Name: 장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 장 줄기세포와 틈새 세포를 분류하여 오가노이드를 재구성하는 방법을. Lgr5+ 줄기세포와 Paneth 세포의 유전적·생화학적 변형을 통한 기능 분석이 가능합니다. 이 기술은 세포 특이적 연구에 필수적입니다.

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이 연구 (KWF; 네덜란드 암 학회 로부터 자금에 의해 가능 하 게 되었다 EMCR 2012-5473)와 세계 암 연구 기금 국제 (WCRF; 프로젝트 번호 2014-1181)

모든 절차는 로컬 동물 복지 법률과 지침에 따라 수행 되었다.
1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비
<ol><li>장가 위, 일반가 위, 및 살 균 컨테이너에 집게의 압력솥 1 세트.</li>
	<li>(플랫 바닥) 96 잘 접시 37 ° c.에는 인큐베이터에 배치</li>
	<li>시 약 재료의 테이블에 나열 된 완전 한 문화 매체의 10 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>물 욕조에 37 ° C에서 완전 한 매체를 품 어.</li>
	<li>해 동 한 얼음 양동이에 그것을 배치 하 여 지하실 멤브레인을 재구성 된다. 재구성 된 지하실 막 4 ° C에 액체 될 것입니다.</li>
	<li>인산 염 버퍼 차가운 식 염 수 또는 약식된 PBS (4 ° C)로 4 접시를 채우십시오.</li>
</ol>2입니다. 작은 창 자 지하실의 격리
<ol><li>Lgr5-eGFP IRES 있다t2 마우스 C57BL6/J 배경에 CO2 흡입에 의해 희생. 가 위 쌍 복 경도 해 부.</li>
	<li>집게와 위를 누른 종횡 반으로 잘라.</li>
	<li>이제 장가 위를 사용 하 여, 내장을 꺼내 고 PBS를 포함 하는 페 트리 접시에 놓습니다. 참고: 장가 위는 샤 프와 무딘 팁 있다. 무뚝뚝한 끝이가이 위 소장을 여는 동안 토 굴 모 건축을 손상 하지 의미입니다.</li>
	<li>복 부에 무뚝뚝한 끝을 배치 하 여 시작 하 고 부드럽게는 pylorus 통해 밀어. 여는 위로 절단 하 고 당기는 집게와 함께 진행 합니다.</li>
	<li>일단 전체 소장 경도 열는 집게로 잡고 차가운 PBS에서 그것을 세척 하 고 부드럽게 U 모양 움직임으로 PBS 솔루션에 그것을 씻어.</li>
	<li>모든의 자 나머지는 들어가면 절단 보드, luminal 쪽에 내장을 평평 하 게 진행 합니다. Luminal 측면은 쉽게 인식할 수 있는 혈관의 부재 및 외부 부품과 비교 될 때 창백한 모습.</li>
	<li>유리 슬라이드, 부드럽게 제거는 villi 평평된 내장 된다고 하 여. 이 단계는 조직의 전체 길이 따라 두 번 수행 합니다.</li>
	<li>2-5 밀리미터 조각으로 메 마른 외과 블레이드와 소장을 잘라.</li>
	<li>포함 하는 얼음 차가운 PBS의 10 mL 50 mL 튜브에 작은 창 자 조각 놓습니다.</li>
	<li>PBS에서 그들을 아래로 pipetting으로 모든 남아 있는 불순물을 제거 조직 파편을 청소. 상쾌한 삭제 하 고 PBS 완전히 취소 될 때까지이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>25 ml PBS의 총 최종 볼륨을가지고 15 mL 차가운 PBS를 추가 합니다. 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 추가 하 고 4 ° c.에 롤러에 45 분 동안 품 어</li>
	<li>PBS/EDTA를 삭제 합니다.</li>
