Name: 고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 학습하세요 고밀도 지단백(HDL)의 지질 과산화를 측정하는 세포-무료 형광 효소 분석법을 통해 심혈관 및 대사 질환 연구에서 HDL 기능을 신뢰성 있게 평가하는 방법을.

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저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 박사 모하마드 Navab, 앨런 Fogelman와 스리 니 바사 레디의 작품을 인정합니다. T.A.A.는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. AJ와 아 NHMRC 프로젝트 그랜트 1108792에 의해 지원 됩니다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # µL1TR000124.

캘리포니아 로스 앤젤레스, 로스 앤젤레스와 알프레드 병원 인간의 윤리 위원회, 멜버른의 대학에서 윤리 승인 인간의 생물 학적 샘플을 사용 하 여 모든 실험 수행.
 참고: 형광 색소 HDL 기능 분석 결과 (참조 토론) 32의 많은 변이가 있다. 아래 우리는 가장 일관 되 고 재현 가능한 결과 제공 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과 대 한 개요는 그림 2에 표시 됩니다.
 1. 표본 처리 <ol><li>사용 신선한, hemolyzed 비 혈 (혈 청 분리기 관에 수집 될 수 있습니다) 또는 시트르산 플라즈마 12-14 시간 금식 후 얻은. Cryopreserved 샘플을 사용 하는 경우이 프로토콜에서 설명 된 대로 적절 한 컨트롤 포함.</li>
</ol> 2. 하루 0-분석 결과 대 한 준비 적절 한 컨트롤과 실험의 <ol><li>준비 작업 레이아웃 샘플 및 복제. 적어도 triplicates에 각 샘플을 실행 합니다. 대표 96 잘 레이아웃 그림 3에 표시 됩니다.</li>
	<li>계산 샘플 및 복제의 수에 따라 분석 결과 대 한 사용 될 시 약의 모든 볼륨. 
	참고: 각 작업 재고 특정 실험에 대 한 각 시 약에 대 한 충분 한 볼륨 있는지 확인 하는 추가 10% 볼륨 포함.</li>
	<li>예: HDL, HDL-콜레스테롤 (선택 사항)의 측정은 fluorochromeassay의 분리에 대 한 분석 결과의 모든 다른 단계에 대 한 모든 필요한 튜브 라벨.</li>
</ol> 3. 컨트롤의 하루 1-준비 <ol><li>모든 연구의 연구 관련 풀링된 제어의 준비 <ol><li>만들기 풀링된 플라스마 또는 혈 청에서 컨트롤 샘플 샘플. 3 중에 각 접시에 20 샘플을 실행 하는 경우 200 µ L 풀링된 컨트롤에 각 샘플에서 10 µ L를 결합. 이 컨트롤의 HDL-콜레스테롤 값을 결정 하기 위해 임상 실험실에 게이 풀된 컨트롤의 별도 약 수. 
		참고:이 풀링된 컨트롤을 사용 하 여 분석 결과 표준화 하 여 가능한 모든 알려진 계정 (예: 플라즈마, freeze-thaw 주기, cryopreservation 매트릭스 세럼의 유형) 및 실험적인 다양성에 영향을 미칠 수 있습니다 알 수 없는 confounders 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>실험실 관련 품질 관리 (QCs)의 준비 <ol><li>각 실험실 (예: 10 건강 한 기증자 로부터 플라즈마의 5 mL에서 고립 된 HDL)에 HDL의 큰 재고를 준비 하 고이의 여러 aliquots cryopreserve freeze-thaw 주기를 최소화 하기 위해 주식.</li>
