Name: 큰 볼륨, 비 인간 영장류에서 Optogenetics에 대 한 행동-관련 조명 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 학습하세요 비인간 영장류에서 대용량 조직 침투 조명기를 제작하는 방법을 통해 옵토제네틱스를 활용한 신경과학 연구를 수행하세요. 이 기술은 최소한의 조직 손상으로 행동 관련 뇌 영역을 조작하여 신경 세포 활동과 뇌 기능을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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LCA는 NDSEG 친교, NSF GRFP과 맥 거 번 연구소의 친구 로부터 자금을 인정 합니다. EP는 해리와 유 니스 Nohara UROP 기금, 1995 UROP 기금의 MIT 클래스와 MIT UROP 기금 자금 인정 합니다. ESB는 NIH 2R44NS070453-03A1, IET 하 비 수상 및 뉴욕 줄기 세포 재단-로버트 슨 상 자금 인정 합니다. RD는 NIH EY017292에서 자금을 인정 합니다. 마이클 윌리엄스는 정리 하 고 촬영 전에 공급 수집 팀을도 왔다.

참고: 모든 동물 절차 NIH 지침에 따라 했다 고 하 여 매사 추세 츠 연구소의 기술 위원회 동물 관리에 승인 했다.
 1. 조명 제조 <ol><li>예리한가 위의 쌍을 사용 하 여 250 µ m 직경 플라스틱 광섬유를 적어도 10 cm 길이 보다 긴 경우 원하는 총 조명 기의 부분을 잘라.</li>
	<li>22 게이지 와이어 스 트리 퍼를 사용 하 여 플라스틱 광섬유의 한쪽 끝에서 제거 하는 폴 리 에틸렌 재킷의 15-20 cm.</li>
	<li>테이블 바이스 클램프에 섬유의 벗겨진된 끝의 대부분 3-5 cm는 원심 보안.</li>
	<li>지속적인 꾸준한 당겨 한 손에 긴장 된 섬유의 외피 끝을 개최. 섬유 부에 수직으로 바닥에 평행 해야 합니다. 난방 및 냉각 (단계 1.5 및 1.6 아래) 되도록 섬유 직선과 긴장 된 그것 가겠다고으로 섬유에이 지속적인 긴장 유지.</li>
	<li>듀얼 온도 열 총 (570/1000 ° F), 가장 낮은 설정을 사용 하 여 열 섬유의 제거 섹션 그것은 직경 60-100 μ m, 또는 사람의 모발의 직경에 대 한 박 형까지.</li>
	<li>하면서 냉각 섬유는 섬유에 일정 한 긴장을 유지 합니다. 긴장을 유지 하기 위해 실패 컬 섬유를 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>해 현미경 남았다 팁의 직경을 확인합니다. 또는, 하나는 대신 캘리퍼스를 사용할 수 있습니다.
	<ol><li>섬유 충분히 얇은 경우, 반복 단계 1.4 1.6 통해 원하는 팁 직경을 달성 하는 데 필요한.</li>
		<li>옵션 다시 당기는 경우 작은 마크에 넣어 섬유의 좁은 부분 열 총의 중심 대상 섬유의 좁은 부분을 다시 열 수 것입니다 경우.</li>
		<li>섬유 너무 얇은 경우에, 다시 시작.</li>
	</ol></li> <li>섬유 전체 냉각 하 고 원하는 직경 달성, 양쪽에 섬유 좁은 지점에서 3 cm를 꼬집어. 빠르고와 날카로운 섬유의 축 따라 풀, 테이퍼 팁을 만들 측면을 분리.</li>
	<li>해 부 현미경에 낮은 전력 (예를 들어, 4 X) 아래 테이퍼 팁을 검토합니다. 팁 갈래 ( 그림 1 층) 웅크리고 경우 삭제 섬유.</li>
	<li>테이퍼 팁 떠나는 마지막 5 m m 노출 팁의 끝 근처 랩 테이프의 조각을 배치 하 여 엣지를 준비. 테이프는 빛 방출의 원하는 길이 위에 에칭에서 섬유를 보호합니다. 이 팁 길이 대상 지역에 영장류 피 두께에 따라 선정 되었다. 긴 또는 짧은 길이 조명의 원하는 길이 따라 노출 될 수 있습니다. 랩 테이프의 가장자리 또는 테이퍼 팁에서 가까이 이동 수 다른 엣지 팁 길이 바란다면.</li>
	<li>엄지손가락과 집게손가락 사이 5 μ m 실리콘 카바 이드 연마 시트의 작은 (~ 1 인치 x 2 인치) 광장을 접어. 연마 시트의 두 측면 사이의 섬유의 팁 놓고 엄지와 집게손가락 사이의 BB 롤링 마치 작은 원형의 움직임을 사용 하 여 섬유를 부드럽게 엣지. 모든 측면에 균등 하 게 새겨져 있다 있도록 자주 섬유를 회전 합니다. 섬유 팁 표시 됩니다 &#8220; roughened &#8221; 유엔 에칭 분야는 일반적으로 부드러운 표시 에칭 되어 있다 지역에서 육안으로.</li>
	<li>래핑 시트 3 μ m 알루미늄 산화물과 반복 단계 1.11.</li>
	<li>부착 커넥터 에칭된 팁 반대 조명 기의 끝에. 조명 기는 광 케이블 또는 레이저에 연결할 수 있습니다. 
