Name: 반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 학습하세요 Docetaxel에 내성을 가진 전립선 암 세포 모델을 생성하는 방법을. DU145 또는 22Rv1 세포를 사용하여 약물 내성 메커니즘을 연구하고, crystal violet 염색으로 세포 생존율을 분석합니다. 이 기법은 항암제 반응 연구에 활용됩니다.

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V.R.-B. 건강의 미국 부 로부터 자금을 받습니다 &#38; 번호 1를 부여 하는 인간 서비스, 국립 보건원, 국립 암 연구소 K22 CA207458-01 '과 법학. 건강의 미국 부 로부터 자금을 받습니다 &#38; 번호 1를 부여 하는 인간 서비스, 국립 보건원, 국립 암 연구소 R01 CA207311-01.

1. 식민지 형성 능력 (IC50)에서 50%를 일으키는 Docetaxel 농도 감소 참고:이 프로토콜에서 Docetaxel IC50 농도 평가 식민지 형성을 사용 하 여 능력입니다. 조사에 따라 세포 생존 능력 (즉, MTS 분석 실험)를 평가 하는 데 사용 하는 대체 메서드를 사용할 수 있습니다 &#39; 환경 설정.
<ol><li>성장 DU145 또는 22Rv1 75 cm 2 플라스 크에 세포와 10mm Docetaxel 미래 실험에 사용 되는 DMSO에 희석의 충분 한 재고를 준비.</li>
	<li>IC50 Docetaxel의 결정에 대 한 셀을 접시, 플라스 크에서 미디어를 제거, 신중 하 게 씻어 5 mL PBS, 셀 및 2 mL 0.05% 품 어 세포를 플라스 크 표면에서 분리를 37 ° C에서 3-5 분에 대 한 트립 신-EDTA.</li>
	<li>신선한 미디어의 5 mL을 사용 하 여 플라스 크에서 trypsinized 셀 린스 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 원심 (300 x g, 3 분, 실 온 (RT))에 의해 셀을 펠 렛.</li>
	<li>는 상쾌한 제거 하 고 신선한 미디어의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend는 셀. 2-2.5 x 10 5 셀/mL DU145 및 22Rv1에 대 한 10 5 셀/mL x 4-4.5 세포 현 탁 액을 희석 아래로 pipetting으로 잘 혼합 하 고 두 6 잘 플레이트의 각 음에 서 스 펜 션의 2 개 mL를 씨앗.</li>
	<li>후 24 h, 70-80% 합류에 셀 때 추가 복용량 고조 Docetaxel 농도 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 그리고 각 잘 1000 nM. DMSO와 잘 컨트롤 Docetaxel ( 그림 2A)에 사용 되는 높은 볼륨에서 취급.</li>
	<li>후 72 h 발음 마약 미디어를 포함 하 고 신선한 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다. 약 4-5 일 이내 번호판 얼룩에 대 한 준비가 될 것입니다.</li>
	<li>식민지, 얼룩에 부드럽게 2-3 mL PBS로 세척 하 고 조직 문화 후드 또는 증기 두건 안쪽 20 분 동안 2-3 mL 크리스탈 바이올렛 솔루션 (0.1 w/v %10% 포 르 말린에) 그들을 품 어.</li>
	<li>H 2 O 2-3 mL에 대 한 솔루션 및 세척의 접시 얼룩 제거, H 2 O를 제거 하 고 접시 건조.</li>
	<li>어느 Docetaxel 농도 50% (IC50) 세포 생존 능력을 감소 하는 확인 하려면 우물을 시각화 하 여 결과 분석 합니다. 수동으로 ()을 피하기 위해 같은 식민지를 두 번 계산 마커 펜의 도움으로 식민지를 계산 하 고 그래프 ( 그림 2A)에서 세포 생존 능력의 비율을 나타냅니다. 마지막으로, ( 그림 3A에서 같이) 그림 표현에 대 한 번호판의 디지털 이미지를 받아.</li>
</ol> 2. Docetaxel 내성 전립선 암 세포의 생성 참고: 세포 치료 같은 Docetaxel 솔루션 주식 결심 IC50 약의 사용을 사용 하 여 수행 (사전에 충분 한 재고를 준비 실험 사용 하 여). 항상 뭔가 잘 작동 하지 않는 경우에 이전 단계에서 세포의 작은 술병을 유지. 부모의 셀을 전체 절차를 통해 작은 술병에 병렬로 성장 하 고 Docetaxel 취급 플라스 크에 사용 금액을 흉내 낸 해당 볼륨에서 차량 (DMSO)에 노출 한다.
<ol><li>미디어의 20 mL를 포함 하는 150 cm 2 플라스 크에 접시 DU145 또는 22Rv1 셀 (3.5 x 10 6 세포 플라스 크 당 DU145 및 6.5 * 10에 대 한 22Rv1에 대 한 플라스 크 당 6 셀). 10 ~ 20 셀의 플라스 크를 사용 하 여 프로토콜의 끝에 충분 한 세포를가지고 것이 좋습니다.</li>
	<li>후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류 ( 그림 2B, Docetaxel 전에), 프로토콜의 1 단계에서 결정 IC50 농도에서 Docetaxel 추가 (5이이 프로토콜에서 설명 하는 셀에 대 한 nM).</li>
	<li>후 72 h 발음 마약 미디어를 포함 하 고 신선한, Docetaxel 무료 미디어 ( 그림 2B, Docetaxel 후 72 h)를 추가 합니다. 모든 3-4 일 미디어를 변경 합니다. 약 1-2 주 이내 저항 클론 ( 그림 2B, Docetaxel 후 7 ~ 14 일) 현미경 분명 나타납니다.</li>
	<li>미디어 발음, 신중 하 게 씻어 15 mL PBS와 셀 및 4 mL 0.05% 품 어 세포를 플라스 크 표면에서 분리를 37 ° C에서 3-5 분에 대 한 트립 신-EDTA.</li>