	<li>PBS의 10 mL을 추가 하 고 거칠게 pipetting 조직 조각을 아래로 (세 번 이상)는 지하실을 분리. 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>반복 단계 2.13 4 시간. 문화 매체 도달 50 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>원심 (300 x g 5 분)에 의해 셀을 펠 렛.</li>
	<li>문화 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 원심 (80 x g 3 분)으로 지하실을 작은.</li>
</ol>3. 단일 셀 준비
<ol><li>수송과 지하실의 상쾌한 무시 하 고 1 mL의 트립 신 같은-효소 50 µ L 함께 resuspend DNAse (50 µ g/mL).</li>
	<li>2 분 동안 32 ° C에 물 욕조에 셀을 품 어.</li>
	<li>문화 매체의 10 mL를 추가 합니다. 가혹 하 게 아래로 5 번 이상 pipetting으로 단일 셀에는 지하실을 해리.</li>
	<li>40 µ m 여과기 (덩어리 및 기타 불순물 제거)를 통해 솔루션을 필터링 및 5 분에 대 한 300 x g에서 단일 셀을 작은.</li>
</ol>4. flow Cytometry 및 도금
<ol><li>1 x 행 크의 버퍼링 된 소금 솔루션 또는 HBSS/2% 소 태아 혈 청 (FCS) 솔루션 50 mL를 준비 하 고 모든 106 셀 1 mL에 펠 릿 resuspend</li>
	<li>세포 현 탁 액 BV421 린- (CD31, CD45, TER119) 30 분 1: 250 항 체의 농도에서 1: 100, 및 CD24-APC CD117-PE 모두의 농도에 추가 합니다.</li>
	<li>정렬 Lgr5+ 줄기 세포 그리고 Paneth 세포로 별도 낮은 바인딩 튜브. 정렬에 대 한 프로토콜에 대 한 내용은 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포, 보십시오 로스 외. 7 과 Schewe 외. 6<ol>
<li>5 분에 대 한 300 x g에서 정렬된 셀 1.3에서 설명 하는 구성 요소와 100 µ L 매체에 셀 Resuspend 원심 분리기 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>(예를 들어, 화학 또는 유전 수정에 의해) Paneth 세포 치료 (n = 2000) 또는 Lgr5+ 줄기 세포 (n = 2000).<ol>
<li>세포 치료를 사용 하 여 transfection liposome 중재 시 약의 5 µ L 100 µ L 문화 매체와 100의 농도에 작은 간섭 RNA (siRNA)의 총 볼륨에 nM. SiRNA 또는 선택한 수정에 필요한 시간 동안 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>워시 500 µ L 문화 매체에 두 번 셀.</li>
	<li>5 분 x 300g에 centrifuge 고 10 µ L 문화 매체에 셀 resuspend.</li>
	<li>수영장 2 개의 세포 구성 성분 (Paneth 또는 Lgr5+ 세포)는 20 µ l 총 볼륨에 실시간에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>공동은 Paneth 품 어 및 Lgr5+ 셀 실시간에서 10 분</li>
	<li>상쾌한의 10 µ L을 제거 하 고 반드시 셀 펠 릿을 발음 하지 액체의 초승달 모양을 두고.</li>
	<li>40 µ L의 전체 볼륨에 대 한 셀을 재구성된 지하실 막의 30 µ L을 추가 하 고 셀 resuspend는 미리 데워 진 96 잘 접시 접시. 10 분 후 완전 한 매체의 200 µ L 추가 ( 재료의 표참조). 변화 중간 마다 48 h입니다.</li>
	<li>날 5에 organoid 다양성을 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