	참고: 이 방법은 유리를 해결 하기 위한 선호 하는 방법에서 다릅니다 / 깃 봉에서 실리 카 광섬유. 때문에 금속 아무 손상 시킬 수 있습니다 접착 후 섬유와 아무 단위로 연마 플라스틱 광 섬유 보다 더 플라스틱 광섬유 금속 연마 과정에서 생산의 작은 파편으로 평면 죽 습 섬유에 자신을 포함할 수 있습니다.
	<ol><li>22 게이지 와이어 스 트리 퍼를 사용 하 여 조명 기의 반대쪽에서 폴 리 에틸렌 재킷의 약 5mm 제거.</li>
		<li>평면 표면을 반반 하 뜨거운 칼으로 반대쪽 끝을 잘라.</li>
		<li>폴란드어 연속적으로 미세한 lapping와 평면 반대쪽 시트: 0.3 µ m, 1 μ m, 3 μ m, 5 µ m.</li>
		<li>평면 삽입 끝 260 µ m 내부 직경 스테인리스 아무를 플러시는 아무의 끝까지 반대.</li>
		<li>시각적으로 그 반대쪽은 원활 하 고 균일 하 게 연마 섬유 현미경으로 확인.</li>
		<li>는 깃 봉에서 섬유를 제거 하 고 아래로 가리키는 섬유와 테이블의 가장자리에 수직으로 아무 테이프.</li>
		<li>플라스틱 에폭시 1 mL 주사기를 주사기에 무딘 18 게이지 바늘을 첨부.</li>
		<li>바늘을 사용에 아무로 내려 에폭시를 적용 합니다. 에폭시는 아무를 완전히 채워.</li>
		<li>는 아무 섬유 삽입.</li>
		<li>섬유의 광택된 표면에서 어떤 초과 에폭시 젖은 보풀 지우기 필요한 경우 건조 전에 닦아. 그렇지 않으면, 초과 에폭시 12-24 h. 후 제거 될 수 있다</li>
		<li>교정까지 부드럽게 섬유를 저장 하 고 먼지 모자는 아무 장소.</li>
	</ol></li></ol> 2. 조명 보정 및 품질 관리 참고: 교정에 대 한 이러한 방법을 평가 광 섬유의 끝에서 다른 거리에 비선형 출력. 고르지 못한 광 분포에서 일반적으로 결과 &#8220; 울 퉁 불 퉁 &#8221; 또는 &#8220; 물결 모양 &#8221; 테이퍼.
통합 영역을 사용 하 여 호 ( 그림 2)를 흡수 하는 빛의 상단에 대 한 <ol><li>만들기 빛 차폐 막. 
	참고: 흡수 하는 피부를 방지 하기 위해 호 일 처리 빛 빛 반영 얼룩을 만드는에서 오일 때마다 장갑을 착용 한다.
