Name: 생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 학습하세요 생체 외에서 골수 유래 대식세포의 미엘린 파편 식균 작용을 평가하는 방법을. 형광 표지 기술과 지방 방울 염색을 활용하여 신경 외상 연구에 활용할 수 있는 효율적인 프로토콜입니다.

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저자는 글렌 생어 Hodgson, 비디오 제작, 편집, 및 음성에 그의 모든 작품에 대 한 의학의 FSU 대학에 미디어 전문가 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 국립 보건원 (R01GM100474 및 R01GM072611)에 의해 지원 되었다.

방법 여기에 설명 된 플로리다 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 제 2에서 고 관리 및 실험 동물의 사용, 8번째 버전에 대 한 가이드에에서 제시 된 지침을 따릅니다. . 모든 동물 들이이 프로토콜에 사용 되는 전용된 실험실 동물 시설에는 집 사용 까지입니다. 아니 vivo에서 실험 수행된 전에 희생 했다. 동물 숫자를 사용 하 여 평균 셀 및 myelin 컬렉션 가이드로 사용을 최소화 하기 위해 실험 필요에 근거 했다.
참고: 골 수 유래 세포 (BMDMs) (제 1), 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 myelin 파편 (제 2), myelin 파편 식 균 작용 (제 3), 분석 하기 위한 일반적인 절차의 준비의 생성이이 프로토콜에 설명 합니다 및 myelin 파편 지질 축적 (제 4)의 분석에 대 한 일반적인 절차. 시 약 준비, 셀 수확 및 조작, myelin 컬렉션 및 라벨, 성과 분석 결과 층 류 공기 biosafety 캐비닛에 완료 되어야 한다.
1. 기본 골 수 유래 세포의 생성
<ol>
	<li>완전 한 대 식 세포 배양 (CMCM)의 준비 참고: 골에서 대 식 세포 생성 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 사용 해야 합니다. 이 준비 M-CSF의 소스로 L929 murine 구와 조건 미디어를 활용합니다.<ol>
		<li>145 m m 요리 50 mL의 높은 포도 당 (4500 mg/L L-포도 당) Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 7 일 동안 5% 새로운 태어난된 송아지 혈 청 (NCS)와 페니실린/스 보충으로 자란 세포에 의해 L929 murine 구와 단련 미디어를 생성 합니다.</li>
		<li>3500 x g, 4 ° c.에 30 분 동안 50 mL 원뿔 원심 분리기 및 원심 분리기로 문화에서 미디어를 수집</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 supernatants 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링. 바른된 미디어-80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>높은 포도 당 DMEM, 추가 5 %vol / vol NCS, 15 %vol / vol L929 murine 구와 조절 된 DMEM, 및 1% 페니실린/스. 2-3 개월 동안 4 ° C에서 미디어를 저장할 수 있습니다. 사용 하기 전에 37 ° C에 따뜻한.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>기본 골 수 세포와 대 식 세포 유도의 컬렉션 
	참고: 이 프로토콜 한 마우스를 사용 하 여 약 20 백만 골 수 유래 세포 (BMDMs)을 생성 합니다.<ol>
		<li>8 10 주 오래 된 마우스 표준 공동2 질 지침을 사용 하 여 다음 자 궁 경부 전위의 원하는 수 안락사</li>
		<li>70% (vol/vol) 에탄올: h 조2O를 사용 하 여, 포화 모피 동물을 청소.</li>
		<li>복 부에 작은 오프닝 고 신중 하 게 다시 기본 조직을 공개 피부를 당겨. 복 막 구멍을 찌를 하지 주의 하십시오.</li>
		<li>엉덩이에서 시작 하 고 발목에서 끝나는 두 뒷 다리를 제거 합니다. 장소 5-10 mL의 멸 균 인산 염을 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 수집 된 조직 버퍼링 식 염 수 (PBS) 보충 1% 페니실린/스. 
		참고: 때 처리 하는 여러 동물 조직 저하를 제한 하는 얼음 요리 계속 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>메스를 사용 하 여 뼈에서 근육과 결합 조직을 제거 합니다. 대 퇴 골과 경골을 사용 하는 셀의 컬렉션에 대 한 비 골 삭제 될 수 있습니다.</li>
		<li>메스와 각 끝에서 작은 부분을 트리밍에 의해 수집 된 뼈의 골 수 구멍을 노출 합니다.</li>
		<li>25g 바늘을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 CMCM와 골 수 구멍 플러시. 일단 그들은 충분히 플러시될 뼈 흰색 표시 됩니다.</li>
		<li>컬렉션 완료 되 면 생성 된 단일 세포 현 탁 액을 30-90 s 18 g 바늘 aspirates 교 반 하십시오. 
		참고: 선택적 적혈구 (RBC) 세포 단계는이 시점에서 수행할 수 있습니다. 그것은 최근에 세포내 철 macrophage 양극 화16시 myelin 파편의 효과 영향 수 있습니다 제안 되었습니다. RBC 세포 단계의 포함에 대 한 내용은 Trouplin 외를 참조 하십시오. 17.</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 70 µ m 살 균 셀 스 트레이너를 통해 정지를 필터링 합니다.</li>
		<li>씨앗 145 mm 셀 문화 요리 15-20 mL CMCM에 균등 하 게 세포를 수집. 마우스 희생 당 약 3 개의 문화 요리를 사용 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 문화를 품 어.</li>