저자는 경쟁 금융 관심 또는 다른 충돌

오 라는 두 가지 필수 구성 요소 장 줄기 세포 틈새의 즉 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포의 세련 된 기능 분석을 허용 한다. 이 방법은 이전 우리와 다른 사람에 의해 약간의 수정6,,1011를 고용 하고있다. 여기, 재현할 수 및 표준화 된 실험실 프로토콜 또는 프로시저 선물이. 또한, 우리 유전자 구현의 가능성의 예를 들어 Lgr5+ 줄기 세포, Apc downregulation의 효과에 보고 (또는 생화학6) 정렬된 세포 구성 요소에 대 한 수정. 데이터는 siRNA를 표시 하는, 증가 organoid 복합성 (그림 1B)에 의해 표시 된 대로 Apc 의 중...

장 상피 포유류 몸에 있는 가장 빠르게 자기 갱신 조직 그리고, 따라서, 식별 및 크립 트의 하단에는 성인 줄기 세포의 기능적 특성을 겨냥 하는 연구의 과다의 개체 Lieberkühn, Lgr5 유전자의 표현에 의해 갑니다 고 정식 Wnt 신호1의 특히, Lgr5+ 줄기 세포 형벌 이며 전문된 틈새 세포, 즉 Paneth 세포, 또한 그들의 성숙2Wnt 신호에 의존 하는 의해 지원. 함께, 이러한 두 셀 형식 자체-갱신 창 자 상피 안 대기의 기초 및 일일 homeostatic 균형 유지: Lgr5+ 줄기 세포는 급속 하 게 분할 하 고 뿌리를 및 더 많은 전문 장 상피 셀; Paneth 세포 제공 필수 틈새 요인 (예를 들어, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ 줄기 세포2. 장 지하실 때 도금 비보 전 조직과 자체 갱신 구조를 형성 하기 위하여 organoids, 또는 "미니-배 짱", 용량 자체 갱신 등 프로세스에 대 한 통찰력을 제공 하는 실험 도구로 이용 되 고 암4를 포함 하 여 정상 및 병 적인 조건에서 차별화. Organoid 문화 소장, 췌 장, 간, 그리고 신장, 마우스 및 인간의 샘플4에서 포함 하 여 여러 조직에서 설립 되었습니다. 추출 방법 및 성장 요인이 organoid 문화를 개발 하는 조직 및 다중 계보 차별화를 운전 하 고 최대한 원래 줄기 세포 틈새를 모방 하도록 설계 된 vivo에서. Organoids는 유전 질환의 치료, 암에서 치료 효능, 약물 독성의 분석 또는 생체 외에서organogenesis5의 연구의 평가 포함 하 여 잠재적인 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
전반적으로, organoid 문화 조직 샘플에서 설립 하는 때의 주요 제한은 세포 특이성의 부족입니다. 예를 들어 장 organoids 전체 장 지하실에서 설립 조직 소스 내 포함 개별 세포 구성 성분의 분석을 허용 하지 않습니다 (예를 들어, 전체 지하실 포함 Lgr5+, Paneth, 그리고 조상 세포)입니다.
여기, 우리 소설 메서드, 오 라로 그것의 가장 기본적인 구성 요소, 즉 줄기 (Lgr5+)와 틈새 (Paneth) 세포의 기능 분석 장 organoid 문화의 장점을 결합 하 여 설명 합니다. 이 Paneth의 독특한 능력을 통해 이루어집니다 그리고 실제로 공동 인 큐베이 팅 및 organoids2,,610을 때 서로 연관 Lgr5+ 세포. 우리는이 기능 활용 하 고 미리 organoids를 다시 구성 하도록 허용 하기 전에 개별적으로 2 개의 세포 유형 취급. 때 이렇게, 특정된 약물, 성장 인자, 생화학 억제제, 유전자 조작, 또는 재구성 및 organoid 형성 전에 화학적 치료 각 셀 구성 요소를 노출 될 수 있습니다. 따라서, 지금 분석 결과 사용 하 여 특정 약물 치료 또는 유전 수정에 줄기 세포 또는 그들의 틈새에 특정 효과 있는지 여부의 결정을 허용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>최종 농도: 10 mM</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>최종 농도: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>최종 농도: 10 mM</td></tr><tr><td>재조합 쥐 EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>최종 농도: 50ng/ml</td></tr><tr><td>재조합 쥐 Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>최종 농도: 100ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>최종 농도: 10 &마이크로; M</td></tr><tr><td>들쭉날쭉 한 -1 *</td> <td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>최종 농도 : 1 &micro; M</td></tr><tr><td>재조합 쥐 R-spondin *</td><td>R& D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>최종 농도: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube 유전자 용액 siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>최종 농도: 100 nM</td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>102424</tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Low binding tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>코닝</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* 이러한 시약의 조합은 완전한 배양 배지</td><td></td><td></td><td></td>를 구성합니다.</tr></tbody></table>

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

장 상피는 매우 빠른 회전 속도 의해 특징입니다. 포유류에서 전체 상피 안 대기는 4-5 일 이내에 갱신 됩니다. 성인 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 하단에, Lgr5 유전자의 표현에 의해 배정 있으며 그들의 특성 높은 증식 속도1통해 항상성 유지. 작은 창 자에 걸쳐 Lgr5+ 줄기 세포 Paneth 세포 라고 하는 특수 분 비 세포와 혼합 된. Paneth 세포 항균 화합물 (즉, lysozyme과 cryptdins/defensins) 분 비와 창 자 식물에 제어 역할을 발휘. 더 최근에, 소설 함수 Paneth 세포, 즉 그들의 용량을 Wnt3, EGF, 및 Dll12로 몇 가지 주요 ligands 통해 Lgr5+ 줄기 세포 틈새 지원 제공에 대 한 발견 되었습니다.
전 비보 를 격리 하 고 특정 성장 인자와 세포 외 기질 구성 요소 존재 양식, 전체 장 지하실을 일으키 긴와 매우 유사한 크립 트 모 organoids 라는 자체 3D 구조를 갱신 성인 소장3의 상피 아키텍처입니다. Organoid 문화, 전체 지하실에서 설치 될 때 비록 그것의 개별 구성 요소, 즉는 Lgr5+ 의 기여를 해결 하지 않고 자기 갱신의 연구와 장 줄기 세포 틈새의 허용 및 Paneth 세포입니다.
여기, organoid 분석 결과 Paneth의 능력을 활용 하는 새로운 접근 방식을 설명 및 Lgr5+ 연결 하 고 organoids 형성을 셀 때 공동 경작. 이 이렇게, 여기 "organoid 재구성 분석 결과" 라고 (오 라), Paneth 유전 그리고 생 화 확 적인 수정할 수 있게 또는 Lgr5+ organoids로 재구성 뒤 줄기 세포. 따라서, 장 줄기 세포 틈새의 두 가지 주요 구성 요소 기능 분석을 수 있습니다.

