Name: 유체역학 신장 골반 주입은 신장에서 단백질의 비 바이러스 성 표현에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 성인 마우스 신장에서 플라스미드 DNA를 이용한 비바이러스성 단백질 표현 기법을. 수력학적 신장 골반 주입법으로 신장 특이적 유전자 발현을 재현성 있게 달성하여 신장학 연구에 활용할 수 있습니다.

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경력 개발 수상에서의 재향 군인 담당 부서 [BX002797] L.E.W. 및 건강의 국가 학회 [R01-DK095867] 및 미국 심 혼 협회 [15GRNT25700209] 제 지원 건강의 국가 학회 [DK093660], 재향 군인 담당 부서 [BX002190], 및 신장 질환에 대 한 밴 더 빌 트 센터 지원 M.H.W. 이 물자 자원 및 버지니아 테네시 밸리 의료 시스템 시설의 사용 지원 작업의 결과 이다.

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+the+Intracellular+Fate+of+Plasmid+DNA+and+Transgene+Expression%3A+ZsGreen1+and+Tissue+Clearing+Method+CUBIC+Are+an+Optimal+Combination+for+Multicolor+Deep+Imaging+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues.</a> PLoS One. 11 (1), e0148233(2016).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).</li>
<li>Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2C+lobe-specific+hydrodynamic+gene+delivery+to+swine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver.</a> Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).</li>
<li>Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2Cintravascular+hydrodynamic+gene+delivery+to+skeletal+muscle+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs.</a> Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).</li>
<li>Alino, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+DNA+delivery+to+whole+pig+cardiac+tissue+by+coronary+sinus+retrograde+injection+employing+non-invasive+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization.</a> J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Woodard, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney-specific+transposon-mediated+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo.</a> Sci Rep. 7, 44904(2017).</li>
<li>Liang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutathione+S-transferase+A4+accelerates+obstruction-induced+tubule+damage+and+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis.</a> Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+insulin-like+growth+factor-1+receptor+in+endothelial+cells+against+unilateral+ureteral+obstruction-induced+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).</li>
<li>Corridon, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+facilitate+and+monitor+expression+of+exogenous+genes+in+the+rat+kidney+using+plasmid+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).</li>
<li>Wallace, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kidney+volume+in+mice+with+polycystic+kidney+disease+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging.</a> Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).</li>
<li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li>
<li>Yeikilis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+based+transfection+in+normal+and+fibrotic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats.</a> World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li>
<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 관심 없음 충돌 선언 하는 것도 있다.

이 프로토콜에서 신장에 특히 재현 유전자 발현을 달성 하기 위한 강력한 메서드를 설명 합니다. 적당히 경험 있는 외과 의사의 손에 우리 쥐 마우스 나이 따라 50-100%의 범위와는 transgene의 판독의 감도에이 기술에 의해 페의 비율을 발견 했다. Luciferase 유전자 발현의 수준 배경 위에서 마우스 piggyBac transposons 수신에 몇 달 동안 되었고 완전히 immunocompromised 쥐 같은 transposons11수신에 몇 주 동안 유지. 많은 셀 transgene 사출 사이트 근처 지역에 대 한 밝은 스테인드, 동안 전체 transfection 효율은 상대적으로 낮은 (그림 3D). 원하는 결과 달성 하기 위해 가장 중요 한 물자는 주입 주사기 자체 이다. 이 연결 된 바늘과 주입을 방해 없이 안전 29G x ½"인슐린 주사기 이어야 합니다. 주사 3 s 내에서 빨리 해야 합니다. ...

