자 가속 및 감속을 설정.</li>
		<li>단단한 흰색 알 약 표시 됩니다 이제,는 상쾌한 삭제 하 고 다시 Tris·의 10-15 mL에 알 약을 중단 Cl 버퍼 솔루션입니다.</li>
		<li>2 깨끗 한 ultracentrifuge 튜브와 Tris·의 적절 한 양으로 균형 사이 정지를 균등 하 게 분하시오 Cl 버퍼 솔루션입니다.</li>
		<li>원심 분리기 다시는 적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 미리 냉각 ultracentrifuge로 터. 그들의 최대 값으로 회전자 가속 및 감속을 설정.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 하 고 살 균 PBS의 5-6 mL에 산 탄을 resuspend 미리 무게 1.5 mL 마이크로 원심 튜브의 적절 한 수 사이 정지를 나눕니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 22000 x g에서 원심 분리기</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 myelin 파편 알갱이의 무게를 결정 합니다.</li>
		<li>다시 일시 중단 알 약 PBS에서 100 mg/mL의 최종 농도에. 
		참고: 10 ~ 12 두뇌 100 mg/mL myelin 파편의 10-15 mL을 생산 하기 위해 충분 하다. Myelin 파편 6 개월-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	
	
	<li>Myelin 파편 형광 라벨
	<ol>
		<li>즉시 사용 하기 전에 50 µ M carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 솔루션을 준비 합니다.<ol>
			<li>살 균 PBS를 사용 하 여, CFSE 50 µ M의 최종 작업 농도를 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 준비의 5 m m 재고 솔루션을 희석.</li>
			<li>0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>100 mg/mL myelin 파편의 원하는 금액을 해 동 하 고 다시 무 균 29 g 바늘으로 일시 중단. 
		참고: 그것은 사용 하기 전에 물의 resuspension 필요한 솔루션 중 퇴 하면 myelin 파편을 동결.</li>
		<li>미리 무게 1.5 mL 마이크로 원심 튜브를 myelin 파편을 전송 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>100 µ L myelin 파편 일지도 당 CFSE 솔루션의 200 µ L에 myelin 파편을 resuspend.</li>
		<li>실 온 (RT) 빛에서 보호에서 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>워시 버퍼의 600-800 µ L에 펠 릿을 resuspend (0.2 µ m 필터 소독 PBS에 100mm 글리신).</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>단계 2.3.8-2.3.9 두 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>최종 세척 후 myelin 파편 펠 릿의 무게를 확인 하 고 다시 살 균 PBS 가진 100 mg/mL를 일시 중단 합니다. 참고: 레이블이 myelin 파편 최대 6 개월까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>