	<li>Resuspend 8 mL 신선한 매체를 사용 하 여 플라스 크에서 trypsinized 셀. 모든 치료 플라스 크에서 수영장 셀입니다. 원심 (300 x g, 3 분, RT)에 의해 셀을 펠 렛.</li>
	<li>제거는 상쾌한, 셀 펠 릿 20 ml 신선한 매체의 resuspend와 150 cm 2 플라스 크에 세포 격판덮개 (3.5 x 10 6 세포 플라스 크 당 DU145 및 6.5 * 10에 대 한 22Rv1에 대 한 플라스 크 당 6 셀).</li>
	<li>후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류, 추가 5 nM Docetaxel (초기 IC50 농도) 다시.</li>
	<li>2.3 2.6에 하루 3 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류, 2 X IC50 Docetaxel 농도와 치료 세포 (10 nM이이 프로토콜에서 설명 하는 셀에 대 한).</li>
	<li>반복 2.3을 2.8, Docetaxel 농도의 복용량 단계적 확대를 다음 단계 (25 nM, 50 nM, 100 nM와 250 nM), 최종 높은 농도에서 플라스 크에서 성장 하는 세포의 안정 되어 있는 인구를 생성. 최대 6 개월 1000 nM 농도 ( 그림 1A)를 도달할 때까지 높은 농도 대 한 복용량 에스컬레이션 프로토콜을 구현할 수 있습니다.</li>
</ol> 3. 기능 특성의 인수 Docetaxel 저항 식민지 대형 분석 결과 의해 참고:이 프로토콜 chemoresistance 평가 식민지 대형 분석 실험을 사용 하 여. 조사에 따라 세포 생존 능력 (즉, MTS 분석 실험)를 평가 하는 데 사용 하는 대체 메서드를 사용할 수 있습니다 &#39; 환경 설정.
<ol><li>접시 2000 셀 (DU145 또는 22Rv1, 보호자 및 Docetaxel 방지) 6-잘 접시에 잘, 당 사용 하 여 미디어의 2 mL 잘 당.</li>
	<li>후 24 h 추가 Docetaxel의 증가 농도 (부모의 셀: 0.25, 0.5, 1, 2.5 및 5 nM; 박사 셀: 50, 125, 250, 500 및 1000 nM). DU145 및 22Rv1 셀 라인에 대 한. 동일한 볼륨 높은 Docetaxel 복용량에 대 한 사용에서 컨트롤 한 잘에만 DMSO를 추가.</li>
	<li>72 h 후 미디어를 포함 하는 약물을 발음 하 고 신선한 Docetaxel 무료 미디어 추가.</li>
	<li>식민지 현미경 아래에서 표시 됩니다 때까지 1-2 주에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>식민지, 얼룩에 부드럽게 2-3 mL PBS로 세척 하 고 조직 문화 후드 또는 증기 두건 안쪽 20 분 동안 2-3 mL 크리스탈 바이올렛 솔루션 (0.1 w/v %10% 포 르 말린에) 그들을 품 어.</li>
	<li>H 2 O 2-3 mL에 대 한 솔루션 및 세척의 접시 얼룩 제거, H 2 O를 제거 하 고 접시 건조.</li>
	<li>우물을 시각화 하 고 수동으로 마커 펜 ()을 피하기 위해 같은 식민지를 두 번 계산의 도움으로 식민지를 계산 하 여 결과 분석 하 고 그래프에서 세포 생존 능력의 비율을 나타냅니다. 그림 표현 ( 그림 3A)에 대 한 번호판의 디지털 이미지.</li>
</ol> 4. Phenotypic 특성의 Docetaxel 저항 인수 형 qRT-PCR 분석 통해 참고: Docetaxel (DR) 내성 세포 전시 그들의 부모의 세포 라인에 비해 다른 식 프로필 28 , 29. 따라서 선택의 성공 qRT-PCR에 의해 확인할 수 있습니다 특정 표식에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 (뇌관 시퀀스에 대 한 참조 자료 섹션; 대 한 자세한 내용은, 결과 섹션을 참조 하십시오). 이 세 번째 라운드 후 시작 선택의 각 라운드 후 할 수 있습니다. 또는, 서쪽 blotting에 의해 Docetaxel 저항 표현 형의 평가 또한 가능 하다.
<li>RNA 추출 키트를 사용 하 고 제조 업체에 따라 보호자와 Docetaxel 내성 세포에서 RNA 추출 <ol>&#39; s 지침 (테이블의 재료 및 시 약 대 한 자세한 내용은 참조). 최소를 사용 하 여 1-2 10 6 셀 x 좋습니다.</li>
	분 광 광도 계를 사용 하 여 <li>계량 RNA 260 nm absorbance 최고의 순도, 260 nm/280 nm 흡 광도 비율 2.0에 가까운 이어야 합니다.</li>
	<li>Perform 역방향 역방향 전송 키트를 사용 하 고 제조 업체에 따라 보완 DNA (cDNA)를 전사 &#39; s 지침 (참조 테이블의 자료와 정보에 대 한 시 약), 20 µ L에서 RNA의 1 µ g를 사용 하 여 반응 혼합 (cDNA의 높은 금액 필요한 경우, 그에 따라 반응 혼합 최대 규모).</li>
	<li>관심사의 각 유전자에 대 한 다음과 같은 3 중에서 정량 반응을 준비: -2 µ L 10 µ M 앞으로 뇌관의 -2 µ L 10 µ M 역 뇌관의 -10 µ L SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스 -5 µ L H 2 O -1 µ L의 4.3 단계에서 새로 준비 된 cDNA. 
	주:이 프로토콜에 사용 되는 뇌관의 시퀀스에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.</li>
	<li>PCR 프로그램을 다음과 같이 설정: -15 분 동안 95 ° C -94 ° C 30에 대 한 s | 
	-40 56 ° C s | 40 번 -72 ° C 30에 대 한 s |</li>