	<li>배 2 <ol>&#8221; 4 &#8221; 자체는 2를 통해 호를 흡수 하는 빛의 조각 &#8221; x 2 &#8221; 광장. 전송 시각: 다른 방법 2를 삭감 하는 &#8221; x 2 &#8221; 측면을 흡수 한 빛과 반영 하는 측면 (즉, 한 빛 광장 표준 알루미늄 호 일의 측면); 그러나, 접이식 메서드는 다음 단계. 횡 경 막 처리에 대 한 무딘 가장자리를 제공 하기 때문에 안전</li> <li>랩 테이프 또는 전기 테이프로 비 접힌 가장자리를 바인딩할 광장의 가장자리를 따라 접. 이 모두 함께 측면을 보유 하 고 날카로운 모서리에서 상처에 대 한 보호.</li>
		<li>26 게이지 바늘을 사용 하 여 사각형의 중심에 구멍을 찌를.</li>
		<li>통합 영역에서 모자에 큰 나사를 제거 하 고 횡 경 막과 개통을 커버. 센터 구멍을 배치 합니다. 막 빛 흡수 한 측면을 반영 하는 하나의 빛으로 만들어진 경우 배치 측면을 흡수 하는 빛 및 통합 분야의 내부를 직면 하 고 아래로 측면을 반영 하는 빛. 
		참고: 통합 영역에 들어가기에서 먼지와 파편을 방지 하 고 중심 구멍을 유지, 보안 연구소 테이프로 통합 분야의 외부에 횡 경 막.</li>
	</ol></li> <li>측정 빛는 micromanipulator 또는 stereotaxic 팔과 통합 영역을 사용 하 여 500 µ m 단위로 팁 따라 출력. 
	참고: 레이저에 때마다 적절 한 파장의 안전 고글을 착용 한다.
	<ol><li>레이저 또는 빛 섬유의 반대쪽 끝을 연결할 소스, 하지만 아직 출력 하는 빛을 트리거하지 않습니다.</li>
		<li>보안 stereotaxic 홀더 (prefe에 조명 기랩 테이프와 rably) 소유자의 하단 아래 7-10 m m 팁.</li>
		<li>나사에 stereotaxic 올리다 stereotaxic 홀더</li>
		<li>는 Illuminator 횡 경 막의 센터에 있는 구멍의 끝을 맞춥니다. 팁은 횡 경 막으로 정확한 동일한 수준 때는 micromanipulator 0.</li>
		<li>차례 방 불 끄고 통합 영역 0.</li>
		<li>트리거 레이저 (또는 다른 광원)와 총 빛 전원 통합 영역을 사용 하 여 출력을 측정. 
		참고: 가능한 가장 낮은 광 출력을 사용 하 여 교정 테스트.</li>
		<li>통합 영역 및 반복 단계 2.2.6에 섬유 500 µ m 낮은.</li>
		<li>계속 통합 영역으로 섬유를 낮추는 총 빛 전력 레벨에서 500 µ m 단위로 총 광 출력 측정 
		주의: 일단 전체 팁 영역에 총 빛 전원 수준 한다. 낮은 섬유를 계속 하지 않습니다에 에칭 넘어 1-2 m m 이상 길이 팁. 팁 통합 영역 하단의 연락처, 그것 수 있습니다 녹아 및/또는 통합 영역을 망치.</li>
	</ol></li> <li>총 빛 전원으로 얼마나 섬유의 함수는 선형성을 확인 통합 영역으로 하향 조정 되어 출력을 그려서 균등 하 게 에칭된 섬유 확인.</li></ol>
 3. Vivo에서 조명
 참고: 여기, 이러한 방법은 비 인간 영장류 보다는 플라스틱 모델을 사용 하 여 표시 됩니다.
<ol><li>임 플 란 트 25 m m 직경 녹음 실 실험 전에 관심의 뇌 영역에 이식 했다.</li>
	<li>실험 전에 해 부 자기 공명 영상 (MRI)을 수행합니다. 챔버에는 사용자 지정 녹음 그리드를 배치 하 고 메 마른 외과 윤활제 그리드 시각화 및 경질 대상 뇌 구조의 수준 결정에 대 한 수 있도록 그것을 채울.</li>
	<li>각 테스트 세션 전에 타워 마이크로 드라이브를 준비합니다.
	<ol><li>부착 드라이브에 중간과 더 낮은 경사진 팁 25 게이지 가이드 튜브 클램프. 두 개의 클램프는 가이드 튜브에 똑바로 되도록 하는 데 사용 됩니다. 원하는 경우 이러한 클램프의 둘 다 수동으로 이동할 수 있습니다. 
		참고: 가이드 튜브 epoxied 되거나 납땜 하는 클램프.</li>
		<li>같은 드라이브에 위 클램프에 큰 볼륨 조명 기를 보호합니다. 이 클램프는 드라이브 모터에 연결 된.</li>
		<li>가이드 튜브를 통해 대규모 조명 기를 완벽 하 게 스레드 및는 조명 기의 팁 가이드 튜브의 끝 지나서 확장 확인. 