		<li>72 시간 한번 비 부착 한 세포를 제거 하 살 균 PBS 가진 접시 세척, 후 추가 15-20 mL 신선한 CMCM. 37 ° C, 5% CO2에서 추가 4 일 문화를 품 어. 7 일 후 총 문화, 처음 고립 된 조 혈 골 수 세포 성숙 BMDMs (그림 1) 될 것입니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 Myelin 파편의 생성
참고: 모든 시 약 4 ° C에서 1 개월까지 저장할 수 있습니다.
<ol>
	<li>Myelin 파편 수집 시 약의 준비
	<ol>
		<li>Tris· 준비 Cl 버퍼 솔루션입니다.<ol>
			<li>800 mL 증류수 이온된 H2O (ddiH2O) 추가 20 mL의 1 M Tris· Cl, 100 m m 나2EDTA (2mm 최종 농도)의 pH는 7.45 (최종 농도 20 mM) 및 20 mL</li>
			<li>PH 7.45 조정 합니다. DdiH20.2 µ m 여과 장치를 통해 오 필터 솔루션 1000ml를 볼륨을 조정 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>1 M 자당 솔루션을 준비 합니다.<ol>
			<li>Tris·의 100 ml Cl 버퍼 솔루션, 자당의 68.46 g 추가. Tris·와 200 mL에 양을 맞추십시오 Cl 버퍼 솔루션입니다. 0.2 µ m 여과 장치를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tris·와 1 M 솔루션을 diluting 하 여 0.32 M 자당 솔루션 200ml를 준비 Cl 버퍼 솔루션 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
		<li>Tris·와 1 M 솔루션을 diluting 하 여 0.83 M 자당 솔루션의 150 mL를 준비 Cl 버퍼 솔루션 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>두뇌 파생 하는 원유 myelin 파편의 컬렉션 
	참고: 여기에 설명 된 수집 방법 원유 myelin 파편의 격리입니다.<ol>
		<li>뒤에 자 궁 경부 전위 표준 공동2 질 지침을 사용 하 여 나이의 8-10 주 10-12 마우스를 안락사.</li>
		<li>두뇌를 해 부 고 0.32 M 자당 솔루션의 10 mL를 포함 하는 100 mm 접시에 그들을 배치.</li></ol></li></ol>얼음에 접시를 유지.
		<li>로 머리를 잘라 불 임 수술가 위를 사용 하 여 약 5 m m3 크기에 조각.</li>
		<li>조직 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 0.32 M 자당 솔루션의 약 30 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>부드러운 솔루션 달성 될 때까지 무 균 휴대용 로타리 균질 화기와 균질.</li>
		<li>0.32 M 자당 솔루션 90 mL의 최종 볼륨을 무 균된 두뇌를 희석.</li>
		<li>6 38.5 mL 얇은 벽 폴 리 프로필 렌 ultracentrifuge 튜브, 0.83 M 자당 솔루션의 20 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>부드럽게 두 레이어를 혼합 하지 않도록 주의 복용 0.83 M 자당 솔루션의 상단에 무 균된 뇌 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>0.32 M 자당 솔루션 각 튜브의 균형.</li>
		<li>적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 원심 분리기는 미리 ultracentrifuge로 터를 냉각. 로 터 가속 및 감속 myelin 파편 손실을 줄이기 위해 최소 값으로 설정 합니다.</li>
		<li>두 자당 밀도의 인터페이스에서 myelin 파편을 수집 합니다. 
		참고: 파편 튜브의 중심을 향해 백색 악대로 나타납니다.</li>
		<li>50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 원유 myelin 파편을 결합 하 고 대략 35 ml Tris·를 사용 하 여 볼륨 조정 Cl 버퍼 솔루션입니다.</li>
		<li>30-60 s에 대 한 살 균 휴대용 로타리 균질 화기와 원유 myelin 파편을 균질.</li>
		<li>6 깨끗 한 ultracentrifuge 튜브와 Tris·의 적절 한 양으로 균형 사이 정지를 균등 하 게 분하시오 Cl 버퍼 솔루션입니다.</li>
		<li>적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 원심 분리기는 미리 ultracentrifuge로 터를 냉각. 그들의 최대 값으로 회전자 가속 및 감속을 설정.</li>
		<li>단단한 흰색 알 약 표시 됩니다 이제,는 상쾌한 삭제 하 고 다시 Tris·의 10-15 mL에 알 약을 중단 Cl 버퍼 솔루션입니다.</li>
		<li>2 깨끗 한 ultracentrifuge 튜브와 Tris·의 적절 한 양으로 균형 사이 정지를 균등 하 게 분하시오 Cl 버퍼 솔루션입니다.</li>
		<li>원심 분리기 다시는 적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 미리 냉각 ultracentrifuge로 터. 그들의 최대 값으로 회전자 가속 및 감속을 설정.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 하 고 살 균 PBS의 5-6 mL에 산 탄을 resuspend 미리 무게 1.5 mL 마이크로 원심 튜브의 적절 한 수 사이 정지를 나눕니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 22000 x g에서 원심 분리기</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 myelin 파편 알갱이의 무게를 결정 합니다.</li>
		<li>다시 일시 중단 알 약 PBS에서 100 mg/mL의 최종 농도에. 
		참고: 10 ~ 12 두뇌 100 mg/mL myelin 파편의 10-15 mL을 생산 하기 위해 충분 하다. Myelin 파편 6 개월-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	
	