3. myelin 파편 식 균 작용 분석 결과
참고: 다음 붙일 레이블된 myelin 파편 식 균 작용을 관찰 하는 기본 방법입니다. 다른 트리 트 먼 트 및 실험 조건 추가 조사에 의해 최적화 될 필요 합니다.
<ol>
	<li>치료 접시의 준비
	<ol>
		<li>각 145 m m 플레이트 수집 성숙 BMDMs 10 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5-6 mL를 사용 하 여 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (dPBS) (pH 7.4)에. 
		참고: 로 셀18의 활성화 상태를 변경할 수 있습니다에 트립 신을 사용 하지 마십시오.</li>
		<li>수집 된 세포의 각 튜브를 미리 데워 진된 CMCM의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>20 ° c.에 8 분 180 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>다시 CMCM 셀 수를 일시 중단 합니다.</li>
		<li>24 잘 셀 문화 판의 각 우물에 CMCM의 1 mL에 1 x 105 셀을 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin 파편 처리 및 분석
	<ol>
		<li>100 mg/mL CFSE의 10 µ L 표시 각 잘 (1 mg/mL 최종 농도)를 myelin 파편을 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2에서 1-3 시간 동안 품 어.</li>
		<li>3 회 비를 가득 채우고 myelin 파편 제거 하 살 균 PBS 가진 접시를 씻어.</li>
		<li>각 우물에 4 %paraformaldehyde 400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어</li>
		<li>2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.</li>
		<li>각 우물에 Hoechst 33258 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다. 빛에서 보호 하는 RT에 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.</li>
		<li>Photobleaching를 줄이기 위해 각 잘에 Tris 버퍼와의 불 화-젤 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>거꾸로 피 형광 수 있는 현미경을 사용 하 여 이미지 셀. 
		참고: CFSE의 여기 및 방출 파장은 494 nm 및 521 nm, 각각.</li>
		<li>CFSE 긍정적인 셀 수 상대 myelin 파편 통풍 관을 결정 하는 핵의 수로 나눕니다.</li>
		<li>이미징, 이전 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 최대 7 일 동안 접시를 유지 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 기름 빨간 O 얼룩 통해 세포내 지질의 정량화
참고: 다음 세포내 myelin 파편 파생 지질을 관찰 하는 기본 방법입니다.CFSE myelin 파편을 표시를 사용 하 여 오로의 형광 정량화에 대 한 권장 하지 않습니다 스펙트럼 오버랩 때문에 얼룩. 다른 트리 트 먼 트 및 실험 조건 추가 조사에 의해 최적화 될 필요 합니다.
<ol>
	<li>얼룩이 솔루션의 준비
	<ol>
		<li>0.5% 기름 빨간 O (오로) 얼룩 솔루션을 준비 합니다.<ol>
			<li>천천히 오 (교 반 하면서 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol)로 0.5 g을 100 mL 100% 프로필 렌 글리콜 (1, 2-Propanediol)의 추가.</li>
			<li>또는 모든 큰 입자는 해산 될 때까지 15 분 동안 95 ° C에 솔루션을 열. 
			참고: 이상의 100 ° c.가 열 하지 마십시오</li>
			<li>새 컨테이너로 아직 따뜻한 반면 필터 종이 통해 해결책을 필터링 합니다.</li>
			<li>실시간 솔루션에서 멋진 하룻밤 솔루션 실시간에서 1 년까지 저장 될 수 있도록</li>
		</ol>
		</li>
		<li>85% 프로필 렌 글리콜 솔루션을 준비 합니다.<ol>
			<li>DdiH2오 볶음까지 혼합의 15 mL를 100% 프로필 렌 글리콜의 85 mL를 추가 합니다. 솔루션은 실시간에서 1 년까지 저장 될 수 있다</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>치료 접시의 준비
	<ol>
		<li>섹션 3에서 설명 하는 방법을 24-잘 접시를 준비 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin 파편 치료
	<ol>
		<li>각 잘 (1 mg/mL 최종 농도)를 100 mg/mL myelin 파편의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1-3 h 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.</li>
		<li>3 번 비 소화 myelin 파편 제거 살 균 PBS 가진 접시를 씻어. 참고:이 시점에서 접시도 즉시 고정 받을 수 있습니다 또는 신선한 CMCM 추가 될 수 있다, 고 셀 반환 추가 시간 포인트에 대 한 보육.</li>
		<li>각 우물에 4 %paraformaldehyde 400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어</li>
		<li>세척 접시 2 번 살 균 PBS 다음 얼룩을 진행할.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>오로 얼룩이 지 고 분석
	<ol>
		<li>워시 ddiH2오 3 번 플레이트를 고정</li>
		<li>각 잘을 100% 프로필 렌 글리콜의 400 µ L을 추가 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어 
		참고:이 ddiH2o.의 carryover 줄어</li>
		<li>프로필 렌 글리콜을 발음 하 고 각 잘 하 오로 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>60 ° c.에 8 분 동안 품 어</li>
		<li>오로 솔루션 발음 다음, 각 잘을 85% 프로필 렌 글리콜의 400 µ L을 추가 하 고 실시간에 5 minumintes에 대 한 품 어</li>
		<li>세척 접시 3 번 ddiH2o.</li>
		<li>각 우물에 Hoechst 33258 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다. RT, 빛에서 보호에서 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.</li>
		<li>각 우물에 Tris 버퍼와의 불 화-젤 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>거꾸로 피 형광 수 있는 현미경을 사용 하 여 이미지 셀. 오로 표준 텍사스 레드 또는 DsRed 필터 세트를 사용 하 여 몇 군데 있습니다.</li>
		<li>각 이미지 필드에 오로 긍정적인 영역을 결정 하 고 핵의 수로 분할 하 여 상대 지질 보존을 계량.</li>
		<li>4 ° C에서 7 일에 대 한 번호판 빛 으로부터 보호 유지.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 공개 있다.

