큰 볼륨, 비 인간 영장류에서 Optogenetics에 대 한 행동-관련 조명

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인간이 아닌 영장류의 광유전학적 조작에 매우 적합한 대용량 조직 조명기를 만드는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 뇌 영역에 있는 뉴런 집단이 행동에 어떻게 기여하는지, 한 영역에서 시간적으로 특정한 뉴런 발화 패턴이 다른 영역에 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 빛을 사용하므로 조직 손상을 최소화하면서 행동과 관련된 큰 뇌 부피의 광유전학적 조작이 가능하다는 것입니다.

이 기술의 함의는 인간과 비인간 영장류 뇌 사이의 유사성 때문에 중개 의학으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이러한 섬유를 당길 때 적절한 양의 압력을 가하는 데 약간의 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 한 쌍의 날카로운 가위를 사용하여 원하는 총 조명기 길이보다 최소 10cm 더 긴 250마이크로미터 직경의 플라스틱 광섬유 부분을 절단합니다.

그런 다음 15게이지 와이어 스트리퍼를 사용하여 플라스틱 광섬유의 한쪽 끝에서 20-22cm의 폴리에틸렌 재킷을 제거합니다. 그런 다음 섬유의 벗겨진 끝의 가장 가장자리 3-5cm를 테이블 바이스 클램프에 고정합니다. 섬유의 재킷 끝을 한 손으로 팽팽하게 잡고 지속적으로 꾸준히 당깁니다.

섬유는 바닥과 평행해야 하며 바이스에서 당겨야 합니다. 가열 및 냉각 전반에 걸쳐 섬유에 대한 이러한 일정한 장력을 유지하여 섬유가 얇아질 때 곧고 팽팽하게 유지되도록 합니다. 이중 온도 히트 건의 가장 낮은 설정을 사용하여 섬유의 벗겨진 부분을 직경 60-100 마이크로 미터 또는 사람 머리카락 지름 정도로 얇아질 때까지 가열합니다.

섬유가 식도록 하는 동안 섬유에 대한 일정한 장력을 유지하십시오. 장력을 유지하지 못하거나 섬유가 과열되면 섬유가 말리거나 끊어질 수 있습니다. 섬유를 가열할 때 섬유에 일정한 장력을 유지하려면 히트 건을 사용할 때 손을 놓을 필요가 없도록 주로 사용하지 않는 손을 사용하십시오.

또한 손바닥에 섬유를 부드럽게 감아 더 잘 잡을 수 있습니다. 섬유가 완전히 냉각되고 원하는 직경에 도달하면 양쪽의 가장 좁은 지점에서 3cm 떨어진 곳에서 섬유를 꼬집습니다. 섬유의 축을 따라 빠르고 날카롭게 당기면 측면을 분리하여 테이퍼 팁을 만듭니다.

그런 다음 해부 현미경으로 저전력으로 테이퍼 팁을 검사합니다. 팁이 갈라지거나 말려 있으면 섬유를 버리십시오. 많은 연습을 하더라도 섬유의 약 1/3에는 끝이 갈라지거나 말려 있습니다.

우리는 다른 섬유를 뽑는 것이 너무 빠르고 저렴하기 때문에 수리하려고 하지 않고 그 섬유를 버립니다. 원하는 팁 길이를 노출시킨 상태로 팁 끝 근처에 실험실 테이프 조각을 배치하여 테이퍼 팁을 에칭할 준비를 합니다. 여기서 마지막 5mm가 노출됩니다.

테이프는 섬유가 원하는 발광 길이 이상으로 에칭되지 않도록 보호합니다. 그런 다음 엄지와 검지 사이에 5마이크로미터 탄화규소 랩핑 시트의 작은 사각형을 접습니다. 랩핑 시트의 양면 사이에 섬유의 끝을 놓고 작은 원을 그리며 섬유를 부드럽게 에칭합니다.

모든 면이 균일하게 에칭되도록 섬유를 자주 회전시킵니다. 다음으로, 22게이지 와이어 스트리퍼를 사용하여 조명기의 반대쪽 끝에서 약 5mm의 폴리에틸렌 재킷을 제거합니다. 그런 다음 뜨거운 칼로 반대쪽 끝을 평평하게 잘라 표면을 매끄럽게 합니다.