		<li>사용 적어도 10 다른 HDLox의 평균 값을 확인 하려면이 주식에서 복제 합니다. 측정 된 HDLox의 허용 범위 내에서 각 분석 결과에 포함 된 각 QC 샘플은 값 &lt;이 평균 값의 변동 계수의 15%.</li>
		<li>가이 컨트롤 (예: 40 mg/dL) HDL-콜레스테롤 값을 결정 하기 위해 임상 연구소에 게이 풀된 컨트롤의 별도 약 수. 
		참고: 자세한 방법은 이러한 컨트롤을 만들 혈액 은행에서 혈액을 사용 하는 방법을 이전 되었습니다 설명된 27 , , 28 32. 필요에 따라 추가 QCs 사용 (예: 정상적인 HDL 기능과 크게 비정상적인 HDL 함수 알려진 기증자에서 하는 건강 한 기증자에 게 서 한.</li>
	</ol></li> <li>최적화 배경 신호 및 빈 값 (옵션) <ol><li>백그라운드를 최소화 하기 위해 형성된 된 H 2 O를 빠르게 제거 하 인큐베이션 매체에 catalase (1-4 U/mL)의 적절 한 금액을 추가 2 버퍼의 자발적인 공기 산화 때문. 
		참고: 이후 빈 우물 (HDL)에서 값 HDL 샘플의 값에서 뺀 되 고 결과 풀링된 컨트롤 (같은 96 잘 접시에 포함)를 기준으로 보고 우리가 찾은이 단계는 실제적으로 하지 affec t는 결과. 따라서, catalase로 배경 신호 최적화 생략할 수 있습니다, 필요한 경우.</li>
	</ol></li></ol> 4. 하루 1-HDL 콜레스테롤 HDL 강 수를 사용 하 여 분리 참고: 상업적으로 사용 가능한 표준화 된 HDL 콜레스테롤 계기 시 제조 업체에 따라 고갈 apoB 혈 청을 사용 하 여 ' s 지침입니다. 이 시 약 HDL 콜레스테롤 수치를 결정 하기 위해 색도계 분석 실험에서 널리 이용 된다.
<ol><li>신선한 사용 (해 동) 플라스마 또는 혈 청 샘플.</li>
	<li>같은 볼륨 (예: 80 µ L) 플라스마와 HDL 콜레스테롤 계기 시 약 (20 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 글리신 버퍼 pH 10.0 (25 ° C))의 혼합.</li>
	<li>아래로 pipetting으로 잘 믹스.</li>
	<li>원심에서 1000-2000 x 10 분에 대 한 g</li>
	<li>상쾌한 (HDL 분수) 발음.</li>
	<li>는 이상적으로 사용 하 여 즉시 격리 HDL HDL 지질 과산화의 fluorochromeassay에 대 한. 그러나, 여러 샘플은 같은 날에 실행 하는 경우 HDL-콜레스테롤 농도의 측정은 또한 완료와 같은 다른 단계 4 ° C에서 고립 된 HDL 저장 그리고 fluorochromeHDL 기능 분석 결과 대 한 다음 날 사용.</li>
</ol> 5. 격리 된 HDL에 HDL-콜레스테롤의 날 1-결정 참고: 이것은 임상 실험에서 HDL-콜레스테롤의 값은 HDLox을 정상화 하 HDL-콜레스테롤 양을 사용 하는 경우.
<li>계량 HDL-콜레스테롤 플라즈마에서 <ol>, 27 분석 실험 표준 색도계를 사용 하 여. 각 잘에서 콜레스테롤 약의 50 µ L을 추가 하 고 콜레스테롤 농도 색도계 플레이트 리더와 콜레스테롤 표준 각 키트에 제공 된 사용 하 여 결정.</ol></li>