	<li>정량 결과 분석 하 고 부모의 사이 유전자 발현에 변화를 확인 하 고 박사 샘플, 관심사의 각 유전자의 사이클 임계값 (Ct) 값 3 중에 결정 됩니다 평균 로드 제어 (말라 triplicate 평균으로 정규화 ) 박사 (박사 Ct) 및 부모의 셀 (부모의 Ct). 부모 셀에 대 한 값을 1로 정규화 됩니다. ΔCt (Ct 박사-부모의 Ct) 최종 mRNA 배 변화를 결정 하 고 그래프에 표시. 증가 &#62; 2 또는의 감소 &#60; 0.5 중요 하 게 고려 하 고는 Docetaxel의 설립의 좋은 유효성 검사 인수 저항 형 ( 그림 3B).</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 원고에서는 우리 chemoresistance 표현 형의 획득에 기여 하는 메커니즘의 연구에 대 한 수 Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델 시스템을 생성 하는 방법 설명. 이 접근은 매우 안정적이 고 재현, 일부 잠재적인 제한 사항은 고려해 야 합니다. 이후만 셀의 대량 인구의 극히 chemoresistance28을 전시할 것 이다, 것이 좋습니다 세포의 큰 인구와 함께 시작 (우리가 일반적으로 약 1.2 x 10에 대 한 계정을 150 cm2, 20 플라스 크 플레이트8 셀)입니다. 프로토콜의 주요 단계는 절차의 성공을 보장 하기 위해 고려 되어야 한다. 첫째, 그것은 매우 사용 같은 Docetaxel 갓 긴 기간 사용 (10 m m 재고-80 ° C에서에 제대로 저장 될 때 년에 aliquots를 사용할 수 있습니다)에 대 한 재고를 준비 하는 것이 중요. Aliquot Docetaxel에 약간의 변화 IC50, 셀 라인 타이밍의 세대의 결과 식민지 형성 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 그것은 유사 세포의 새로운 배치를 사용 하는 경우 발생할 수 있으므로 각 개별 셀 라인, IC50를 결정 하는 프로토콜을 시작 하는 중요 한. 셋째, 오류 수 있습니다 신속 하 게 감지 하 고 수정 현미경 세포를 자주 확인 하 여 약물 치료는 효과적인 모니터링에 필수적 이다. 마지막으로, 오염 또는 프로토콜 가운데 세포의 생존 능력에 영향을 미칠 수 있는 예기치 않은 문제 중간 단계의 재고를 항상 유지 하 고 좋습니다. 중요 한 것은, 우리의 프로토콜 72 h 뒤에 약의 더 낮은 일정 농도 보다는 긴 회복 기간, 최고의 모방 하려고 Docetaxel의 고용량을 전립선 암 세포를 노출 하 여 약물 내성의 모델을 생성 하는 것을 목표로 임상 시나리오가 taxane 에이전트15,16전립선 암 치료에 대 한 보고.
또한, 약물 내성 세포 전시 시간이 지남에 인수 저항 속성의 진보적인 손실로 이어질 수 있는 높은 소성을 주목 한다. 따라서 문화에 2-3 개월 이상에 대 한 이러한 세포를 사용 하 여 확장는 권장 하지 않습니다. 영구적인 공급 필요 하다 면 그것은 지속적으로 저항 세포의 새 일괄 처리를 생성 하는 것이 좋습니다. 그러나, 만약 셀의 일괄 처리 오랜된 시간 동안 경작 되는, 식민지 대형 분석 실험 및 정량 그들의 저항을 재평가 하 사용할 수 있습니다. 또 다른 대안은 72 h (500-1000 nM) Docetaxel의 높은 복용량으로 세포를 치료 하 여 말기 저항을 높일 것 이다. 1 ~ 2 주간의 회복 기간 후 phenotype 시험 될 수 있다 다시 정량 및 식민지 형성에 의해 분석 실험. 그것도 가능, 치료 세포의 aliquots (FBS, 10 %DMSO)에서 액체 질소에 저장을 권장 되지는 않지만. 그 후 동결-해 동 주기 chemoresistance 형 항상 다시 평가 해야 상기 방법으로 note 하시기 바랍니다.
이러한 경고에도 불구 하 고 우리28,29 등30,31,,3233 키 소설 세포를 식별 하기 위해 이러한 모델 시스템을 성공적으로 수 있었다 고 분자 메커니즘을 선도 높은 종양을 시작, 세포 생존, 용량과 Docetaxel 내성 세포에 공격. 이러한 암 세포 모델 시스템을 사용 하 여, 우리는 세포가 상피 및 전립선 관련 분화 마커의 부재와 대상의 overexpression 발달 특징 undifferentiated 형 전시 발견 (노치 및 고슴도치) 신호 경로, 화학요법 노출28살. 두 번째 연구에서 공개적으로 사용 가능한 환자 유전자 데이터 세트24,25, 함께이 모델을 사용 하 여 우리가 발견 그 초기 전사 요소 GATA2는 높은 overexpressed 전이성에 거세 저항 화학 요법에 저항력이 전립선 암 세포입니다. GATA2 신호 네트워크29IGF2 종속 다운스트림 키를 직접 활성화 하 여 세포의 생존을 증가 시킵니다. 특히, 이러한 연구 고급 전이성 전립선 암 공격34GATA2의 소설 키 역할을 식별 하는 데 도움이.
그것은 많은 다른 유형의 다양 한 화학요법 약물으로 치료 하는 암 중 널리 퍼진 약물 저항의 개발 Docetaxel과 전립선 암에 국한 되지 않습니다 하는 문제입니다. 실제로, 실험 모델의 가용성에 유사한 제한이 적용, 그리고 그것은 우리의 프로토콜 다른 암 종류 및 그들의 각각 chemoresistance 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 된 대로 Docetaxel 저항 세포의 생성 chemoresistance의 소설 관련 분자 및 세포 메커니즘을 식별 하는 기능적 도구로 사용할 수 있습니다. 이는 높은 악성 전립선 암에 대 한 새로운 치료법의 개발 수 똑, 우리가이 질병에 대해 무엇을 알고 하 고 우리는 환자를 치료 하는 방법의 경계를 한 번 더 밀고 새로운 목표를 찾아내기에 문을 엽니다.