	<li>Myelin 파편 형광 라벨
	<ol>
		<li>즉시 사용 하기 전에 50 µ M carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 솔루션을 준비 합니다.<ol>
			<li>살 균 PBS를 사용 하 여, CFSE 50 µ M의 최종 작업 농도를 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 준비의 5 m m 재고 솔루션을 희석.</li>
			<li>0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>100 mg/mL myelin 파편의 원하는 금액을 해 동 하 고 다시 무 균 29 g 바늘으로 일시 중단. 
		참고: 그것은 사용 하기 전에 물의 resuspension 필요한 솔루션 중 퇴 하면 myelin 파편을 동결.</li>
		<li>미리 무게 1.5 mL 마이크로 원심 튜브를 myelin 파편을 전송 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>100 µ L myelin 파편 일지도 당 CFSE 솔루션의 200 µ L에 myelin 파편을 resuspend.</li>
		<li>실 온 (RT) 빛에서 보호에서 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>워시 버퍼의 600-800 µ L에 펠 릿을 resuspend (0.2 µ m 필터 소독 PBS에 100mm 글리신).</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>단계 2.3.8-2.3.9 두 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>최종 세척 후 myelin 파편 펠 릿의 무게를 확인 하 고 다시 살 균 PBS 가진 100 mg/mL를 일시 중단 합니다. 참고: 레이블이 myelin 파편 최대 6 개월까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>