 6. 하루 2-시 약의 준비 <ol><li>HRP 5 U/mL 해결책 (범위 1-10 U/mL)의 준비 HRP와 콜레스테롤 솔루션.</li>
	<li>준비 20 m m 형광 색소 (예: Amplex 레드) 솔루션: 실내 온도에 형광 색소 시 약 및 DMSO의 유리병을 녹여. 사용 전에 분해 DMSO의 200 µ L에 형광 색소 시 약 (1 mg). 재고 솔루션에 냉동 저장 ≤-20 ° C, 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>긍정적이 고 부정적인 컨트롤 준비: 사용 1 X ' 반응 버퍼 ' 콜레스테롤 및 20 m m H 2 O 2 없이 작업 솔루션 부정적이 고 긍정적인 컨트롤로 각각.</li>
</ol> 7. 하루 2-형광 색소 분석 결과 <ol><li>빈 (부정적인 제어)으로 반응 버퍼 x 1의 추가 50 µ L.</li>
	<li>옵션: 각 접시에 긍정적인 컨트롤로 20 m m H 2 O 2의 작업 솔루션 추가.</li>
	<li>실험적인 변화를 최소화 하는 추가 시 약 및 샘플의 지속적으로 행해진다 고 적절 한 시기에는 별도 96 잘 라운드-하단, 분명, 폴리스 티 렌 또는 폴 리 프로필 렌 플레이트 (접시 1) 샘플의 모든 추가 수행 합니다. 다음 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 특정 볼륨 3 96 잘 접시에 전송 (2-4 격판덮개: 폴 리 프로필 렌, 봇톰, 블랙) (있는 동일한 레이아웃) ( 그림 2, 그림 3).
	<ol><li>예를 들어 처음에 격판덮개 1의 각 잘/샘플으로 고립 된 HDL의 160 µ L를 추가 하 고 멀티 채널 피 펫의 사용과 HDL-콜레스테롤의 50 µ L에서에서 전송할 각 잘/샘플 검은 96 잘 접시. 팁 각 행/열 사이 변경 하 고 필터링 되지 않은 팁을 사용 하 여 모든 전송.</li>
	</ol></li> <li>우물에서 샘플을 두고. 버리지 마십시오. 시 약의 추가 사이 아무 세척 단계에 있다.</li>
	<li>HRP 솔루션 5의 추가 50 µ L U/mL (0.25 U) 각 잘. 
	참고: 사용 하 여 형광 색소 시 약의 추가 하기 전에 HRP.</li>
	<li>37 ° c.에 30 분 동안 품 어 인큐베이션 (시 약의 추가 사이 세척 단계) 후에 샘플을 버리지 마십시오.</li>
	<li>추가 50 µ L 300의 최종 농도 대 한 fluorochromereagent의 µ M. 이 시점에서, 총 반응 볼륨은 150 µ L. 잘 섞어 그리고 빛에서 보호.</li>
	<li>평가 (어둠)에 형광 판독 형광 플레이트 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 이상 모든 분. 
	참고: 짧은 60 분 간격을 사용 하 여 신선한 샘플. 우리는 120 분 분석 결과 cryopreserved 샘플의 사용으로 더 많은 재현할 수 데이터를 제공 것으로 나타났습니다.</li>
	<li>적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 기록.</li>
</ol> 8. 하루 3-데이터 분석 <ol><li>빈 우물을 포함 하 여 모든 샘플에 대 한 형광 색소 시 약의 추가 후 120 분에 형광 단위 (임의의 단위)을 기록 하 고 모든 컨트롤.</li>
	<li>형광 단위의 평균 값을 계산 (에 따라 적어도 triplicates) (HDL ox_sample). 이상 값에는 영향을 받지 않습니다 (&gt; 2 평균 값에서 SDs) 고려.</li>