여기에 설명 된 절차 활용 갓 고립 된 원유 CNS myelin 파편과 기본 골 수 유래 세포. 동물 비용을 줄이기 위해,이 좋습니다 모두 두뇌 및 희생의 때에 각 마우스에서 골 수 세포 수확. 두 연구원 협력 동시에 두 재료를 준비할 수 있습니다. 또는, 두뇌 myelin 파편 격리 전에 항생제로 보충 하는 PBS에-80 ° C에 저장할 수 있습니다. 그것은 우리의 경험을 머리 최대 1 개월 myelin 파편 생성 잠재력의 손실 없이 감지할 수 이러한 조건에서 유지 될 수 있었습니다.
CFSE는 형광 강도 및 사용의 용이성 때문에 myelin 파편을 분류 하는 데 사용 됩니다. 휴대 전화 esterases 분자14에 아세테이트 그룹을 쪼개까지 염료 침묵과 남아 있습니다. 해제 된 succinimidyl 에스테 르 그룹 다음 세포질 단백질14공유 첨부 파일에 결과 기본 amides로 반응 수 있...

골 수 유래 세포 (BMDMs) 타고 난 및 적응형 면역 시스템 사이의 중요 한 링크입니다. 항 원 제시 세포 (Apc), 그들은 모두 항 원 프레 젠 테이 션을 통해 세포와 통신할 수 있습니다 고 cytokine 릴리스1,2,3. 그러나, 직업적인 식 세포로 그들의 주요 기능은 병원 균, 나이 든된 세포 및 세포질 파편1,4입니다. 척수 상해 (SCI), 다음 myelin 파편의 대량은 CNS 축 삭 myelination5에 대 한 책임 셀 형식은 죽어가는 oligodendrocytes에서 생성 됩니다. 우리와 다른 myelin 파편의 침투 BMDMs5,,67의 주로 책임은 나타났습니다. 그러나, 척수 상해 내 사이트 engulfment myelin 파편의 프로-염증 성 상태5,,89로이 일반적으로 염증 세포 변화 제안 되었습니다. 부상된 척수에서 신경 염증의 주요 중재자, BMDMs로 중요 한 임상 대상입니다.
척수 부상된에서 BMDMs의 영향을 조사 하기 위해, 우리는 생체 외에서 모델을 직접 BMDMs myelin 파편에 대처 하는 방법을 연구를 개발 했습니다. 생물 학적 관련성을 높이기 위해 기본 murine BMDMs와 갓 고립 된 myelin 파편이이 조사에 사용 됩니다. 따라서, 여기에 제시 하는 방법 또한 자세히 분리와 기본 murine BMDMs의 문화 그리고 murine CNS를 격리 하는 데 사용 하는 수정 된 자당 그라데이션 기법 파생 myelin 파편10,,1112. Myelin 파편 형광 염료, 트랙 BMDMs CFSE에 의해 그것의 국제화는이 응용 프로그램에 적합 잘-세포 독성 때문에 및 그것의 좁은 형광 스펙트럼 허가 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE), 쉽게 표시 될 수 있습니다. 13,14프로브 다른 형광과 멀티플렉싱 합니다. 먹어서, 다음 myelin 파편 지질은 리소좀을 통해 수송 하 고 세포내 지질 방울5에 중립 지질으로 패키지. 이 세포내 지질 축적을 계량 하는 기름 빨간 O (오로) 양적 이미지 분석을 위해 최적화 하는 방법 얼룩 선물이. 이 간단한 얼룩 방법은 강력한 재현할 결과 및 정량화15를 생성합니다. 이러한 메서드는 제한 된 특수 장비로 myelin 파편 식 균 작용 및 지질 보존의 연구를 촉진 한다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>L-글루타민, 피루브산 나트륨이 함유된 고포도당</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X 용액</td></tr><tr><td>New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>United States Origin</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, strain L의 유도체]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 컨디셔닝 배지 준비</td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td>의 세포주 <td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>폴리스티린, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE 세포 증식 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO 화해를 위한</td></tr><tr><td>Fluoro-gel with Tris Buffer&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>시그마 알드리치</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, 폴리프로필렌, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti 초원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti 로터, 스윙 버킷, 티타늄</td></tr><tr><td>휴대용 로터리 균질화기</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 myelin 파편 식 균 작용