3. myelin 파편 식 균 작용 분석 결과
참고: 다음 붙일 레이블된 myelin 파편 식 균 작용을 관찰 하는 기본 방법입니다. 다른 트리 트 먼 트 및 실험 조건 추가 조사에 의해 최적화 될 필요 합니다.
<ol>
	<li>치료 접시의 준비
	<ol>
		<li>각 145 m m 플레이트 수집 성숙 BMDMs 10 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5-6 mL를 사용 하 여 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (dPBS) (pH 7.4)에. 
		참고: 로 셀18의 활성화 상태를 변경할 수 있습니다에 트립 신을 사용 하지 마십시오.</li>
		<li>수집 된 세포의 각 튜브를 미리 데워 진된 CMCM의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>20 ° c.에 8 분 180 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>다시 CMCM 셀 수를 일시 중단 합니다.</li>
		<li>24 잘 셀 문화 판의 각 우물에 CMCM의 1 mL에 1 x 105 셀을 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin 파편 처리 및 분석
	<ol>
		<li>100 mg/mL CFSE의 10 µ L 표시 각 잘 (1 mg/mL 최종 농도)를 myelin 파편을 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2에서 1-3 시간 동안 품 어.</li>
		<li>3 회 비를 가득 채우고 myelin 파편 제거 하 살 균 PBS 가진 접시를 씻어.</li>
		<li>각 우물에 4 %paraformaldehyde 400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어</li>
		<li>2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.</li>
		<li>각 우물에 Hoechst 33258 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다. 빛에서 보호 하는 RT에 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.</li>
		<li>Photobleaching를 줄이기 위해 각 잘에 Tris 버퍼와의 불 화-젤 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>거꾸로 피 형광 수 있는 현미경을 사용 하 여 이미지 셀. 
		참고: CFSE의 여기 및 방출 파장은 494 nm 및 521 nm, 각각.</li>
		<li>CFSE 긍정적인 셀 수 상대 myelin 파편 통풍 관을 결정 하는 핵의 수로 나눕니다.</li>
		<li>이미징, 이전 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 최대 7 일 동안 접시를 유지 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 기름 빨간 O 얼룩 통해 세포내 지질의 정량화
참고: 다음 세포내 myelin 파편 파생 지질을 관찰 하는 기본 방법입니다.CFSE myelin 파편을 표시를 사용 하 여 오로의 형광 정량화에 대 한 권장 하지 않습니다 스펙트럼 오버랩 때문에 얼룩. 다른 트리 트 먼 트 및 실험 조건 추가 조사에 의해 최적화 될 필요 합니다.
<ol>
	<li>얼룩이 솔루션의 준비
	<ol>
		<li>0.5% 기름 빨간 O (오로) 얼룩 솔루션을 준비 합니다.<ol>
			<li>천천히 오 (교 반 하면서 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol)로 0.5 g을 100 mL 100% 프로필 렌 글리콜 (1, 2-Propanediol)의 추가.</li>
			<li>또는 모든 큰 입자는 해산 될 때까지 15 분 동안 95 ° C에 솔루션을 열. 
			참고: 이상의 100 ° c.가 열 하지 마십시오</li>
			<li>새 컨테이너로 아직 따뜻한 반면 필터 종이 통해 해결책을 필터링 합니다.</li>
			<li>실시간 솔루션에서 멋진 하룻밤 솔루션 실시간에서 1 년까지 저장 될 수 있도록</li>
		</ol>
		</li>
		<li>85% 프로필 렌 글리콜 솔루션을 준비 합니다.<ol>
			<li>DdiH2오 볶음까지 혼합의 15 mL를 100% 프로필 렌 글리콜의 85 mL를 추가 합니다. 솔루션은 실시간에서 1 년까지 저장 될 수 있다</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>치료 접시의 준비
	<ol>
		<li>섹션 3에서 설명 하는 방법을 24-잘 접시를 준비 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin 파편 치료
	<ol>
		<li>각 잘 (1 mg/mL 최종 농도)를 100 mg/mL myelin 파편의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1-3 h 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.</li>
		<li>3 번 비 소화 myelin 파편 제거 살 균 PBS 가진 접시를 씻어. 참고:이 시점에서 접시도 즉시 고정 받을 수 있습니다 또는 신선한 CMCM 추가 될 수 있다, 고 셀 반환 추가 시간 포인트에 대 한 보육.</li>
		<li>각 우물에 4 %paraformaldehyde 400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어</li>
		<li>세척 접시 2 번 살 균 PBS 다음 얼룩을 진행할.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>오로 얼룩이 지 고 분석
	<ol>
		<li>워시 ddiH2오 3 번 플레이트를 고정</li>
		<li>각 잘을 100% 프로필 렌 글리콜의 400 µ L을 추가 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어 
		참고:이 ddiH2o.의 carryover 줄어</li>
		<li>프로필 렌 글리콜을 발음 하 고 각 잘 하 오로 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>60 ° c.에 8 분 동안 품 어</li>
		<li>오로 솔루션 발음 다음, 각 잘을 85% 프로필 렌 글리콜의 400 µ L을 추가 하 고 실시간에 5 minumintes에 대 한 품 어</li>
		<li>세척 접시 3 번 ddiH2o.</li>
		<li>각 우물에 Hoechst 33258 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다. RT, 빛에서 보호에서 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.</li>
		<li>각 우물에 Tris 버퍼와의 불 화-젤 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>거꾸로 피 형광 수 있는 현미경을 사용 하 여 이미지 셀. 오로 표준 텍사스 레드 또는 DsRed 필터 세트를 사용 하 여 몇 군데 있습니다.</li>
		<li>각 이미지 필드에 오로 긍정적인 영역을 결정 하 고 핵의 수로 분할 하 여 상대 지질 보존을 계량.</li>
		<li>4 ° C에서 7 일에 대 한 번호판 빛 으로부터 보호 유지.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li>
<li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li>
<li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+the+importance+of+being+eaten%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+spinal+cord+injury%3A+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li>
<li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve%3A+an+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li>
<li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+activates+FAK%2FAkt%2FNF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380(2010).</li>
<li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li>
<li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition%3A+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain%3A+method+of+myelin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li>
<li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li>
<li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li>
<li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow-derived+Macrophage+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48(2016).</li>
<li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).</li>
<li>Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
</ol>

저자 아무 공개 있다.