	<li>다음과 같은 방정식을 사용 하 여 배경 형광 빼기: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg"></li> <li>정규화 동안 HDL 콜레스테롤 (HDL-콜레스테롤): HDL-콜레스테롤에 의해 (를 포함 하 여 풀링된 제어) 각 샘플에 대 한 HDLox 지질 과산화 값 정상화) (mg/dl). 결과 섹션에 걸쳐 HDL 황소 n HDL-c.에 대 한 조정을 반영 (HDL-콜레스테롤) HDLox 측정으로 제시 다음과 같은 방정식을 사용 하 여: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg"></li> <li>풀링된 컨트롤의 값에 대 한 각 샘플의 HDLox 지질 과산화 값 표현의 표준화. N (HDL-콜레스테롤) HDLox 지질 과산화 풀링된 컨트롤의 값에 의해 n (HDL-콜레스테롤) HDLox 지질 과산화 (HDL-콜레스테롤에 대 한 조정) 각 샘플에 대 한 값을 정상화. 결과 섹션에 걸쳐 HDL 황소 실험적인 다양성와 HDL-C에 대 한 조정을 반영 하기 위해 nHDL 황소 측정으로 제시 다음과 같은 방정식을 사용 하 여: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg"> 참고:이 방법은 같은 측정의 실험적인 다양성을 줄이기 위해 다른 설립된 실험적인 접근 비슷합니다 국제 정상화 비율 (INR) 44 , 45. 이 방법은 임상 연구 32 , 33 , , 34 35 , 36에서 검증 되었습니다. , 37 , 38 , 39.</li> <li>표준 품질 관리 샘플을 사용 하 여 실험 결과의 품질 관리를 수행. 각 연구소는 그들의 자신의 품질 컨트롤 (QCs)를 설정 해야 합니다. 이상적으로 있다 알려진된 역 기능 HDL과 샘플에서 nHDLox에 대 한 품질 관리와 건강 한 기증자 [예: 사용 풀링된에서 샘플을 설립된 혈액 은행 기증자 알려진된 comorbidity 없고 위험 요소에 대 한 젊은 성인에서에서 샘플에서 nHDLox에 대 한 품질 관리 심장 혈관 질병 흡연 포함]입니다. 후자의 제어 다른 실험실 간의 결과 표준화합니다. 이러한 QCs의 평균 값 (일반적으로 우리가 사용 10 복제가 중요 한 단계에 대 한) 설립된에 따라 적어도 5 복제 됩니다.
	<ol><li>확인 값의 예상된 범위 내 값 여부 측정된 QCs 각 분석 결과에 있다. 15%의 허용 최대 실험적인 변화를 가정, 모든 측정된 실험 값 한다 설립된 QC의 알려진된 평균 값의 15%가. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg"> 참고: 포함 된 품질 관리 중 (샘플링 하는 경우 역 기능 HDL 대 정상) HDLox 값 예상된 범위 (각 연구실에 설립) 밖에 제공 다음 반복 실험.</li>
	</ol></li> <li>실험적인 변화를 계량 편차 (CV)의 계수를 사용 하 여 실험 결과의 품질 관리를 수행: CV %와 함께 모든 샘플 반복 &gt; 15%. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg"> 참고: (이내 같은 접시) 일반적인 내부 분석 결과 (다른 접시) 가운데 간 분석 결과 실험 다양성은 &lt; 15%. 2)는 일반적인 내부 분석 결과 이력서는 1-7% ~ 이력서 3-10% 사이 전형적인 interassay.</li>
</ol>