세포 주기 통제의 손실에 의해 발생 하는 확산의 증가 속도 암1의 특징입니다. 이 기능 속성 렌더링 암 세포 고유 셀 사이클의 주요 프로세스의 충실도에 따라 동안 S-및 M-단계는 다양 한 세포 주기 perturbing DNA 손상 또는 mitotic 결함을 유발 하는 약물의 개발을 주도하 고 있다. 비록 mitotic kinases 또는 모터 단백질의 억제제 같은 수많은 안티 mitotic 에이전트는 현재 개발 되 고 임상 시험된에서 레거시 microtubule 대상 에이전트 (Mta) 계속를 위한 유일한 임상 승인 된 접근 암2,,34유사 분열을 대상으로. Mta 중 불안정 (Vinblastine Vincristine, Vinorelbine) 또는 (taxane 파생 에이전트 Paclitaxel, Docetaxel 또는 Cabazitaxel) microtubules 안정화 및 그로 인하여 작동 mitotic 스핀 들5,6의 형성을 방지. 이 트리거는 스핀 들 어셈블리 검사점7,8, 장기간된 mitotic 체포와 배양된 세포9,10 에 최후 세포 죽음 및 종양11에에서 mitotic 결함에 결과 ,12 고 따라서 전립선 암13큰 다양 한 그들의 사이에서 암 치료에 유용.
전립선 암은 가장 자주 진단 암과 암의 주요 원인이 남자14죽음 관련. Antimitotic 에이전트 Docetaxel 등 전립선 암 환자의 생존 향상 되며이 질병15,,1617의 처리에서 주류. 불행히도, 초기 종양 수축 량에도 불구 하 고 종양 세포 치료 중 약물 저항 자주 개발. 몇 가지 세포 메커니즘 chemoresistance, apoptotic와 염증 경로, 규제 완화 등 활성화/overexpression ATP 묶는 카세트 운송업 자 같은 마약 경과 펌프의 개발 원인에 연루 되어 P-당단백질 (P-gp/ABCB1), 후자는 결과 셀18,19에서 화학요법 에이전트의 수출. Taxanes 저항 또한 tubulin isotypes 또는 tubulin 돌연변이, 약물 및 그 대상 20,21사이의 상호 작용을 방지 하는 식의 변화와 같은 다른 원인으로 연결 되었습니다. 또한, 저항 게놈 불안정성 축적 및 종양이22,23관련 되어 있다. 그러나, taxane 저항에 기여 하는 메커니즘은 완전히 이해 되지,는 분명 모양을 방지 하는 치료 전략의 부재. 따라서, 이러한 메커니즘의 해 부에 지원 실험 모델을 생성 하 고 이러한 약물 저항의 개발을 방지 하는 새로운 치료 접근을 식별 하는 긴급 한 필요가 있다.
이 문서에서 우리는 전립선 암 세포 Docetaxel 저항 (DR)의 생성을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 추가 저항 상태 식민지 대형 분석 실험 및 양적 RT-PCR를 사용 하 여 이러한 셀의 유효성을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드에 의해 생성 세포 분자 기능을 통해 다양 한 실험적인 분석 실험을 수행 하는 융통성을 제공 하는 추가 혜택으로 공개적으로 사용 가능한 인간 종양 샘플 데이터베이스에서 발견의 많은 업과의 이점을 종양 샘플에서 허용 하는 것 보다 시간의 긴 기간 치료 저항의 이러한 암 모델 수 많은 주 조직 문화, 그리고 다른 접근 들에 대 한 확장, 유전자 조작, 현미경 검사 법 방법으로 시각 고 유전자 발현에 대 한 분석. 또한, 추가로 종양 형성 및 성장 vivo에서 효과 분석 하는 쥐에 xenotrasplanted 수 있습니다. 현재, 전립선 암의 맥락에서 약물 내성 연구를 주요 대체 방법 종양 샘플의 직접 분석 이다. 이러한 샘플 유전자 발현 및 주어진된 종양의 mutational 상태에 대 한 정보를 수집 하는 매우 강력한 시스템을 제시 하는 동안 그들에 게 액세스 매우 제한 될 수 있습니다 그리고 그들은 더 조작 및 실험 분석에 대 한 유지 하기 어려운이 이 프로토콜24,25생성 된 셀 라인으로 쉽게 할 수 있습니다. 중요 한 것은, 미래에 대안 같은 환자에서 인간의 파생된 organoids의 생성 될 것 이라고 매우 강력한 도구 현재 메서드26,27대안 접근 한다. 이후 그들은 어떤 종양은 그것의 원래 환경에서 3D 컨텍스트에서 정리 것 이다, organoids 세포와 인간 종양 사이의 완벽 한 모델 될 것입니다. 그러나,이 프로토콜에서 설명 하는 실험 셀 모델은 여전히 더 많은 유지 저렴 하 고 빠른 분석에 적합. 이러한 세포 선을 공부 하 여 얻은 결과를 추정 하 고 인간의 샘플 및 3 차원 문화에서 확인 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 우리의 프로토콜은 다른 약물과 암 종류의 연구에 적용할 수 있습니다 이후 어떤 셀 라인 chemoresistance 메커니즘 연구를 셀 모델을 추구 하는 연구원에 대 한 관심의 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 어떤 실험실, 저렴 한 가격에 적용 하 고 약물 내성의 분자 및 세포 메커니즘의 예비 연구를 허용 쉽습니다.