유체역학 꼬리 정 맥 주입 기술은 마우스 간1,2유전자 발현의 높은 수준을 달성 하기 위해 일반적으로 사용 되는 되고있다. 신장은 또한 훨씬 더 낮은 수준, 약 100 적은3에서이 기술에 의해 페. 여기에 설명 된 유체역학 신장 골반 사출 간4,5 이전 설립 되었습니다 동일한 유체역학 원리를 사용 하 여 물리적 수단을 통해 장기 식의 특이성을 제어 하는 간단한 방법 제공 ,6, 근육 및 다른 기관7,8. 이 메서드는 압력을 사용 하 여 셀 vivo에서 동물에 transfects와 동시에 신속 하 게 기관에 손상을 유발 셀에 액체 포함 DNA를 강제로 속도 해결9. 인슐린 주사기에 의해 단일 주사 함께 측면 절 개10 통해 신장 시각화 확고 외과 기술을 사용 하 여, 우리는 다양 한 종류의 신장 세포, 주로 간 질 성 섬유 아 세포의 성공적인 transfection 발견 tubules, 그리고 모으는 덕트11. 이러한 쥐의 해 부 다른 장기 luciferase 이미징 기법11여 시각화 충분히 높은 수준에서 페 하지는 보이고 있다. 기술은 아닌 바이러스 이기 때문에, transfection에 대 한 플라스 미드 DNA의 사용 사출에 필요한 시 약의 빠르고 쉬운 준비를 허용 합니다.
우리 항 산화 glutathione S-전이 효소 A4, 인슐린 같은 성장 인자 1 수용 체 모두 예상된 생물학적 효과11, 와 함께 신장에서 호르몬 리스로 표현 하는 지역화 된 유체역학 주사를 사용 12 , 13. 경로 관리, 주입 량, DNA 복용량, 및 발기인 선택의 상세한 평가 수행된11되었습니다. 또한, 두 piggyBac transposon 시스템 또는 cyclophosphamide 치료는 transgene 면역 반응 억제를 장기 진 식 결과11을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. 다른 조사 성공, 한 달14보다 큰 시간 동안 높은 transfection 효율을 달성 쥐에서 신장 정 맥 접근을 사용 했습니다. 그러나, 인간의 질병을 흉내 낸 고기의 유전 수정 일반적으로 수행 됩니다 마우스 처음 개념 증명으로 이후 가장 포유류 유전자 모델은 마우스 모델. 우리 신장 골반 주입에 신장 정 맥 주입을 비교 하 고 신장 골반에 주입 (약 10 배 더 높은) 유전자 발현 및 생존11신장 정 맥에 우수한 발견. 신장 골반 신장에 항목의 이상적인 경로 때문에 용납 소변 생산에 변동에 유연 이며 종종 hydronephrosis 동안 넓힐 경우에 그것의 구조적 무결성을 유지할 수 있습니다. 또한, 신장 골반에 주입 주입된 유체 가시 intraparenchymal 주입 보다는 더 나은 신장에 의해 유지 될 수 있도록 신장 캡슐을 관통 하지 않고 신장에 대 한 액세스를 허용 합니다. 다른 마우스 장기 맥 관 구조, 다른 항목의 경로 필요가 없습니다 하지만 신장 비뇨 기 공간 이상적인 사출 사이트입니다. 또한, 신장 정 맥에 주사는 복 부 구멍으로 혈액의 누설에 결과. 야생-타입 마우스 신장의 총 신장 볼륨 단일 신장의 볼륨은 약 신장 골반 유체에 의해 주입 액체의 양을에 약 0.2 c m3를 자기 공명 영상으로 추정 되었다 주입 (100 µ L)15. 여기, 우리는 가능 신장 재현할 transfection를 달성 하기 위해 유체역학 신장 골반 주입 프로토콜의 자세한 뉘앙스의 모든.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>마취제 - 비규제 물질</td></tr><tr><td>BD 인슐린 주사기 0.5 mL 29G 1/2 인치</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>필요한 주사기</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>약사/수의사</td><td></td><td>진통제 - 규제 물질</td></tr><tr><td>Dynarex 일회용 수건 드레이프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>열 패드 위에 놓으십시오</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>내독소가 없는 플라스미드 DNA만 사용</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>내독소 검사를 위한 양성 대조군</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial</td><td>Charles River</td><td>R13500</td><td>내독소 검사</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical 기구</td><td>RS-5882</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Fisherbrand 즉시 밀봉 살균 파우치 - 9"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>오토클레이빙 수술 도구</td></tr><tr><td>Gaymar 히트 펌프</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>물 순환 히트 펌프</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>DS-401</td><td>수술 중 수술 도구</td></tr><tr><td>재사용 Graefe 펜치</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-5136</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Graefe 조직 펜치</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-5153</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Halsey 바늘 홀더, 5" 길이</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-7841</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>히트 패드 - 15" x 21" - 최소 3개 필요</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>Gaymar 히트 펌프</td></tr><tr><td>와 함께 사용IsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>이미징 및 안락사용</td></tr><tr><td>Isotec Isoflurane 전달 시스템 Vaporizor</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>이미징 및 안락사용</td></tr><tr><td>케타민</td><td>약사/수의사</td><td></td><td>마취제 - 규제 물질</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>실험실 조직</td></tr><tr><td>살아있는 이미지 소프트웨어</td><td>캘리퍼스 생명 과학</td><td></td><td>살아있는 동물 이미징</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>살아있는 동물 이미징 Nanodrop</td></tr><tr><td>2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>분광 광도계 DNA 측정</td></tr><tr><td>Prevantics Swabs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>피부 수술 준비</td></tr><tr><td>프롤렌 5-0 봉합사 테이퍼 30"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>피부용 비흡수성 봉합</td></tr>사 <tr><td>Puralube 브랜드 안과 연고</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>수술 중 눈을 촉촉하게 유지하기 위해</td></tr><tr><td>Trans IT - QR 유체역학 전달 솔루션</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>DNA 희석을 위한 유체역학적 전달 버퍼</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 봉합사 J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>근육층용 흡수성 봉합사</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>피부 준비용 면도기</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>캘리퍼스 생명 과학</td><td></td><td>살아있는 동물 이미징용</td></tr></tbody></table>