이 프로토콜 및 분석 결과 특허 PCT/US2015/018147와 관련이 있습니다.

여기에 설명 된 프로토콜 동맥 경화 및 인간 질병에 HDL 함수의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 분석 결과 효소 증폭 (HRP)를 사용 하 여 HDL-콜레스테롤의 mg 당 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 단정. 이 접근 방지 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족과 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 하 여 이전 HDL 기능 분석 (예: 콜레스테롤 경과 분석 결과)의 알려진된 제한 사항 트리 글리세라이드7,,1532. HDL의 생물 학적 속성 (예: 콜레스테롤 경과) 보다 생화학의 결정 더 재현할 수 있습니다. 간 분석 결과 실험 다양성 &#60; 10% 호의 비교 하 여 HDL 함수, interassay 실험적인 다양성은 종종의 세포 기반 분석으로 &#62; 15% (또는 보고 되지 않은). 또한,이 ...

동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD) 죽음 전세계1,2의 주요 원인입니다. 역학 연구 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤의 저급은 반대로 동맥 경화1,2의 개발에 대 한 위험과 연관 일반적으로 나타났습니다. 여러 연구는 HDL1,2atheroprotective 역할을 지원, 비록는 HDL 약하게 시작 및 동맥 경화의 진행 하는 메커니즘은 3,4입니다. 따라서, 그것은 복잡 한 구조와 기능 절대 수준 보다는 오히려 HDL의 아 테 롬 5,6,,78예측 더 정확 하 게 수 있습니다 제안 되었습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. 이러한 i) 감소는 콜레스테롤 경과 잠재적인 9, ii) 항 염증 및 증가 HDL 관련 된 프로-염증 성 단백질 6,7, iii) 감소 항 산화 요소 수준 및 활동 및 HDLs 감소 낮은 밀도 지 단 백 질 (LDLox)10 및 4의 산화를 억제 하는 기능) 지질 hydroperoxide 콘텐츠 및 산화 환 원 활동 (HDLox)9,11증가. 수 있습니다 (예: 콜레스테롤 경과, 항 산화 기능) HDL의 pleotropic 기능을 평가 하는 강력한 분석 HDL-HDL-콜레스테롤은 병원에서의 보완 하는 것입니다.
HDL 함수는 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과8,12,,1314같은 셀 기반 방법으로 평가 됩니다. 이러한 방법을 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족 및 트리 글리세라이드 7,15의 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 한 주요 제한이. 이러한 단점이 큰 임상 연구16어려움 포즈. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. 콜레스테롤 경과 HDL의 가장 중요 한 기능 중 하나 이지만 그것은 세포 기반 분석 실험에 의해 결정 수 있습니다. Proteomics17,18,19,20,,2122,23, 같은 HDL 함수를 확인 하는 다른 접근 24 및 HDL 함수 17,,2225 의 셀 기반 monocyte chemotaxis 분석 실험 표준화 되지 대규모 인간 연구에 사용할 수 없습니다.
HDL는 중요 한 항 산화 atheroprotective 효과5,6,,78. HDL의 항 산화 기능 이전 셀 무료 fluorometric 분석 실험 26에 LDL의 존재 결정 했다. 이러한 생화학 fluorometric 방식의 HDL 항 산화 기능 모하마드 Navab과 앨런 Fogelman26그들의 동료 의해 원래 개발 되었다. 비록 많은 인간 연구 HDL 함수 17,18,19,20,,2122,23 결정 하기 위해 이러한 방법을 사용 ,24, 지질 (HDL)-지질 (LDL) 및 지질-형광 색소 상호 작용의 이러한 셀 무료 비 효소 생 화 확 적인 분석 실험 HDL 기능27,28의 재현성을 제한할 수 있습니다.
최근 관심은 지질과 HDL 27,,2930단백질의 산화 결과 HDL 산화의 기능적 결과에 집중 했다. 사전 연구 HDL의 그 산화 손상 HDL 기능 27,,2930. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 따라서 HDL 지질 과산화 수소 수 수 HDL 함수 9,17,,2031 을 결정 하는 데 사용 내용과 주어진 HDL 기능7의 이전 분석 실험의 알려진된 제한 사항 15,,2732, 우리 개발 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) 32단정 대체 fluorometric 메서드입니다. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C 32의 mg 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소를 기반으로 합니다. 분석 결과의 생 화 확 적인 원리는 그림 1에 표시 됩니다. 우리는이 형광 기반 접근 이전 HDL 기능 분석 실험27,28의 한계는 없습니다 나타났습니다. 이 분석 결과 더 세련 되 고도 cryopreserved 플라즈마 32,,3334, 와 함께 대규모 인간 연구에서 안정적으로 사용할 수 있도록 우리의 실험실에서 표준화 되어 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42.이 분석 결과의 판독은 판독 검증된 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직 염증, 면역 부전 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 조치의 연관 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. 여기, 우리이 간단 하면서도 강력한 방법을 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox)를 측정 하는 설명. 이 분석 결과 사용할 수 있습니다 도구 HDL 함수 인간의 질병에서의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질32(동맥 경화) 등 중요 한 역할가지고.