		참고: 가이드 튜브의 끝으로 경질에서 대상 뇌 영역의 아래쪽 여백 까지의 거리와 과거를 확장 하는 조명 기의 길이 통해 MRI 결정.</li>
		<li>가이드 튜브 및 조명 (예, chlorohexidine) 소독 살 균 솔루션에 담가.</li>
	</ol></li> <li>깨끗 한 챔버 내부 사용자 지정 소독된 그리드를 배치 하 고 챔버 측면 나사와 미리 지정 된 방향에서 그것을 확보. 여기에 표시 된 눈금은 1mm 간격; 그러나, 간격 사용자 정의할 수 있습니다 필요에 따라. 
	참고: 이 그리드와 해 부 MRI에서 사용 하는 방향에 동일 해야 합니다.</li>
	<li>미리 정해진된 방향으로 녹음 실에서 정위 적 마이크로 드라이브 홀더 보안.</li>
	<li>살 균, 무뚝뚝한 겸 자 사용 하 여 조명 기를 당겨 가이드 튜브에서 조명 하는 소독된 기를 철회. 조명 기의 팁 가이드 튜브의 끝 위에 5-10 m m 이어야 한다. 
	참고: 조명 가이드 튜브 클램프 사이 바깥쪽으로 인사 합니다. 이 유연한 조명 기를 손상 하지 것입니다.</li>
	<li>마이크로 드라이브는 홀더를 부착 하 고 가이드 튜브 대상 그리드 구멍.</li>
	<li>낮은 마이크로 드라이브 단계 가이드 튜브는 경질의 수준을 통해 때까지. 
	참고: 전극 두 번째 마이크로 드라이브를 스테이지에 배치 하 고 다른 그리드 구멍으로 낮 췄 다 수 있습니다. 이 전극에 잠재적인 로컬 필드 거리 의존 빛 유물, 조명 배치를 확인 하는 데 사용할 수 있습니다 표시 됩니다.</li>
	<li>시도 낮은 조명 기는 수동으로 멸 균 포 셉와 함께.
	<ol><li>어떤 저항 든 지 있는 경우에, 철회는 조명 기 5-10 mm, 조직 정착 하 고 다시 시도 하십시오 수 있도록 10 분을 기다립니다.</li>
		<li>여전히 저항에 경우 두 번째 시도, 접어 야 조명 팁 가이드 튜브, 낮은 가이드 0.25 m m, 튜브 하 고 다시 시도 하십시오.</li>
		<li>어떤 저항 없이 가이드 튜브를 통해 조명 기 슬라이드 때까지 반복.</li>
		<li>낮은 조명 기는 긴장 된 때까지. 
		주의: 강력히 저항에 대 한 조명 기를 밀어 하지 않습니다. 이러한 경우에 가이드 튜브 일반적으로 하지 관통 경질 완전히. 두뇌를 입력 하 고 팁 ( 그림 1 g)를 파괴 하는 가능 하 게 섬유를 방지 자체에 벤드를 하면 섬유를 강력히 추진.</li>
	</ol></li> <li>큰 광학 설정 또는 레이저에는 조명 기의 다른 끝에 아무 연결.</li>
	<li>확인 빛 비 인간 영장류에 게 표시 됩니다.
	<ol><li>블랙 아웃 차폐 하거나 빛을 흡수 하는 완전히 녹음 타워를 포괄 하는 호 일.</li>
		<li>호 일을 흡수 하는 빛의 만든 차폐 봉투에 모든 광학 연결 장소.</li>
		<li>방패 모든 패치 케이블 중 빛을 흡수 하는 포 일 또는 검은 전기 테이프.</li>
		<li>추가 조치로 비 인간 영장류 뒤에 실험에 사용 되는 동일한 빛 색의 미끼 발광 다이오드 (LED) 은행 놓고 2.5 Hz에서 지속적으로 Led 플래시. 이 어둠에 완전히 조정에서 눈을 방지 합니다. 만약 실수로 빛 누설 했다,이 번쩍이는 빛 행동 방 아 쇠로 봉사에서 누설을 방지 하기 위해 도움이 될.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Optogenetic 도구는 널리 질병 및 설치류에서 생리학을 공부 하는 데 사용 됩니다, 하지만 계몽 큰 두뇌 볼륨의 기술적 도전 비 인간 영장류에서 optogenetics의 사용을 제한 했다. 아마도 작은 볼륨을 밝히는 큰 빛 전원 밀도 (~ 100 mW/m m2 ~ 20 W/m m2)를 사용 하는 원숭이 연구 개척 &#60; 1 m m3, 그리고 피4, 흥분 성의 opsins 겸손 한 행동 효과 보고 9,,1011 과 우량한 colliculus12금지 opsin.