Organoid 재구성 분석 결과 Apc 유전자의 작은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 증명 여기 장 상피의 필수 틈새 및 줄기 세포 구성 요소의 별도 기능 분석을 수 있습니다.
이 목표를 달성 하기 위해 우리는 먼저 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 타고 난된 C57BL6/J 쥐에서 8000 Lgr5+ 세포와 6000 Paneth 세포를 분리 하 활용. 그림 1a또는 분석 결과의 순서도 그려져 있습니다. Organoid 재구성 용량 siRNA oligonucleotides Apc 의 mRNA에 대 한 감독과 Lgr5+ 세포를 배양 하 여 평가 되었다 또는 컨트롤로 스크램블된 시퀀스 (SCR)을 포괄....

장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5+)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

오가노이드 재구성 분석의 전반적인 목표는 유전자 또는 생화학적 변형을 통해 Paneth 세포에서 양성인 장 줄기 세포 틈새 Lgr5의 두 가지 주요 구성 요소를 기능 분석한 다음 자가 재생 오가노이드로 재구성하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 줄기세포 및 틈새 세포의 유전적 또는 생화학적 변형과 같은 장 줄기 세포 분야의 주요 특정 질문을 해결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전체 crypt를 사용하는 다른 분석과 달리 분류된 줄기 세포와 틈새 세포를 사용하여 세포 유형 특이적 분석이 가능하다는 것입니다.이 방법의 비디오 시연은 특히 조직 해리 및 세포 처리 단계와 관련하여 매우 중요합니다. 이러한 단계를 제대로 수행하지 않으면 특히 사실 분류 후 세포 생존율이 저하됩니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 C57BL/6J 배경에서 Lgr5 마우스를 준비하고 희생하는 것으로 이 절차를 시작합니다.가위로 복막을 세로로 절개합니다. 집게로 배를 잡고 이 시점부터 장 가위를 사용하여 가로로 반으로 자릅니다. 장을 꺼내 PBS가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오.먼저 뭉툭한 끝을 배에 넣고 유문을 통해 부드럽게 밀어 넣습니다. 가위로 자르고 집게로 잡아당겨 진행합니다. 소장 전체가 세로로 열리면 집게로 잡고 PBS 용액에 U자 모양으로 부드럽게 헹궈 차가운 PBS로 씻습니다.대변 찌꺼기가 모두 제거되면 내강이 위로 향하게 하여 도마에서 장을 평평하게 만듭니다. 내강 쪽은 혈관이 없고 바깥쪽과 비교할 때 창백한 모양으로 쉽게 알아볼 수 있습니다. 유리 슬라이드로 납작한 장을 긁어 융모를 부드럽게 제거합니다.조직의 전체 길이를 따라 단계를 두 번 수행합니다. 그런 다음 멸균 수술용 칼날로 소장을 2-5mm 조각으로 자른다. 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 50ml 튜브에 소장 조각을 넣습니다.조직 조각을 세척하고 PBS에서 위아래로 피펫으로 하여 남아 있는 불순물을 제거합니다. 상층액을 버리고 PBS가 완전히 투명해질 때까지 단계를 반복합니다. 다음으로, 15ml의 차가운 PBS를 추가하여 PBS의 총 최종 부피를 25ml로 만듭니다.2밀리몰 EDTA를 넣고 섭씨 4도의 롤러에서 45분 동안 배양합니다. PBS EDTA를 버린 후 PBS 10ml를 넣고 조직 조각을 위아래로 거칠게 피펫팅하여 crypt를 분리합니다. 그런 다음 상층액을 수집합니다.이 단계를 네 번 반복합니다. 최종 부피 50ml에 도달하기 위해 배양 배지를 추가합니다. 원심분리로 세포를 펠렛화합니다.마지막으로, 원심분리로 크립트를 펠릿화하기 전에 펠릿을 10ml의 배양 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 단일 세포 제제의 경우, 먼저 펠릿화된 소낭선의 상층액을 버리고 50마이크로리터의 DNase와 함께 1ml의 트립신 유사 효소에 재현탁합니다. 세포를 섭씨 32도의 수조에서 2분 동안 배양합니다.10ml의 배양 배지를 첨가한 후 최소 5회 이상 위아래로 거칠게 피펫팅하여 crypt를 단일 세포로 해리합니다. 40미크론 여과기를 통해 용액을 여과하여 덩어리 및 기타 불순물을 제거합니다. 그런 다음 5분 동안 중력의 300배에서 단일 세포를 펠렛화합니다.유세포 분석을 위해 1밀리리터의 X Hank's 완충 염 용액에 펠릿을 100만 개의 세포당 2%의 태아 소 혈청과 함께 재현탁합니다. 