여기에 설명 된 절차 활용 갓 고립 된 원유 CNS myelin 파편과 기본 골 수 유래 세포. 동물 비용을 줄이기 위해,이 좋습니다 모두 두뇌 및 희생의 때에 각 마우스에서 골 수 세포 수확. 두 연구원 협력 동시에 두 재료를 준비할 수 있습니다. 또는, 두뇌 myelin 파편 격리 전에 항생제로 보충 하는 PBS에-80 ° C에 저장할 수 있습니다. 그것은 우리의 경험을 머리 최대 1 개월 myelin 파편 생성 잠재력의 손실 없이 감지할 수 이러한 조건에서 유지 될 수 있었습니다.
CFSE는 형광 강도 및 사용의 용이성 때문에 myelin 파편을 분류 하는 데 사용 됩니다. 휴대 전화 esterases 분자14에 아세테이트 그룹을 쪼개까지 염료 침묵과 남아 있습니다. 해제 된 succinimidyl 에스테 르 그룹 다음 세포질 단백질14공유 첨부 파일에 결과 기본 amides로 반응 수 있...

골 수 유래 세포 (BMDMs) 타고 난 및 적응형 면역 시스템 사이의 중요 한 링크입니다. 항 원 제시 세포 (Apc), 그들은 모두 항 원 프레 젠 테이 션을 통해 세포와 통신할 수 있습니다 고 cytokine 릴리스1,2,3. 그러나, 직업적인 식 세포로 그들의 주요 기능은 병원 균, 나이 든된 세포 및 세포질 파편1,4입니다. 척수 상해 (SCI), 다음 myelin 파편의 대량은 CNS 축 삭 myelination5에 대 한 책임 셀 형식은 죽어가는 oligodendrocytes에서 생성 됩니다. 우리와 다른 myelin 파편의 침투 BMDMs5,,67의 주로 책임은 나타났습니다. 그러나, 척수 상해 내 사이트 engulfment myelin 파편의 프로-염증 성 상태5,,89로이 일반적으로 염증 세포 변화 제안 되었습니다. 부상된 척수에서 신경 염증의 주요 중재자, BMDMs로 중요 한 임상 대상입니다.
척수 부상된에서 BMDMs의 영향을 조사 하기 위해, 우리는 생체 외에서 모델을 직접 BMDMs myelin 파편에 대처 하는 방법을 연구를 개발 했습니다. 생물 학적 관련성을 높이기 위해 기본 murine BMDMs와 갓 고립 된 myelin 파편이이 조사에 사용 됩니다. 따라서, 여기에 제시 하는 방법 또한 자세히 분리와 기본 murine BMDMs의 문화 그리고 murine CNS를 격리 하는 데 사용 하는 수정 된 자당 그라데이션 기법 파생 myelin 파편10,,1112. Myelin 파편 형광 염료, 트랙 BMDMs CFSE에 의해 그것의 국제화는이 응용 프로그램에 적합 잘-세포 독성 때문에 및 그것의 좁은 형광 스펙트럼 허가 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE), 쉽게 표시 될 수 있습니다. 13,14프로브 다른 형광과 멀티플렉싱 합니다. 먹어서, 다음 myelin 파편 지질은 리소좀을 통해 수송 하 고 세포내 지질 방울5에 중립 지질으로 패키지. 이 세포내 지질 축적을 계량 하는 기름 빨간 O (오로) 양적 이미지 분석을 위해 최적화 하는 방법 얼룩 선물이. 이 간단한 얼룩 방법은 강력한 재현할 결과 및 정량화15를 생성합니다. 이러한 메서드는 제한 된 특수 장비로 myelin 파편 식 균 작용 및 지질 보존의 연구를 촉진 한다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>L-글루타민, 피루브산 나트륨이 함유된 고포도당</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X 용액</td></tr><tr><td>New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>United States Origin</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, strain L의 유도체]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 컨디셔닝 배지 준비</td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td>의 세포주 <td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>폴리스티린, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE 세포 증식 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO 화해를 위한</td></tr><tr><td>Fluoro-gel with Tris Buffer&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>시그마 알드리치</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, 폴리프로필렌, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti 초원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti 로터, 스윙 버킷, 티타늄</td></tr><tr><td>휴대용 로터리 균질화기</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 myelin 파편 식 균 작용