<table><tbody><tr><td>Experimental Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL PEG(폴리에틸렌 글리콜) 침전 시약</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red 시약.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &황소; 건조제 &bull; 가벼운 DMSO로부터 보호하십시오</td></tr><tr><td>.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &황소; 건조제 &bull; 가벼운</td></tr><tr><td>말 무 퍼옥시다제 (HRP)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트로부터 보호하십시오. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &황소; 건조제 &bull; 가벼운</td></tr><tr><td>콜레스테롤 에스테라아제</td>로부터 보호하십시오.<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &황소; 건조제 &bull; 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>콜레스테롤 참조 표준</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &황소; 건조제 &bull; 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>Resorufin 형광 참조 표준</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &황소; 건조제 &bull; 빛으로부터 보호5x</td></tr><tr><td>반응 버퍼.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &황소; 건조제 &bull; 가벼운</td></tr><tr><td>HDL 콜레스테롤 자동화 시약</td>으로부터 보호 <td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates (폴리프로필렌, 평평한 바닥, 투명).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트(폴리프로필렌, 평평한 바닥, 검정색).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, sterile</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific 멀티채널 피펫, 8-채널, 125&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Co., 미국 캘리포니아주 산호세.</td><td>&nbsp; 14-387--955</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 소프트웨어</td><td>Biotek, 버몬트, 미국</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td> 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Plate reader</td><td>Biotek, 버몬트, 미국</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 fluorometric 효소 분석 결과

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

낮은 고밀도 지 단백 콜레스테롤 (HDL-콜레스테롤) 수치는 동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD)의 가장 강력한 독립적인 부정적인 예측 중 하나입니다. 구조와 기능 보다는 HDL-콜레스테롤 HDL의 동맥 경화를 예측 더 정확 하 게 수 있습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. HDL 함수 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과 이러한 분석 등 분석은 표준화의 수많은 단점 부족 세포 기반으로 의해 결정 됩니다. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. HDL 산화 HDL 기능을 손상 한다. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 지질 조사 상호 작용은 지질 산화 상태를 측정 하기 위한 분석 실험 비 효소 형광의 결과 해석 할 때 고려 되어야 한다. 이 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) HDL 역 기능에 기여를 평가 하기 위해 셀 무료 생화학 효소 방법 개발 동기. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C의 밀리 그램 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소에 따라 여기는 프로토콜은 형광 색소 시 약을 사용 하 여 HDL-지질 과산화의 describedfor 결정. 분석 결과 변화 실험 조건의 엄격한 표준화에 의해 줄일 수 있습니다. HDLox 값이 높을수록 감소 된 HDL 항 산화 기능으로 연결 됩니다. 이 분석 결과의 판독은 유효한 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직의 염증, 면역 부전, 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 측정의 판독에 연관 된다. 이 기술적인 접근 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질 (동맥 경화) 등 중요 한 역할을가지고 인간의 질병에 HDL 기능을 평가 하는 강력한 방법입니다.

각 HDL 샘플의 50 µ L 단계 7.3에서 각 음에 추가 됩니다. 50 µ L HRP 솔루션 5 U/mL (0.25 U) 그런 다음 단계 7.5에서 각 음에 추가 됩니다. 샘플 단계 7.6에서 37 ° C에서 30 분 동안 알을 품는. 형광 색소 시 약의 50 µ L 다음 단계 7.7 (300 µ M의 최종 농도)에서 각 음에 추가 됩니다. (에서 어두운) 형광 판독입니다 다음 매 순간 형광 플레이트 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 동안 평가 했다. 빈, 풀링된 컨트롤에 대 한 대표적인 형광 데이터, 알려진된 역 기능 HDL와 샘플 및 샘플 일반 HDL 그림 4에 표시 됩니다. 원시 대표적인 데이터와 프로토콜의 8에서에서 설명 하는 방정식을 사용 하 여 결과의 단계 분석 에서처럼 표 1. 이 예제에서는 신선한 HDL 샘플 사용 하 고 HDLox 값은 일반적...

여기 HDL-지질 과산화의 결정에 대 한 fluorometric 셀 무료 생화학 분석 결과 설명합니다. 이 신속 하 고 재현성 분석 결과 대규모 연구에서 HDL 함수를 확인 하는 데 사용 수 고 인간의 질병에 HDL 함수에 대 한 우리의 이해에 기여할 수 있다.