<table><tbody><tr><td>DU145 세포</td>, <td>ATCC</td>, <td>HTB-81</td><td></td></tr>, <tr><td>22Rv1 세포</td>, <td>ATCC</td><td>CRL-2505</td><td></td></tr>, <tr><td>Docetaxel</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1148</td><td>, DMSO(10mM)</td></tr><tr><td>, 조직 배양 플라스크, 150cm2</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>6-well 조직 배양 플레이트</td>, <td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신</td></tr><tr><td>파운데이션 B 소 태아 혈청</td><td>제미니</td><td>900208</td><td></td></tr><tr><td>1X 인산염 완충 식염수(PBS)</td> <td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR용 SuperScript III 1차 가닥 합성 시스템</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR 마스터 믹스</td><td>Invitrogen</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>10% 포르말린 용액</td><td></td> qRT-PCR:Life용 <td>Sigma-Aldrich</td> HT501128 <td></td></tr><tr><td>프라이머</td><td> 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACTIN R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

반대로 mitotic 에이전트 docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule 대상 에이전트 (Mta)는 다양 한 종양의 치료에 주류. 그러나, 화학요법 약물에 저항을 획득된 질병 진행의 공통 메커니즘 및 악성 종양의 전조 결정 기능 이다. 전립선 암 (PC), taxane Docetaxel 같은 Mta에 저항 치료 실패 뿐만 아니라 빈약한 예 지 및 높은 사망 율에 의해 정의 된 질병의 치명적인 단계 향해 진행을 지시 한다. 수십 년 동안 공부, 인수 저항에 기여 하는 메커니즘의 배열 완전히 이해 되지 않는다 고 따라서 이러한 고급 단계에 있는 환자를 유익할 수 있던 새로운 치료 전략의 개발에 상당한 제한이 포즈 질병입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 단계의 전립선 암의 치명적인 기능을 모방 하는 메커니즘을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 Docetaxel 내성 전립선 암 세포 라인의 세대는 인수 chemoresistance에 의해 발생. 잠재적인 제한 시간이 지남에, 저항 속성의 손실 등 셀 기반 모델에 내장에 불구 하 고이 메서드에 의해 생성 Docetaxel 저항 셀 라인 성공적으로 최근 연구에서 사용 된 및 발전 기회를 제공 우리의 치명적인 전립선 암에 인수 chemoresistance의 분자 이해.