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

골 수 유래 세포 (BMDMs)는 수 입자의 다양 한 비운의 직업적인 식 세포로 서 중요 한 생리 적인 역할을 봉사 하는 성숙한 백혈구. 일반적으로, 중앙 신경 시스템 (CNS)에서 BMDMs 제한 됩니다 하지만 부상, 다음 그들은 쉽게 침투 수 있습니다. 일단 부상된 CNS 조직 내의 BMDMs 부상 파생 세포 부스러기, 지질 풍부한 myelin 파편의 다량을 포함 하 여의 허가 대 한 책임 1 차 셀 유형입니다. BMDM 침투 및 myelin 파편 식 균 작용 CNS 내의 neuropathological 파급 효과 복잡 하 고 잘 이해 있습니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 연구에 대 한 직접적인 생체 외에서 BMDMs의 CNS 상해의 컨텍스트에서 허용. 우리는 murine BMDM 절연 및 문화, myelin 파편 준비 및 분석 실험 BMDM myelin 파편 식 균 작용을 평가 하기 위해 커버. 이 기술은 중요 한 전문된 장비 또는 자료에 대 한 필요 없이 강력한 같지는 결과 아직 연구자의 요구에 맞게 쉽게 사용자 지정할 수 있습니다.

CFSE myelin 파편 분류와 BMDMs의 치료 분명 국제화 (그림 2) 항복 한다. 3-시간 상호 작용 시간 강력한 다운스트림 검출을 위한 충분 한 추가 myelin 파편 phagocytose에 BMDMs에 대 한 충분 한 동안, 상호 작용의 1 시간 만큼 적게와 세포내 축적을 관찰할 수 있습니다. 그러나, 일부 myelin 파편 여전히 존재할 수 있습니다 세포 표면에 세척 후. 이 부족 한 세척 또는 입자 안 먹어서의 초기 단계 동안 내 면 완벽 하 게 되 고 있을 수 있습니다.
BMDMs 빠르게 myelin 파편을 internalize 수 있다, 하는 동안 lysosomal 처리 오로 stainable 지질 작은 물방울 형태로 하기 전에 필요 합니다. 설명 하기 위해, BMDMs myelin 파편으로 90 분 동안 incubated, 세척, 되었고 이전에 고정 하 고 (그림 3</...

선물이 phagocytic 용량의 기본 murine 골 수 유래 세포 붙일 레이블된 myelin 파편과 세포내 지질 작은 물방울 얼룩을 사용 하 여 평가 하는 방법.