에칭된 팁 반대쪽의 조명기 끝에 커넥터를 부착합니다. 이를 통해 조명기를 광 케이블이나 레이저에 연결할 수 있습니다. 그런 다음 반대쪽 끝을 연속적으로 더 미세한 랩핑 시트로 평평하게 연마합니다.

그런 다음 평평한 반대쪽 끝을 페룰 끝과 같은 높이가 될 때까지 260마이크로미터 내경의 스테인리스강 페룰에 삽입합니다. 반대쪽 끝이 섬유 현미경으로 매끄럽고 균일하게 연마되었는지 육안으로 확인합니다. 페룰의 작은 구멍이 아래를 향하도록 테이블 가장자리에 페룰을 수직으로 테이프로 붙입니다.

그런 다음 1ml 주사기에 플라스틱 에폭시를 채우고 뭉툭한 18게이지 바늘을 주사기에 부착합니다. 그런 다음 바늘을 사용하여 페룰에 에폭시를 도포합니다. 페룰을 에폭시로 완전히 채웁니다.

페룰에 파이버를 삽입하여 페룰 바닥과 같은 높이가 되도록 합니다. 필요한 경우 건조하기 전에 보푸라기가 없는 젖은 물티슈로 섬유의 광택 표면에서 과도한 에폭시를 닦아냅니다. 이 단계에서는 각 테스트 세션 전에 타워 마이크로드라이브를 준비합니다.

그런 다음 비스듬한 팁이 있는 25게이지 가이드 튜브를 드라이브의 하단 클램프에 부착합니다. 상단 cl에 대용량 조명기를 고정합니다.amp 동일한 드라이브에서. 이 clamp 구동 모터에 부착되어 있습니다.

그런 다음 큰 부피의 조명기를 가이드 튜브에 완전히 끼우고 조명기의 끝이 가이드 튜브의 끝을 지나 확장되는지 확인합니다. 또는 실험실 테이프를 광섬유에 적용하여 섬유 자체가 아닌 테이프가 고정되어 섬유를 보호할 수 있습니다. 다음으로, 가이드 튜브와 조명기를 살균을 위한 소독액에 담그십시오.

클린 챔버 내부에 1mm 구멍 간격의 맞춤형 멸균 그리드를 배치하고 챔버 측면에 있는 나사로 미리 지정된 방향으로 고정합니다. 멸균된 무딘 집게를 사용하여 조명기를 위로 당겨 가이드 튜브에서 살균된 조명기를 집어넣습니다. 조명기의 끝은 가이드 튜브의 끝에서 5-10mm 위에 있어야 합니다.

마이크로드라이브를 홀더에 부착하고 가이드 튜브를 대상 그리드 구멍에 넣습니다. 그런 다음 가이드 튜브가 경막 높이를 통과할 때까지 마이크로 드라이브 단계를 내립니다. 동시에 멸균 집게로 조명기를 수동으로 내립니다.

저항이 있으면 조명기를 5-10mm 후퇴시키고 10분 정도 기다렸다가 다시 시도하십시오. 두 번째 시도에서도 여전히 저항이 있으면 조명기 팁을 가이드 튜브에 집어넣고 가이드 튜브를 0.25mm 낮춘 다음 다시 시도하십시오. 조명기의 다른 쪽 끝에 있는 페룰을 더 큰 광학 설정 또는 레이저에 연결합니다.

이 그림은 조명에 따라 오류율이 크게 증가했음을 보여줍니다. 그리고 여기 래스터 플롯은 2.5mm 두께의 피질에 걸쳐 있는 뉴런의 억제를 보여줍니다. 그리고 4.5mm에 걸친 광 아티팩트를 보여주는 국소 자기장 전위.

마스터링되면 이 기술을 사용하여 10-15분 안에 대용량 조명기를 구성할 수 있으며 에폭시 건조 시간도 가능합니다. 보정에는 30분 정도가 더 추가되므로 효율성을 극대화하기 위해 일반적으로 한 번에 여러 개의 조명기를 만듭니다. 이 절차를 수행하는 동안 많은 조명기가 품질 관리 표준을 충족하지 못한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

괜찮아요. 팁 검사에 실패하면 폐기합니다. 그러나 보정에 실패하면 일반적으로 다시 연마하고 보정을 반복합니다.

개발 후 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 광유전학을 사용하여 인간이 아닌 영장류의 신경 세포 발화를 억제하고 행동을 조절할 수 있는 길을 닦는 데 도움이 되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 대용량 조직 조명기를 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.