유체역학 신장 골반 주입은 신장에서 단백질의 비 바이러스 성 표현에 대 한

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

유체역학 주입 transfect 다양 한 조직 플라스 미드 DNA와 다른 물질을 지역, 고압 환경을 만듭니다. 유체역학 꼬리 정 맥 주입, 예를 들어 간 페 될 수 있는 잘 설립 방법입니다. 이 원고는 신장 관련 유전자 발현에 대 한 플라스 미드 DNA와 직접 마우스 신장의 주입에 의해 유체역학 원리의 응용을 프로그램을 설명합니다. 쥐 취 고 신장 신장 골반에 직접 플라스 미드 DNA를 포함 하는 솔루션의 빠른 주입 다음 측면 절 개 하 여 노출 됩니다. 바늘은 10 초에 대 한 장소에 보관 하 고 절 개 사이트 봉합. 다음 날, 라이브 동물 영상, 서쪽 오 점 또는 immunohistochemistry 유전자 발현 분석 결과를 사용할 수 있습니다 또는 관심사의 단백질의 검출에 사용 되는 선택의 transgene에 적합 한 다른 분석 실험. 유전자 발현을 연장 하기 위해 게시 방법은 transgene 면역 반응을 억제 하 중재 하는 transposon transgene 통합과 cyclophosphamide 치료를 포함 합니다.

수술 및 주입 기술 하 게 수행 하기 위해 한번 마스터, 주요 장비 또는 비싼 물자를 요구 있습니다. 새로운 측면 절 개 신장 수술을 하는 경우 1 훈련 일 안락사 예정 여러 쥐에 있는 쥐 복구 된 다음 수술 때문에 하지 않습니다이 수술에서 첫 번째 시도 보다 훨씬 더 오래 걸릴 수 있습니다 허용 되어야 한다. 또는, 유사한 기술을 익힐 수 사관 간단 하 찾을 수 있습니다. 그림 1 에서 그림 그리고 그림 2에서 그림 방향에 따라 신중 하 게. 절 개를 제대로 배치 하려면 의사는 그것의 측면에 낳는 동안 마우스의 뱃속에 밀어 손가락을 사용할 수 있습니다. 신장, 부드러운 복 부 압력으로 척추 근처 상승 작은 덩어리에 의해 시각 이다 하 고 절 개 해야 한다이 지역 (그림 1 및 <strong class="xfig...