따라서, 대규모 조명 빛 배달 큰 조직 볼륨에 수 있도록 개발 되었다. 이 조명 기...

밀리초 정밀, 빛 기반 신경 제어를 허용 하는 Optogenetic 도구 기능 생리학 및 설치류 및 무척 추 동물 행동 연구에 널리 사용 됩니다. 그러나, 기술 과제는 설치류 뇌 1보다 큰 x 볼륨 ~ 100 비 인간 영장류 뇌에서 optogenetics의 사용을 제한 했다.
비 인간 영장류에서 optogenetics 연구를 촉진 하는 조명 기 두 경쟁 목표를 해결 하도록 설계 되었습니다: 큰 볼륨 조명 및 최소한의 침투 손상. 이러한 우려 중 하나는 주소 이전 하려고 다른 비싼에 왔습니다. 번들 섬유 조명 더 큰 볼륨의 하지만 증가 직경, 및, 따라서, 손상2,3. 테이퍼 유리 섬유 하지만 좁게 초점 빛을 발광 표면 침투 손상을 감소 &#60; 100 µ m2 4,5. 외부 뇌 경질에 창문을 통해 침투 손상의 도전 circumvents 조명과 큰 볼륨 조명, 대 한 수 있지만 몇 가지 피상적인 뇌 분야6만 사용할 수 있습니다.
대규모, 작은 직경 조명 (그림 1a)를 만들려면 플라스틱 광 섬유 열 테이퍼 이며 코어와 클 래 딩의 팁 에칭 (그림 1bc). 좁은 지점에 빛을 집중 하는 다른 테이퍼 섬유, 달리는 에칭 팁, 따라서, (그림 1의 de) 큰 영역 빛을 광범위 하 게 배포 하는 방법의 측면에 밖으로 균등 하 게 탈출 하는 빛을 수 있습니다. 때문에 침투 손상을 침투 직경에 비례,이 조명 기는 기존의 섬유 보다 더 침투 손상 아직 그것은 &#62; 발광 표면 영역 및 제공 빛 더 광범위 하 게 1 x 100/100 빛 전원 뇌 팬텀 (1.75 %agarose)의 밀도 (그림 1e). 몬테 카를로 모델 (그림 1 층) 그들은 그들의 발광 표면으로 동등한 빛 전원 밀도가지고 기존의 섬유와 대용량 조명 빛 확산에 차이 보여 줍니다. 각 조명 기는 개별적으로 (그림 2a, b) 팁 (그림 2c) 따라도 빛을 분배를 보장 하기 위해 통합 영역을 사용 하 여 보정 됩니다.