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

이 실험 방법의 전반적인 목표는 특정 양의 HDL의 과산화물 지질 함량을 측정하는 생화학적 무세포 분석을 사용하여 고밀도 지단백질의 기능을 결정하는 것입니다. 이 방법은 심혈관 질환 대사 이상에서 HDL 기능의 역할과 같은 여러 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 HDL 기능을 안정적으로 측정하는 데 사용할 수 있는 무세포 생화학적 방법이라는 것입니다.이 방법은 심혈관 질환 및 대사 이상에서 HDL 기능의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 염증성 질환과 같은 질병에 대한 다른 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 대조군, 시료 및 복제를 포함하여 96웰 플레이트에 대한 작업 레이아웃을 준비합니다. 샘플과 반복 횟수에 따라 필요한 시약의 부피를 계산합니다.영구 마커를 사용하여 분석의 각 단계에 대한 튜브에 라벨을 부착합니다. 다음으로, 각 샘플에서 10마이크로리터를 결합하여 풀링된 대조군 샘플을 만듭니다. HDL-C 값을 측정하기 위해 임상 실험실을 위한 두 번째 통합 대조군 샘플을 만듭니다.HDL을 대량으로 준비한 후 동결 해동 주기를 최소화하기 위해 여러 부분 표본을 동결 보존합니다. 최소 10개의 서로 다른 반복실험을 풀링하여 풀링된 품질 관리를 생성합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HDLox의 평균값을 결정합니다.HDL-C 값을 결정하기 위해 임상 실험실에 대한 두 번째 통합 품질 관리를 생성합니다. 먼저 새로운 혈장 또는 혈청 샘플을 해동합니다. 동일한 부피의 혈장과 HDL 콜레스테롤 침전 시약을 함께 혼합합니다.잘 섞이기 위해 여러 번 위아래로 피펫을 사용하십시오. 1000에서 2000 곱하기 G 사이의 속도로 10분 동안 원심분리기. 그 후, 상등액을 흡인하십시오.형광 색소 HDL 기능 분석을 수행할 준비가 될 때까지 분리된 HDL을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 임상 실험실의 HDL-C 값이 HDLox를 정규화하는 데 사용되는 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 혈장에서 HDL-C를 정량화합니다. 먼저 콜레스테롤과 HRP를 혼합하여 준비된 용액에 HRP 1밀리리터당 5단위가 포함되도록 합니다.형광 색소 시약 바이알과 DMSO 바이알을 실온으로 해동합니다. 해동 후 1mg의 형광 색소 시약을 200 마이크로 리터의 DMSO에 용해시킵니다. 이 용액을 섭씨 영하 20도 이하의 온도에서 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.다음으로, 50마이크로리터의 1X 반응 버퍼를 음성 대조군으로 샘플 플레이트에 추가합니다. 50마이크로리터의 20밀리몰 과산화수소 작업 용액을 양성 대조군으로 추가합니다. 그런 다음 준비 플레이트로 사용할 새로운 둥근 바닥 96웰 플레이트를 준비합니다.이 준비 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 분리된 HDL을 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비 플레이트에서 실험 플레이트로 50마이크로리터의 HDL을 이동시키며, 실험 플레이트의 수는 분석의 반복 횟수와 동일합니다. 그런 다음 준비된 HRP 용액 50마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 다음 각 웰에 50마이크로리터의 형광 색소 시약을 추가하여 웰당 총 부피는 150마이크로리터입니다. 잘 섞어 빛으로부터 보호하십시오. 형광판 판독기를 사용하여 섭씨 37도의 어둠 속에서 120분 동안 1분마다 형광 판독값을 평가합니다.적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 기록한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 단위의 평균값을 계산합니다. 이 연구에서는 HDL-C 밀리그램당 HDL 과산화물 지질 함량을 정량화하기 위해 cell-free 생화학적 형광 분석 방법을 개발했습니다. 이는 HRP를 사용한 효소 증폭에 의해 수행됩니다.그런 다음 형광판 판독기를 사용하여 120분 동안 어둠 속에서 1분마다 형광을 측정합니다. 기능 장애 HDL이 있는 것으로 알려진 환자에 대한 대표 데이터가 통합 대조군과 비교하여 여기에 나와 있습니다. 기능 장애 HDL은 건강한 참가자의 통합 HDL에서 볼 수 있는 것보다 과산화물 지질 수치가 2배 높은 것으로 나타났습니다.다음으로, HDL을 분리하고 50명의 건강한 피험자와 100명의 HIV 감염 환자에서 HDLox를 측정합니다. HIV에 감염된 환자는 건강한 피험자보다 HDL-C 밀리그램당 평균 60% 더 높은 HDL 과산화물 함량을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 모든 시약과 대조군을 미리 준비하고, 일관되고 정확하며, 항상 각 실험 플레이트에 적절한 실험 대조군을 포함해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 HDL을 분리하는 방법, 특정 양의 HDL의 과산화물 지질 함량을 측정하고 HDL 기능에 관한 것을 폐기하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 생체 표본으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