이 의정서는 Docetaxel 저항 (DR) 전립선 암 세포의 생성으로 이어질 것입니다. 완료에 대 한 타임 라인 프로토콜의 단계 그림 1A 와 그림 1B의 도식 표현에 요약 된 대로 7 개월 4에서 범위 수 있습니다. 시간 투자 수 선택의 셀 라인 및 프로토콜에 설명 된 대로 사용 하는 약물 농도의 범위에 따라 달라 집니다. 중요 한 것은, 각 셀 라인 Docetaxel IC50 농도의 결정 선택 (그림 2A)의 셀에 대 한 프로토콜에서 사용 하 여 농도 범위를 확대 하는 약물의 디자인 수 있습니다. 프로토콜이 시작 되 면 모니터링 프로토콜 제대로 작동 하는 경우를 현미경 아래 다른 시간 지점에서 DU145 및 22Rv1 세포에 초기 Docetaxel 효과 관찰할 수 있습니다. 시간 포인트 Docetaxel 처리 과정을 모니터링 하는 제안: 72 h, 7 일 및 14 일에 대 한 Docetaxel 노출 후 Docetaxel 노출 (초기), 전에. 종양 세포의 단지 소수 민족 Docetaxel 노출 생존과 생성 (그림 2B) 현미경 관찰 될 수 있는 클론 note.
대표적인 식민지 대형 분석 실험 및 보호자의 부 량 그래프와 새로 생성 된 Docetaxel (DR) 내성 세포 그림 3A에서 표시 됩니다. Note 생성된 Docetaxel 내성 세포 약물 농도 부모의 셀 보다 더 높은 최대 1,000-fold 살아남을 수 있습니다.
마지막으로, Docetaxel 저항 표현 형 qRT-PCR (그림 3B)에 의해 유효성 수 있습니다. Note Docetaxel 내성 세포, 부모 세포에 비해 특성 최대-ABCB1 GATA2의 규정과 다운 레 귤 레이 션 CK19 및 CDH1의 표시. 때문에 우리는 이미 실험적으로 우리의 이전 게시 작업 GATA2 upregulation에 두 박사 셀 모델,2829CDH1 함께 CK19의 downregulation이이 유전자는 유효성 검사에 대 한 선정 됐다. ABCB1 유전자 약물 내성 세포18,19upregulated 일관 되도록 다른 사람에 의해 표시 되었습니다 주식 유전자로도 선정 되었다. 그러나, 그것은 문학에 따르면 고 셀 모델와 연구원에 의해 저항 세포 생성을 위해 선택 하는 약물에 따라 다른 유전자를 선택할 수 있습니다 주의 하는 것이 중요.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig1.jpg"> 
그림 1: Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델의 생성에 대 한 타임 라인. (A) Docetaxel 저항 셀 모델의 생성에 대 한 프로토콜 타임 라인의 대표 다이어그램. 그림 묘사 Docetaxel 처리, 유효성 검사 단계 및 각 부분에 필요한 시간. 보호자 및 Docetaxel 방지 셀 (빨간색)에서 72 h에 대 한 표시 Docetaxel 농도와 치료의 기능 식민지 대형 분석 실험을 포함 하는 프로토콜의 유효성 검사 단계 (B) 회로도 표현을 대표 식민지 비율과 qRT-PCR phenotypic 유효성 검사에 대 한 그래프. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig2.jpg"> 
그림 2: Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델 시스템의 생성. (A) 다이어그램 부모의 전립선 암 세포 선 DU145 및 22Rv1에서에서 Docetaxel IC50의 묘사 (프로토콜의 1 단계). 세포 생존 능력 및 복용량 고조 농도 필요 Docetaxel의 예상된 비율 포함 되어 있습니다. 대표 DU145 및 22Rv1 세포 생존 그래프 5를 나타내는 IC50 Docetaxel 노출의 72 h 포함 후로 nM. 실험은 triplicates 및 데이터 DU145의 평균 ± sd (B). 대표적인 밝은 분야 현미경 이미지 나타내고 22Rv1 세포에서 Docetaxel 저항 (프로토콜의 2 단계)의 생성 하는 동안 시간 표시. 빨간색 화살표 프로토콜 완료 Docetaxel 저항 복제를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig3.jpg"> 
그림 3: Docetaxel 저항 셀 모델의 기능 및 phenotypic 특성. (A) 보호자 및 Docetaxel 방지 셀 표시 Docetaxel 농도 72 h. 식민지의 비율에 대 한 모든 치료 농도 포함된 그래프에 표시 됩니다에 대 한 치료의 대표적인 식민지 대형 분석. 실험은 triplicates 및 데이터가 나타내는 sd. 스케일 바 평균 ± 5 mm. (B) 박사/부모의 상대 mRNA 배 증가 = ABCB1의 qRT-PCR에 의해 계량 GATA2, CK19 및 CDH1 표시 됩니다. 말라에 모든 정량 원시 데이터 정규화 (자세한 내용은 프로토콜 참조). 실험은 triplicates 및 데이터 대표 평균 ± sd. * p &lt; 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