이 큰 볼륨 조명 기는 optogenetic 조작 동작 및 비 인간 영장류에 신경 발포의 유효성이 검증 되었습니다. 어떤 뇌 영역을 각 동물의 개별 수용 필드 지도 섬유 팁 길이 사용자 지정할 수 있습니다. 조명 조명의 길이 걸쳐 있는 신경 녹음에 대 한 관통 전극와 쌍 수 있습니다. 또한, 섬유는 가시 광선의 색상을 가져올 수 있다, 때문에 그것은 사용할 수 사용 가능한 optogenetic 분자의와 결합 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>플라스틱 광섬유</td><td>산업용 광섬유</td><td>SK-10</td><td>250 미크론 직경, Super Eska 라인</td></tr><tr><td>와이어 스트리퍼</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>22 게이지</td></tr><tr><td>바이스 클램프</td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>일반 테이블 마운트 바이스 클램프</td></tr><tr><td>이중 온도 히트 건</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1,000 &deg; F</td></tr><tr><td>Lab marker</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>실체 현미경 w/ 이중 백열등, 2X/4X 배율, VWR</td></tr><tr><td>Lab 테이프</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>보라색 4팩 그러나, 테이프 색상은 중요하지 않습니다</td></tr><tr><td>. 실리콘 카바이드 래핑 시트</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>5 마이크론 그릿, 10팩</td></tr><tr><td>알루미늄 산화물 래핑 시트</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>3 미크론 그릿, 10 팩</td></tr><tr><td>알루미늄 산화물 랩핑&nbsp; 시트</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>1 미크론 그릿, 10 팩</td></tr><tr><td>소성 알루미나 래핑 시트</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>0.3 미크론 그릿, 10 팩</td></tr><tr><td>핫 나이프</td><td>산업용 광섬유</td><td>IF370012</td><td>60 와트, 헤비 듀티</td></tr><tr><td>섬유 검사 범위</td><td>ThorLabs</td><td>FS201</td><td>옵션</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 페룰</td><td>정밀 광섬유</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>265 미크론 내경</td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>Luer-lok 팁은 누출 위험을 줄이기 위해 바람직하지만 반드시 필요한 것은 아닙니다</td></tr><tr><td>플라스틱 에폭시</td><td>산업용 광섬유</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>18 게이지 무딘 바늘</td><td>BD</td><td>305180</td><td>1.5 인치 길이</td></tr><tr><td>린트없는 닦음 (KimWipe)</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td>는 <td>많은 공급업체에서 사용 가능합니다</td></tr>. <tr><td>빛 흡수 호일</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>전기 테이프</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>선택 사항, 다른 브랜드 / 모델을 대체할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>26 게이지 날카로운 바늘&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>0.5 인치 길이</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td>는 <td>다른 브랜드/모델로 대체될 수 있습니다</td></tr><tr><td>Steretactic arm</td><td>Kopf</td><td>1460</td>은 <td>다른 브랜드/모델로 대체될 수 있습니다</td></tr><tr><td>레이저 보안경</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>는 사용된 레이저의 색상에 따라 선택해야 합니다. 여기에 주어진 예시</td></tr><tr><td>레이저 또는 기타 광원</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>블루 레이저의 예</td></tr><tr><td>통합 구</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>첨부 파워 미터, ThorLabs에서도 사용 가능, 항목</td></tr><tr><td>#PM100D Ultem 녹음 챔버</td><td>Crist instrument company</td><td>6-ICO-J0</td><td>맞춤 정렬 노치</td></tr><tr><td>타워 마이크로 드라이브 클램프</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>가이드 튜브</td><td>사용자 정의</td><td>N / A</td><td>25 게이지 척추 바늘 (BD) 또는 무딘 튜브로 제작</td></tr><tr><td>NAN 드라이버 시스템</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 그리드 디자인</td><td>요청 시 맞춤형</td><td></td><td>계획 가능</td></tr><tr><td>Blunt 집게</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>일반 스테인리스 스틸 무딘 집게</td></tr><tr><td>디지털 캘리퍼스</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>amazon.com 에서 사용할 수 있습니다. 보다 정확한 측정을 위해 더 미세한 해상도의 캘리퍼를 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>패치 케이블</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>이것은 가능한 많은 패치 케이블 중 하나의 예입니다. 광섬유 직경이 대용량 조명기의 광섬유 직경보다 작거나 같고 커넥터가 인터페이스하는 한, 모든 패치 케이블(유리 또는 플라스틱, 공급업체에서 구매 또는 실험실에서 제작)은 이 애플리케이션에 적합합니다.</td></tr><tr><td>투명 플라스틱 더스트 캡</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>패키지 25</td></tr><tr><td>세라믹 분할 결합 슬리브</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>에스엠-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

큰 볼륨, 비 인간 영장류에서 optogenetics에 대 한 행동-관련 조명

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

이 프로토콜 비 인간 영장류 뇌에서 optogenetic 조작에 대 한 개발 된 대규모 조명 기를 설명 합니다. 조명 기는 에칭 팁, 수정 된 플라스틱 광섬유 발광 표면적은 &#62; 100 종래의 섬유의 x. 큰 볼륨 조명 기의 건설을 설명, 뿐만 아니라이 프로토콜도 빛을 분배를 보장 하는 데 사용 하는 품질 관리 교정을 자세히 설명 합니다. 또한,이 프로토콜 삽입 하 고 제거 하는 큰 볼륨 조명에 대 한 기술을 설명 합니다. 표면 기도 하 고 깊은 구조를 조명 수 있습니다. 이 큰 볼륨 조명 기, 전극에 물리적으로 결합 될 필요는 없습니다 그리고 플라스틱, 유리 하지는 조명 때문에 그것은 것입니다 단순히 구 부 상황에서 전통적인 광학 섬유 깨지는 것 이다 때. 이 조명 기는 기존의 광섬유 보다 큰 침투 손상으로 행동-관련 조직 볼륨 (≈ 10 m m3) 빛을 제공 한다, 때문에 그것은 비 인간 영장류에서 optogenetics를 사용 하 여 행동 연구를 촉진 한다.