세포 현탁액에 계통 마커 CD31, CD45 및 Ter119에 대한 Brilliant Violet 421 표지 항체를 1에서 100의 농도로 추가합니다. 또한 항-CD24 APC 및 항-CD117 PE를 1-250의 농도로 첨가합니다.30분 후, Lgr5 양성 줄기세포와 파네스 세포를 별도의 저결합 튜브로 분류합니다. 분류된 세포를 300배 중력에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 성분을 사용하여 100마이크로리터의 배지에 세포를 재현탁합니다.세포를 처리하려면 100 나노몰 농도의 총 100 마이크로리터 배양 배지 및 소형 간섭 RNA에 5마이크로리터의 리포솜 매개 형질 주입 시약을 사용합니다. 작은 간섭 RNA의 경우 섭씨 37도에서 30분 동안 세포를 배양하거나 선택한 변형에 필요한 시간 동안 세포를 배양합니다. 500 마이크로 리터의 배양 배지에서 세포를 두 번 세척하십시오.5분 동안 300배 중력에서 세포를 원심분리한 후 10마이크로리터의 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 실온에서 5분 동안 300배 중력으로 원심분리하기 전에 두 세포 구성 요소를 총 20마이크로리터 부피로 모읍니다. Paneth와 Lgr5 양성 세포를 실온에서 10분 동안 함께 배양합니다.10마이크로리터의 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 흡인하지 않도록 액체 스키에 그대로 두십시오. 그런 다음 30마이크로리터의 재구성된 기저막을 셀에 추가하여 총 40마이크로리터의 부피를 만듭니다. 세포를 재현탁하고 예열된 96웰 플레이트에 플레이트합니다.10분 후 200마이크로리터의 완전한 배지를 추가합니다. 48시간마다 매체를 교체하십시오. 마지막으로, 5일째에 오가노이드 다중도를 계산합니다.Lgr5 양성 줄기세포에서 쥐 APC 유전자의 작은 간섭 RNA 매개 녹다운과 그에 따른 표준 Wnt/베타-카테닌 신호 전달 경로의 활성화는 처리되지 않은 줄기세포 또는 스크램블 염기서열 대조군과 비교할 때 오가노이드 다중도에 긍정적인 영향을 미칩니다. Wnt 활성화의 구성은 이전에 보고된 바와 같이 Paneth 셀에 대한 요구 사항도 구출합니다. 또한, 이러한 오가노이드는 Paneth-Lgr5 세포 이중항에서 얻은 형태와 비교할 때 APC 돌연변이 또는 Wnt-자극 오가노이드에 대한 잘 설명된 표현형인 속이 빈 구체로 나타납니다.이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 기술을 시도하는 동안 모든 단계와 잠복기를 따르는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 장샘을 추출하고, 단세포 분해물을 준비하고, 틈새 세포와 줄기 세포를 재구성하여 오가노이드를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술은 장 줄기 세포 분야의 연구자들이 쥐의 소장 또는 대장에서 줄기 세포 또는 틈새 세포의 특정 효과를 해부할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법은 장 줄기 세포 틈새의 기능 분석을 위해 확립되었지만, 유선이나 모낭과 같은 다른 체세포 틈새에도 적용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 QPCR 또는 웨스턴 블로팅과 같은 오가노이드에서 게놈 단백질 발현을 분석하기 위한 추가 실험을 수행할 수 있습니다.

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오 프로토콜에서는 1차 장 상피의 오가노이드에서 렌티바이러스 형질전환과 정량적 RT-PCR, RNA-마이크로어레이 및 면역조직화학에 의한 이러한 배양의 처리 및 다운스트림 분석에 대해 단계별로 설명합니다.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와...

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

배우세요 장 줄기세포와 틈새 세포를 분류하여 오가노이드를 재구성하는 방법을. Lgr5+ 줄기세포와 Paneth 세포의 유전적·생화학적 변형을 통한 기능 분석이 가능합니다. 이 기술은 세포 특이적 연구에 필수적입니다.

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

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