암 치료에 저항을 질병의 진행 및 죽음에 기여 한다. 저항의 기계 론 적인 토대를 결정 하는 것입니다 치료 응답을 개선 하기 위한 중요 한. 이 원고 전립선 암 경로 해 부 하기 (PC)의 taxane 저항 셀 모델을 생성 하는 프로토콜 PC 환자에서 Docetaxel 저항 진행에 관련 된 세부 사항.

반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

이 절차의 전반적인 목표는 항유사분열 요법 내성을 유발하는 분자 메커니즘을 연구하기 위한 플랫폼으로 Docetaxel 내성 암세포 실험 모델을 생성하는 것입니다. 이 방법은 질병 진행에 기여하는 신호 전달 경로를 식별하고 잠재적인 표적 전략을 결정하는 것과 같은 암세포 생물학 및 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 환자의 종양 샘플 및 동물 모델을 사용하는 것 외에도 항암 약물 반응을 연구하기 위한 실험 모델을 생성할 수 있는 안정적이고 쉬운 방법이라는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Lisa Mohr와 우리 팀의 또 다른 박사후 연구원인 Jungreem Woo입니다. 이 절차를 시작하려면 20ml의 배지가 들어 있는 150cm 제곱 플라스크에 DU145 또는 22Rv1 세포를 플레이트링합니다. 24시간 후 세포가 약 70-80% 합류할 때 5나노몰에 도세탁셀을 첨가합니다.72시간 후, 약물이 함유된 배지를 흡인하고 새로운 도세탁셀이 없는 배지를 추가합니다. 3-4일마다 미디어를 교체하십시오. 플라스크에 클론이 나타날 때까지 1-2주 동안 기다립니다.배지를 흡인하고 15ml의 PBS로 세포를 조심스럽게 세척한 다음 섭씨 37도에서 3-5분 동안 4ml의 0.05% 트립신-EDTA를 배양하여 플라스크 표면에서 세포를 분리합니다. 그런 다음 8ml의 신선한 배지를 사용하여 플라스크에서 트립신화된 세포를 다시 현탁시킵니다. 처리된 모든 플라스크에서 세포를 추출하고 원심분리로 펠릿화합니다.그런 다음 superna-den을 제거하고 세포 펠릿을 20ml의 신선한 배지에 다시 현탁시키고 150cm 제곱 플라스크에 세포를 플레이트합니다. 24시간 후 세포가 약 70-80% 합류할 때 5나노몰 도세탁셀을 다시 추가합니다. 클론이 플라스크에 나타날 때까지 이전에 표시된 대로 절차를 반복합니다.그런 다음 150cm 제곱 플라스크에 세포를 다시 도금합니다. 24시간 후 세포가 약 70-80% 합류하면 10나노몰 도세탁셀로 치료합니다. Docetaxel 용량 증량 방식으로 동일한 단계를 반복하고 모든 농축 처리 후 살아남은 클론을 계속 풀링합니다.이 과정이 끝나면 실험적으로 사용할 수 있는 내성 세포 풀을 얻을 수 있습니다. 이 절차에서는 6개의 웰 플레이트에서 웰당 2밀리리터의 배지를 사용하여 플레이트 2, 000개의 세포를 플레이트합니다. 24시간 후, DU145 및 22Rv1 세포주 모두에 대해 증가하는 농도의 Docetaxel을 첨가합니다.DMSO는 가장 높은 도세탁셀 용량에 사용되는 것과 동일한 부피의 대조군으로 하나의 웰에만 추가합니다. 72시간 후, 약물이 함유된 배지를 흡인하고 새로운 도세탁셀이 없는 배지를 추가합니다. 현미경으로 집락이 보일 때까지 1-2주 동안 플레이트를 배양합니다.군락을 염색하려면 2-3ml의 PBS로 부드럽게 씻으십시오. 2-3 밀리리터의 크리스탈 바이올렛 용액으로 조직 배양 후드 또는 흄 후드 내부에서 20 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 고인 용액을 제거하고 2-3ml의 물로 플레이트를 씻으십시오.그런 다음 물을 제거하고 플레이트를 자연 건조시킵니다. 그림 표현을 위해 플레이트의 디지털 이미지를 촬영합니다. 우물을 시각화하고 마커 펜을 사용하여 수동으로 군체를 계산하여 결과를 분석합니다.그리고 세포 생존율의 백분율을 그래프로 나타냅니다. 다음은 부모 전립선암 세포주 DU145 및 22Rv1에서 Docetaxel IC50의 측정을 보여주는 다이어그램입니다. 필요한 Docetaxel 용량 증량 농도에서 예상되는 세포 생존율 비율이 여기에 나와 있습니다.다음은 도세탁셀 내성이 생성되는 동안 표시된 시간에 DU145 및 22Rv1 세포의 대표적인 명시야 현미경 이미지입니다. 빨간색 화살표는 프로토콜이 완료된 후의 Docetaxel 내성 클론을 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 Docetaxel-resistant cells functional validation에 해당하는 대표적인 집락 형성 분석법입니다.세포는 증가하는 도세탁셀 농도와 생존율에 노출되어 결정 바이올렛 염색으로 평가되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 약물 내성 세포주를 생성하고 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이 세포주는 유전자 발현 분석 및 유전자 조작과 같은 원하는 검사 및 절차에 사용할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 전립선암의 탁산 내성 세포 모델을 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 모델은 전립선암 환자에서 도세탁셀 내성 진행과 관련된 경로를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