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

골 수 유래 세포 (BMDMs)는 수 입자의 다양 한 비운의 직업적인 식 세포로 서 중요 한 생리 적인 역할을 봉사 하는 성숙한 백혈구. 일반적으로, 중앙 신경 시스템 (CNS)에서 BMDMs 제한 됩니다 하지만 부상, 다음 그들은 쉽게 침투 수 있습니다. 일단 부상된 CNS 조직 내의 BMDMs 부상 파생 세포 부스러기, 지질 풍부한 myelin 파편의 다량을 포함 하 여의 허가 대 한 책임 1 차 셀 유형입니다. BMDM 침투 및 myelin 파편 식 균 작용 CNS 내의 neuropathological 파급 효과 복잡 하 고 잘 이해 있습니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 연구에 대 한 직접적인 생체 외에서 BMDMs의 CNS 상해의 컨텍스트에서 허용. 우리는 murine BMDM 절연 및 문화, myelin 파편 준비 및 분석 실험 BMDM myelin 파편 식 균 작용을 평가 하기 위해 커버. 이 기술은 중요 한 전문된 장비 또는 자료에 대 한 필요 없이 강력한 같지는 결과 아직 연구자의 요구에 맞게 쉽게 사용자 지정할 수 있습니다.

CFSE myelin 파편 분류와 BMDMs의 치료 분명 국제화 (그림 2) 항복 한다. 3-시간 상호 작용 시간 강력한 다운스트림 검출을 위한 충분 한 추가 myelin 파편 phagocytose에 BMDMs에 대 한 충분 한 동안, 상호 작용의 1 시간 만큼 적게와 세포내 축적을 관찰할 수 있습니다. 그러나, 일부 myelin 파편 여전히 존재할 수 있습니다 세포 표면에 세척 후. 이 부족 한 세척 또는 입자 안 먹어서의 초기 단계 동안 내 면 완벽 하 게 되 고 있을 수 있습니다.
BMDMs 빠르게 myelin 파편을 internalize 수 있다, 하는 동안 lysosomal 처리 오로 stainable 지질 작은 물방울 형태로 하기 전에 필요 합니다. 설명 하기 위해, BMDMs myelin 파편으로 90 분 동안 incubated, 세척, 되었고 이전에 고정 하 고 (그림 3</...

선물이 phagocytic 용량의 기본 murine 골 수 유래 세포 붙일 레이블된 myelin 파편과 세포내 지질 작은 물방울 얼룩을 사용 하 여 평가 하는 방법.