드 노보 지방 생성 및 β - 지방산 산화는 간세포의 주요 대사 경로, 지방간 질환 등 여러 가지 대사 장애에 교란되는 경로를 구성한다. 여기에서 우리는 마우스 차 간세포의 분리를 보여와 β-지방산 산화 및 지방 생성의 정량화를 설명합니다.

마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

이 프로토콜에는 라이브 셀 이미징 다양 한 셀 형식에 시스템을 사용 하 여 실시간으로 유입 속도와 LDL 콜레스테롤 흡수를 측정 하는 효율적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 세포 형태학 및 그러므로 잠재적인 세포 독성에 대 한 모니터링 하면서 LDL 유입에 영향을 미치는 화합물의 약리 활동 화면 플랫폼을 제공 합니다.

LDL 콜레스테롤 이해 분석 결과 라이브 셀 이미징 분석 셀을 사용 하 여 상태 모니터링

혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마를 생체 외에서 콜레스테롤 경과 용량 측정은 동맥 경화에 대 한 biomarker로 유망한 도구입니다. 현재 연구에서 우리 최적화 및 형광 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.

높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 천연 마이크로 RNA 함량 (절대/상대)의 결정을 위해 제시 된다. 또한, 마이크로 RNA 레벨을 증가 시키는 방법 뿐만 아니라, 지 단백질 입자의 세포 흡수 율을 결정 하는 방법이 입증 되어 있다.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

눈의 망막 색소 상피층에 영향을 미치는 퇴행성 안구 질환은 단일 유전자 및 다유전자 기원을 가지고 있습니다. 여러 질병 모델과 소프트웨어 응용 프로그램인 LipidUNet이 질병의 메커니즘과 잠재적인 치료 개입을 연구하기 위해 개발되었습니다.

LipidUNet-iPSC 유래 망막 색소 상피를 이용한 지질 침전물의 특성화 및 정량화의 기계 학습 기반 방법

우리는 원형질막의 지질과 외인성 지질 사이의 교환을 매개하기 위해 시클로덱스트린을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 지질 뗏목과 같은 환경에서 뗏목과 같은 환경이 아닌 뗏목과 같은 환경에서 다르게 행동하는 막관통 단백질을 연구하는 실험과 쌍을 이룰 수 있습니다.

살아있는 세포의 지질 교환 분석

이 프로토콜은 장쇄 및 초장쇄 포화 지방산의 BODIPY-C12 및 BODIPY-C16 형광 유사체로 자극 시 내피 세포에서 세포 지질 흡수를 측정하기 위한 시험관 내 분석을 자세히 설명합니다. 이 방법은 효율적이고 다른 세포 유형에 적응할 수 있어 지질 대사를 연구하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다.

형광 지방산 유사체를 이용한 내피 지방산 흡수의 정량화

본원에서, 우리는 전체 인간 혈장 또는 혈청에 존재하는 고밀도 지단백질(HDL)에 의해 지질 공여자 입자로부터 특이적으로 제거된 형광 인지질의 양을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 HDL 기능의 이 지표가 발생 심혈관 질환을 예측한다는 것을 보여주었습니다.

고밀도 지단백질 특이적 인지질 유출 분석

학습하세요 고밀도 지단백(HDL)의 지질 과산화를 측정하는 세포-무료 형광 효소 분석법을 통해 심혈관 및 대사 질환 연구에서 HDL 기능을 신뢰성 있게 평가하는 방법을.

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

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