이 프로토콜에는 신장에 특히 transgene 식 생산 하 신 골반을 통해 마우스 신장에 플라스 미드 DNA를 주입 하는 방법을 설명 합니다.

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

이 수술 절차의 전반적인 목표는 성체 쥐 신장의 플라스미드 DNA에서 단백질 발현을 생성하는 것입니다. 이 방법은 관심 단백질의 발현이 성인 신장에 어떤 영향을 미치는지와 같은 신장학의 주요 질문을 해결하기 위한 새로운 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 기관에서 유전자 발현을 생산할 수 있는 다른 방법과 달리 재현 가능한 방식으로, 특히 신장에서 단백질 발현을 생성한다는 것입니다.신장 골반을 주입하려면 신중한 노출이 필요하고 혈장 DNA가 세포에 들어가기 위해 신속하게 수행해야 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 유체역학적 전달 버퍼에 플라스미드 DNA를 재현탁하는 것으로 시작합니다. 파란색 패드로 덮인 물 순환 열 패드 위에 마우스를 놓습니다.애완동물 미용을 위해 고안된 면도기를 사용하여 마우스 뒤쪽의 왼쪽을 어깨에서 엉덩이까지, 옆구리에서 척추까지 면도합니다. 느슨한 머리카락과 부스러기를 청소하고 양쪽 눈에 수의사 연고를 발라 각막 건조를 방지하십시오. 이제 10-50마이크로그램의 희석된 플라스미드 DNA가 들어 있는 100마이크로리터를 마취된 각 마우스에 대해 별도의 주사기에 넣어 기포가 없는지 확인합니다.바늘은 안전 장치 없이 영구적으로 부착되어야 합니다. 수술을 수행하기 전에 열 패드에 놓인 멸균 트레이를 건드리지 않고 멸균 수술 도구를 비우십시오. 이제 마우스를 들고 조명이 켜진 시야에 끈을 묶습니다.포장에서 3.15% 클로르헥시딘 글루코네이트와 70% 이소프로필 알코올 피부 소독 면봉을 제거하고 동물 근처에 놓습니다. 멸균 수술용 장갑을 착용하고 절개 부위부터 시작하여 새로운 클로르헥시딘 알코올 면봉으로 동물을 원을 그리며 세 번 면봉으로 닦습니다. 이제 절개 부위를 찾습니다.핀셋으로 피부를 꼬집고 가위를 사용하여 척추에서 약 1cm 떨어진 흉곽 아래의 피부층을 자릅니다. 근육층을 1cm 아래로 자릅니다. 신장을 찾아 건드리지 말고 손가락으로 복부를 꾸준히 부드럽게 눌러 복강에서 부드럽게 노출시킵니다.신장을 노출시키는 것은 때때로 어렵습니다. 비장이 손상되지 않도록 복부와 척추에 부드러운 압력을 가하십시오. 신장 이외의 장기가 나오면 필요한 경우 닫힌 겸자를 사용하여 부드럽게 체강으로 되돌립니다.그런 다음 작은 흰색 점으로 보일 수 있는 신장 골반이 보일 수 있을 만큼만 신장을 주변 지방과 부드럽게 분리합니다. 신장 골반을 시각화한 후 닫힌 집게를 사용하여 신장 골반이 보이도록 신장 오른쪽을 아래로 누릅니다. 그런 다음 장전된 인슐린 주사기를 작업 표면과 평행하게 잡고 바늘을 신장 골반에 조심스럽게 삽입합니다.바늘이 삽입되면 3초 이내에 용액을 빠르게 주입합니다. 용액의 역류를 방지하기 위해 바늘을 약 10초 동안 제자리에 두십시오. 그런 다음 바늘을 천천히 조심스럽게 제거하고 닫힌 집게를 사용하여 절개 부위를 부드럽게 펴서 장기를 복강으로 되돌립니다.이제 5-o 흡수성 봉합사로 근육층을 봉합하고 2-4개의 독립적인 매듭을 짓습니다. 마찬가지로, 5-O 또는 6-O 비흡수성 나일론 봉합사로 피부층을 봉합하고 2-4개의 독립적인 매듭을 놓습니다. transfection 효율을 평가하기 위해 다음 날 희석된 DNA에 플라스미드를 발현하는 루시페라아제 10마이크로그램을 주입하여 살아있는 동물 이미징을 수행합니다.첫 번째 생쥐 케이지를 챔버에 넣고 밀봉합니다. 마취가 끝나면 각 마우스에 100마이크로리터의 해동된 루시페린을 복강내 주입하고 시간을 기록합니다. 올바른 사용자 ID를 선택하고 상단 메뉴 표시줄에서 획득을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 자동 저장 2를 선택합니다.initialize를 클릭하여 시스템을 초기화합니다. 