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 뇌 유래 미엘린 파편의 골수 유래 대식세포 식세포작용을 평가하는 것입니다. 이 프로토콜은 신경 외상 분야의 주요 질문에 답하기 위해 고안되었습니다. 이 방법의 장점은 in vitro 대식세포 반응, 특히 미엘린 파편에 대한 골수 유래 대식세포의 식세포 능력을 효율적이고 상대적으로 비용 효율적으로 분석할 수 있다는 것입니다.이 방법은 외부 변조기의 영향을 조사하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 마우스를 70 % 에탄올로 포화시킨 후 복부 피부에 구멍을 뚫습니다. 피부를 뒤로 당겨 다리를 드러내고 해부합니다.이 과정에서 복막강에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. 노출되면 발목과 엉덩이를 잘라 다리를 제거합니다. 항생제가 보충된 얼음처럼 차가운 PBS에 다리를 놓습니다.다른 쪽 다리에 대해서도 반복합니다. 항생제를 첨가한 얼음처럼 차가운 신선한 PBS로 조직을 세척하여 해부 중에 조직에 부착되었을 수 있는 미립자를 제거합니다. 근육을 따라 부드럽게 긁어내는 동작으로 원치 않는 조직의 대부분을 제거할 수 있습니다.메스와 핀셋으로 근육과 결합 조직에서 경골을 풀어줍니다. 풀리면 양쪽 끝을 제거하여 골수 구멍을 노출시킵니다. 대퇴골에 대해 이 과정을 반복합니다.완전한 골수 유래 대식세포 배지로 채워진 20mm 주사기에 25게이지 바늘을 부착합니다. 그런 다음 골수강을 세척합니다. 뼈가 충분히 씻겨지면 하얗게 나타납니다.수집된 골수 흡입액을 18게이지 바늘로 30-90초 동안 교반하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 다음으로 멸균된 70마이크로미터 공극 크기의 세포 여과기에 현탁액을 통과시킵니다. 세포 현탁액을 145cm 세포 배양 접시에 고르게 나눕니다.각 마우스는 총 세 가지 요리를 제공하기에 충분합니다. 7일간의 배양 후 이러한 요리는 일반적으로 성숙한 대식세포와 70-80% 정도 합류합니다. 뇌에서 미정제 미엘린 파편을 분리하기 위해 일련의 자당 구배 초원심분리 단계가 수행됩니다.우선, 생후 8주에서 10주 사이의 쥐에서 10-12개의 뇌를 해부합니다. 그런 다음 뇌는 0.32 몰 자당 용액에서 균질화 된 다음 0.383 몰 자당 용액 쿠션 위에 층을 이루어 불연속 구배를 만듭니다. 원심분리 후, 조잡한 미엘린 파편은 층 사이의 계면에서 발견됩니다.이를 수집하여 Tris 완충 용액에 분배하고 다시 원심분리하여 미엘린 파편을 펠릿화합니다. 펠릿은 Tris 완충 용액에 다시 현탁되고 추가 cenetrifugation을 위해 두 개의 튜브 사이로 분할됩니다. 먼저 뇌 전체를 제거하고 얼음처럼 차가운 0.32몰 자당 용액이 담긴 접시에 넣는다.멸균 수술용 가위를 사용하여 수집된 뇌를 약 5mm 크기의 조각으로 자릅니다. 이 단계는 후속 균질화 프로세스를 지원합니다. 조직을 50ml 튜브에 모읍니다.회전하는 균질화기를 사용하여, 매끄러운 슬러리로 조직을 균질화하십시오. 눈에 보이는 모든 큰 뇌 고형물이 완전히 균질화되었는지 확인하십시오. 20 밀리리터의 0.83 몰 자당 용액을 포함하는 초원심 분리 튜브에 생성 및 균질화하여 분리를 유지하도록주의하십시오.0.32 몰 자당 용액을 사용하여 각 튜브의 균형을 조심스럽게 맞춥니다. 완료되면 튜브를 적절한 원심 분리기 로터로 옮기고 100, 000 배 중력, 섭씨 4도에서 45 분 동안 회전합니다. 가속 및 감속이 최소값으로 설정되어 있는지 확인합니다.원심분리가 완료되면 수초 파편이 자당 밀도 계면 사이에서 볼 수 있습니다. 미엘린 파편을 부드럽게 모으십시오. 수집이 완료되면 미엘린 파편에 Tris 완충액을 추가합니다.회전식 균질화기로 다시 균질화합니다. 6개의 깨끗한 초원심분리기 튜브 사이에 균질액을 나누고 필요에 따라 추가 Tris 버퍼로 튜브의 균형을 맞춥니다. 수집된 미엘린 파편을 100, 000배 중력, 섭씨 4도에서 가속 및 감속을 최대값으로 설정하여 45분 동안 다시 원심분리합니다.원심분리 후, 미엘린은 펠릿화되었을 것입니다. Tris 버퍼를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 재현탁액과 초원심분리기를 다시 결합합니다.원심분리 후, 단단히 포장된 펠릿이 형성됩니다. supernate를 디캔팅하십시오. 펠릿을 멸균 PBS에 재현탁합니다.재부유한 미엘린 파편을 미리 계량된 미세 원심분리 튜브로 균등하게 나눕니다. 22에 10 분 동안 분리기 후에, 000 시간 중력은, PBS supernate를 제거한다. 펠릿의 무게를 잰 후 PBS를 사용하여 밀리리터당 100mg의 농도로 재현탁합니다.그 결과 생성된 조잡한 미엘린 파편은 이제 식세포작용 연구에 적합합니다. CFSE 라벨링 미엘린 파편은 초기 내재화 및 세포 내 이동을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 표지되지 않은 미엘린 파편은 Oil Red-O 지질 염색과 호환되어 내재화된 지질의 저장 및 대사를 평가합니다.섭씨 영하 80도에서 보관된 미엘린 파편을 사용하는 경우 먼저 29게이지 바늘로 다시 매달아 놓는 것이 좋습니다. 10mg의 펠릿화된 미엘린 파편을 200마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 그런 다음 2마이크로리터의 5밀리몰 CFSE 용액을 추가합니다.