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 뇌 유래 미엘린 파편의 골수 유래 대식세포 식세포작용을 평가하는 것입니다. 이 프로토콜은 신경 외상 분야의 주요 질문에 답하기 위해 고안되었습니다. 이 방법의 장점은 in vitro 대식세포 반응, 특히 미엘린 파편에 대한 골수 유래 대식세포의 식세포 능력을 효율적이고 상대적으로 비용 효율적으로 분석할 수 있다는 것입니다.이 방법은 외부 변조기의 영향을 조사하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 마우스를 70 % 에탄올로 포화시킨 후 복부 피부에 구멍을 뚫습니다. 피부를 뒤로 당겨 다리를 드러내고 해부합니다.이 과정에서 복막강에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. 노출되면 발목과 엉덩이를 잘라 다리를 제거합니다. 항생제가 보충된 얼음처럼 차가운 PBS에 다리를 놓습니다.다른 쪽 다리에 대해서도 반복합니다. 항생제를 첨가한 얼음처럼 차가운 신선한 PBS로 조직을 세척하여 해부 중에 조직에 부착되었을 수 있는 미립자를 제거합니다. 근육을 따라 부드럽게 긁어내는 동작으로 원치 않는 조직의 대부분을 제거할 수 있습니다.메스와 핀셋으로 근육과 결합 조직에서 경골을 풀어줍니다. 풀리면 양쪽 끝을 제거하여 골수 구멍을 노출시킵니다. 대퇴골에 대해 이 과정을 반복합니다.완전한 골수 유래 대식세포 배지로 채워진 20mm 주사기에 25게이지 바늘을 부착합니다. 그런 다음 골수강을 세척합니다. 뼈가 충분히 씻겨지면 하얗게 나타납니다.수집된 골수 흡입액을 18게이지 바늘로 30-90초 동안 교반하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 다음으로 멸균된 70마이크로미터 공극 크기의 세포 여과기에 현탁액을 통과시킵니다. 세포 현탁액을 145cm 세포 배양 접시에 고르게 나눕니다.각 마우스는 총 세 가지 요리를 제공하기에 충분합니다. 7일간의 배양 후 이러한 요리는 일반적으로 성숙한 대식세포와 70-80% 정도 합류합니다. 뇌에서 미정제 미엘린 파편을 분리하기 위해 일련의 자당 구배 초원심분리 단계가 수행됩니다.우선, 생후 8주에서 10주 사이의 쥐에서 10-12개의 뇌를 해부합니다. 그런 다음 뇌는 0.32 몰 자당 용액에서 균질화 된 다음 0.383 몰 자당 용액 쿠션 위에 층을 이루어 불연속 구배를 만듭니다. 원심분리 후, 조잡한 미엘린 파편은 층 사이의 계면에서 발견됩니다.이를 수집하여 Tris 완충 용액에 분배하고 다시 원심분리하여 미엘린 파편을 펠릿화합니다. 펠릿은 Tris 완충 용액에 다시 현탁되고 추가

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

우리는 macrophage- C.를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 디지털 광 현미경을 사용하여 비 - 용해성 세포 외 유출의 프로세스에 특정 중점을 실시간으로 상호 작용. 개별적 감염된 대 식세포를이 방법을 사용하는 것은 이러한 현상의 다양한 양태를 확인하기 위해 조사 될 수있다.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화 크립토 콕 쿠스 네오 포르 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

본 프로토콜은 미세아교세포의 미세세포세포 파편에 대한 반복적인 자기 자극의 효과를 평가하기 위해 고안되었습니다. 이를 위해 체외 미세아교세포와 미엘린 파편 공동 배양 시스템이 구축되었습니다.

반복되는 자기 자극 하에서 체외 에서 Myelin 파편의 미세아교세포 형성 평가

학습하세요 생체 외에서 골수 유래 대식세포의 미엘린 파편 식균 작용을 평가하는 방법을. 형광 표지 기술과 지방 방울 염색을 활용하여 신경 외상 연구에 활용할 수 있는 효율적인 프로토콜입니다.

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

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