화학저항성 전립선암세포 생성: 약물 저항성 암세포를 체외에서 획득하는 절차

이 동영상은 콜로니 형성 분석을 사용하여 전립선암 세포의 화학 요법 약물 내성을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 암세포에서 화학저항성의 새로운 분자 및 세포 메커니즘을 확인하기 위한 기능적 도구로 사용할 수 있습니다.

기능적 화학저항성 특성화: 클론생성 분석을 사용하여 암세포의 약물 내성을 평가하는 방법

이 비디오에서는 화학요법 약물 내성 암세포에 대한 크리스털 바이올렛 염색 절차를 사용하여 세포 생존율 분석을 시연합니다.

Crystal Violet Staining: Colony Formation Assay를 사용하여 약물 내성 암세포를 시각화하는 기법

인간의 전립선 암이 동 소성 모델에 폐 종양 세포와 구별 전이의 형성을 순환, 종양 크기의 정량을 허용한다. 세포가 일차 장기 탈출해야 같이, 혈류를 입력하고, 보조 사이트에 이식,이 모델은 인간에서 효과적으로 시나리오 되풀이되었습니다.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

전립선암은 미국에서 암 관련 사망의 두 번째로 흔한 원인입니다. 정소성 암 모델은 전립선암의 생물학을 이해하고 치료 요법의 효능을 평가하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 정형소 전립선암 마우스 모델을 확립하는 데 필요한 자세한 단계를 설명합니다.

인간의 전립선 암의 전 임상 동소 이식 쥐 모델

이 논문에서는 도세탁셀 저항성 유방암 세포(MCF-7TXT)에서 미세소관 동적 불안정성을 측정하기 위한 생체 내 방법을 설명하는 프로토콜을 보고합니다. 이 방법에서는 디콘볼루션 현미경 이미징 시스템을 사용하여 표적 세포에서 GFP-튜불린의 발현을 검출합니다.

라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는

이 프로토콜의 목표 후속 거세와 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 설명 하는 것입니다. 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암의 Orthotopic 전 임상 모델은 임상 관련 종양 microenvironment 및 immunocompetent 호스트의 컨텍스트에서 질병 연구에 중요 한.

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

학습하세요 Docetaxel에 내성을 가진 전립선 암 세포 모델을 생성하는 방법을. DU145 또는 22Rv1 세포를 사용하여 약물 내성 메커니즘을 연구하고, crystal violet 염색으로 세포 생존율을 분석합니다. 이 기법은 항암제 반응 연구에 활용됩니다.

반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

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