혼합할 피펫. 30분 배양 후 빛과 후속 세척으로부터 보호되고 PBS로 미엘린 잔해를 밀리리터당 100mg으로 다시 현탁시킵니다. 4% 파라포름알데히드로 배양 및 고정 후 각 웰에 100% 프로필렌 글리콜을 첨가합니다.실온에서 5분간 배양한 후 각 웰에 Oil Red-O 염색액을 첨가합니다. 섭씨 60도에서 8분 동안 부드럽게 저어 배양합니다. 플레이트를 부드럽게 기울여 Oil Red-O 얼룩을 완전히 흡인할 수 있도록 합니다.각 웰에 85%프로필렌 글리콜을 첨가합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 후 PBS로 웰을 세척하고 선택한 핵 염료로 세포를 염색합니다. 배양 중 골수 세포의 대표적인 광학 현미경 이미지.초기 파종 후 24시간이 지나면 부착 세포가 거의 존재하지 않습니다. 그러나 대식세포 집락자극인자(colony-stimulating factor)인 M-CSF가 존재하면 백혈구 전구세포가 분화를 시작합니다. M-CSF가 있는 상태에서 7일 동안 배양한 후, 전구세포는 식세포작용(phagocytosis)이 가능한 성숙한 골수 유래 대식세포로 완전히 분화됩니다.이 방법을 사용하면 8주에서 10주 된 C57 블랙 6J 마우스 한 마리에서 일반적으로 1,800만에서 2,400만 개의 골수 대식세포를 얻을 수 있습니다. 내재화를 시각화하기 위해 CFSE 표지된 미엘린 파편을 골수 유래 대식세포 배양에 추가합니다. 세포를 1밀리리터당 1밀리그램 CFSE 표지 미엘린 파편으로 세척하고 4%파라포름알데히드로 고정하기 전에 1시간 동안 처리했습니다.내부화된 미엘린 파편은 에피형광 가능 현미경에서 표준 GFP 필터 세트를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 미엘린 지질 축적이 어떻게 변하는지 보여주기 위해 대식세포를 표지되지 않은 미엘린 파편으로 90분 동안 처리한 다음 다양한 시점에서 세척 및 고정했습니다. 세척 직후에는 지질 방울이 거의 보이지 않습니다.그러나 시간이 지남에 따라 더 많은 지질 방울이 보이기 시작하여 세척 후 약 24시간 후에 최대에 도달합니다. 대식세포는 지질 저장소로의 유출을 위해 대사를 시작하여 염색 가능한 비말의 수를 줄입니다. Oil Red-O 염색을 정량화하기 위해 상피 형광 가능 현미경을 사용하여 각 시점 샘플에서 무작위로 얻은 5개의 이미지를 얻었습니다.오일 레드-오 염색 영역은 DsRed 채널에서 캡처된 이미지를 사용하여 각 웰에 대해 결정되었습니다. 세포의 총 수는 각 필드에 존재하는 핵의 수를 계산하여 결정됩니다. 이 그래프는 결과 수량화를 보여줍니다.기름 Red-O 양성 신호의 꾸준한 증가는 골수 유래 대식세포가 내재화된 미엘린 지질을 중성 지질로 전환하기 때문에 전형적입니다. 오일 Red-O 양성 신호의 감소는 대식세포가 지질을 대사하거나 유출하기 시작하는 24시간에 최고점을 따릅니다. 이 비디오를 시청했다면 1차 골수 유래 대식세포를 분리하고 배양하는 방법과 새로 분리된 뇌 유래 미엘린 파편과의 상호 작용을 연구하는 방법에 대해 잘 알게 되었을 것입니다.이러한 절차에서 가장 중요한 부분은 항상 무균 기술을 적절하게 유지하는 것입니다. 대식세포는 소량의 병원체 관련 분자에 강력하게 반응할 수 있기 때문에 결과를 편향시킬 수 있는 잠재적인 상호 작용을 최소화하는 것이 중요합니다. 이러한 기술의 가장 큰 장점은 생물학적으로 관련된 일차 세포와 신선한 미엘린 파편을 만드는 동시에 필요한 특수 장비의 양을 제거한다는 것입니다.또한 일부 사용자 최적화를 통해 이러한 방법을 쉽게 조정하여 미엘린 파편에 대한 골수 유래 대식세포의 반응과 관련된 다양한 질문을 해결할 수 있습니다. 형광으로 표지된 미엘린 파편과 수초화 대식세포의 Oil Red-O 염색을 모두 사용함으로써 다양한 신경 외상을 앓고 있는 환자를 위한 잠재적인 치료 개입을 조사할 수 있습니다. 이러한 연구의 전반적인 목표는 염증 해결을 촉진하기 위해 원격 대식세포 매개 세포 파편을 제거하는 것입니다.

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

우리는 macrophage- C.를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 디지털 광 현미경을 사용하여 비 - 용해성 세포 외 유출의 프로세스에 특정 중점을 실시간으로 상호 작용. 개별적 감염된 대 식세포를이 방법을 사용하는 것은 이러한 현상의 다양한 양태를 확인하기 위해 조사 될 수있다.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화 크립토 콕 쿠스 네오 포르 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

본 프로토콜은 미세아교세포의 미세세포세포 파편에 대한 반복적인 자기 자극의 효과를 평가하기 위해 고안되었습니다. 이를 위해 체외 미세아교세포와 미엘린 파편 공동 배양 시스템이 구축되었습니다.

반복되는 자기 자극 하에서 체외 에서 Myelin 파편의 미세아교세포 형성 평가

학습하세요 생체 외에서 골수 유래 대식세포의 미엘린 파편 식균 작용을 평가하는 방법을. 형광 표지 기술과 지방 방울 염색을 활용하여 신경 외상 연구에 활용할 수 있는 효율적인 프로토콜입니다.

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

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