초기화가 완료될 때까지 기다렸다가 시야를 D로 변경하여 5개의 마우스를 이미지화합니다. 동물이 원하는 순서로 배치되고 등이 카메라를 향하여 신장을 시각화하는지 확인하십시오.그런 다음 주입 후 5분 동안 acquire를 눌러 이미지를 촬영합니다. 획득 후 이미징 기계에서 마우스를 제거합니다. 가스를 끕니다.챔버, 노즈 빗 및 이미징 스테이지를 청소합니다. 데이터를 분석하려면 ROI 도구를 클릭한 후 원 아이콘을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 하나를 선택하여 주위에 4개의 사각형이 있는 빨간색 타원으로 표시된 대로 이미지에 새 ROI를 배치합니다. ROI의 크기를 조정하려면 커서를 빨간색 사각형 위에 놓고 주입된 신장을 오버레이하는 자주색 영역을 둘러싸도록 끕니다.이제 이 ROI를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 중복 ROI를 선택하여 현재 창에서 ROI를 복제하고 다음 마우스로 이동합니다. 이미지 바로 위의 메뉴에서 모든 ROI를 배치한 후 단위를 counts에서 radiance photons로 변경합니다. 마지막으로, ROI 도구를 클릭한 다음 연필 눈금자 아이콘을 클릭하여 도구 입천장에서 ROI 데이터를 내보내 측정 스프레드시트를 만듭니다.리포터 플라스미드의 신장 특이적 유전자 발현이 표시됩니다. 모든 마우스에는 향상된 반딧불이 루시페라아제를 발현하는 pTet 플라스미드를 주입하고, 2, 3, 5번째 마우스에는 적색 형광 단백질인 tdtomato를 발현하는 pEF1-알파-tdtomato 플라스미드를 주입했습니다. 일반적으로 어린 마우스의 광도는 한 자릿수 이내입니다.일부 마우스는 낮은 transfection 효율 또는 transgene 자체의 부족으로 인해 눈에 띄는 수준의 광채를 나타내지 않을 수 있습니다. 유체역학적 완충액의 주입은 제어 역할을 합니다. 유체역학적 완충액만 주어질 경우 플라스미드 발현이 관찰되지 않습니다.transfection 후 처음 며칠 동안은 transgene에 대해 양성으로 염색되는 세포의 수가 적을 수 있습니다. 이 세포는 주입액이 침투한 부위의 패치에 국한되어 있는 것으로 보입니다. 이 이미지에서 녹색 신호는 연꽃 테트라고놀로부스 응집소(lotus tetragonolobus agglutinin)로 염색된 근위세뇨관(proximal tubules)에서 온 것이고, 빨간색 신호는 tdtomato 리포터 유전자를 발현하는 형질주입된 세포에서 나온 것입니다.일단 숙달되면 수술은 10분 이내에 완료할 수 있지만 마취를 유도하고 회복하는 데 시간이 걸립니다. 따라서 두 명의 훈련된 인력이 긴밀히 협력하여 하루에 약 10-15마리의 쥐만 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 어린 쥐를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.유체역학 기법은 오래된 섬유화 장기에서는 잘 작동하지 않습니다. 이 절차에 따라 관심 유전자의 발현을 평가하기 위해 혈액, 소변 및 신장 조직 샘플 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신장 특정 단백질 발현을 달성하기 위해 신장 골반에 플라스미드 DNA를 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: 굽타, K. 외 쥐 모델에서 신장 내 주사를 통한 신낭신염 모델에서의 대장균 주사.  J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 마취된 쥐의 신장 골반에 대 장균 을 주사하여 국소적인 신장 감염을 유도하는 과정을 시연하며, 급성 신골낭염을 모델링합니다. 재현 가능한 생체 내 감염 모델을 구축하기 위해 필요한 주요 수술 단계와 무균 기법을 강조합니다.

쥐의 신장 골반에 E . coli 를 신장 내 주사로 투여합니다

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

이 비디오에서는 핵산 transfection을 위해 마우스 신장의 신장 골반에 플라스미드를 유체역학적으로 주입하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 조직 손상을 일으키지 않고 플라스미드를 특정 부위로 강제로 구동하는 높은 정수압의 원리를 활용하여 플라스미드의 장기 특이적 전달을 가능하게 합니다.

유체역학적 신장 골반 주사: 쥐 모델의 신장 세포에 DNA를 직접 전달하는 기술

이 비디오에서는 신장 동맥을 통해 쥐의 신장 내 약물 투여를 보여줍니다. 이 방법은 약물 표적화, 약물 효능을 개선하고 전신 독성을 최소화하는 데 도움이 됩니다.

쥐의 신장 내 약물 전달: 동맥 내 주사를 통해 쥐의 신장에 치료 약물을 전달하는 방법

여기에서는 운명 지도와 계통 추적자를 사용하여 Xenopus laevis 배아의 신장을 생성하는 개별 할구에 주입하는 프로토콜을 제시합니다.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

화학 요법으로 항생제에 이르기까지 약물을 포함 nephrotoxins에서 발생하는 신장 손상은, 그 발병 기전 불완전하게 이해 남아 복잡한 질환이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라는 신장 보호 대책의 식별에 적용 할 수있는 이러한 조건의 질병 모델에 사용할 수있는 방법을 보여준다.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

신장 기능의 회복을위한 약물의 투여는 현지화 및 치료 화합물의 분포 컨트롤이 필요합니다. 여기, 우리는 구체적으로 쥐에 약물의 신장 내 전달을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 절차는 쉽고없이 사망률과 높은 재현성으로 수행 될 수있다.

쥐의 신장에 생물의 혈관 배달

이 원고는 대장균에 의한 신장 내 감염을 신장 골반으로 직접 사용하는 신우신염의 쥐 수술 모델을 설명합니다. 실험 절차는 신우신염의 발병 기전과 관련 염증 및 섬유증을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

경동맥 내 주사 대장균 신우 신염의 쥐 모델에서

이 원고는 마우스의 frarearenal 복부 대어타에 배치 된 카테터를 통해 단일 신장에 표적 전달방법을 설명합니다.

신장 동맥을 통해 신장에 직접 약물 전달

여기에서 우리는 여러 신장 질환 마우스 모델에서 비바이러스 벡터 및 폴리에틸렌이민 나노입자의 꼬리 정맥 주입을 통해 외인성 인공 합성 miRNA 모방체를 신장에 전달합니다. 이로 인해 신장에서 표적 miRNA가 크게 과발현되어 여러 마우스 모델에서 신장 질환의 진행이 억제되었습니다.

여러 신장 질환 마우스 모델에서 폴리에틸레니민 나노입자를 사용하여 신장에 외인성 인공 합성 miRNA 모방체의 전달

이 보고서는 마우스 신장으로의 효과적이고 안전한 유전자 전달을 위해 신우 를 통한 AAV 벡터의 국소 주입 방법을 자세히 설명합니다.

아데노 관련 바이러스 벡터의 느린 역행 신골 주사 를 통한 마우스 신장에 효과적이고 안전한 유전자 전달

배우세요 성인 마우스 신장에서 플라스미드 DNA를 이용한 비바이러스성 단백질 표현 기법을. 수력학적 신장 골반 주입법으로 신장 특이적 유전자 발현을 재현성 있게 달성하여 신장학 연구에 활용할 수 있습니다.

유체역학 신장 골반 주입은 신장에서 단백질의 비 바이러스 성 표현에 대 한

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