비 인간 영장류에서 큰 두뇌 볼륨의 조명 행동-관련 optogenetic 조작 가능합니다. 애 커 외. 레드 이동 Halorhodopsin, 턱 7 두 붉은 털 원숭이에 메모리 기반 saccades 정면 눈 분야 (들)의 임시 기여 공부 하 (2016) 사용이 큰 볼륨 조명 기. 특히, 들 신경 턱을 포함 하는 바이러스 성 벡터와 주입 되었고 대상 프레 젠 테이 션, 지연 기간 또는 메모리 기반 saccade 작업의 모터 준비 기간 동안 큰 볼륨 조명 기를 사용 하 여 붉은 빛으로 조명 8. 그림 3 은 실험 조건. (예를 들어, 적절 한 대상 위치로 saccades 메모리 기반 실행 실패) 오류 요금 크게 조명 주입된 받아들이는 필드에 대상에 대 한 하지만 하지 비활성화의 사이트에 반대는 목표에 대 한 증가 / 조명 (그...

최소한의 직경이 큰 볼륨에 빛을 전달 하기 위한 조직 침투 조명 기 구축 프로토콜 제공 됩니다.

큰 볼륨, 비 인간 영장류에서 Optogenetics에 대 한 행동-관련 조명

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인간이 아닌 영장류의 광유전학적 조작에 매우 적합한 대용량 조직 조명기를 만드는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 뇌 영역에 있는 뉴런 집단이 행동에 어떻게 기여하는지, 한 영역에서 시간적으로 특정한 뉴런 발화 패턴이 다른 영역에 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 빛을 사용하므로 조직 손상을 최소화하면서 행동과 관련된 큰 뇌 부피의 광유전학적 조작이 가능하다는 것입니다.이 기술의 함의는 인간과 비인간 영장류 뇌 사이의 유사성 때문에 중개 의학으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이러한 섬유를 당길 때 적절한 양의 압력을 가하는 데 약간의 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 한 쌍의 날카로운 가위를 사용하여 원하는 총 조명기 길이보다 최소 10cm 더 긴 250마이크로미터 직경의 플라스틱 광섬유 부분을 절단합니다.그런 다음 15게이지 와이어 스트리퍼를 사용하여 플라스틱 광섬유의 한쪽 끝에서 20-22cm의 폴리에틸렌 재킷을 제거합니다. 그런 다음 섬유의 벗겨진 끝의 가장 가장자리 3-5cm를 테이블 바이스 클램프에 고정합니다. 섬유의 재킷 끝을 한 손으로 팽팽하게 잡고 지속적으로 꾸준히 당깁니다.섬유는 바닥과 평행해야 하며 바이스에서 당겨야 합니다. 가열 및 냉각 전반에 걸쳐 섬유에 대한 이러한 일정한 장력을 유지하여 섬유가 얇아질 때 곧고 팽팽하게 유지되도록 합니다. 이중 온도 히트 건의 가장 낮은 설정을 사용하여 섬유의 벗겨진 부분을 직경 60-100 마이크로 미터 또는 사람 머리카락 지름 정도로 얇아질 때까지 가열합니다.섬유가 식도록 하는 동안 섬유에 대한 일정한 장력을 유지하십시오. 장력을 유지하지 못하거나 섬유가 과열되면 섬유가 말리거나 끊어질 수 있습니다. 섬유를 가열할 때 섬유에 일정한 장력을 유지하려면 히트 건을 사용할 때 손을 놓을 필요가 없도록 주로 사용하지 않는 손을 사용하십시오.또한 손바닥에 섬유를 부드럽게 감아 더 잘 잡을 수 있습니다. 섬유가 완전히 냉각되고 원하는 직경에 도달하면 양쪽의 가장 좁은 지점에서 3cm 떨어진 곳에서 섬유를 꼬집습니다. 섬유의 축을 따라 빠르고 날카롭게 당기면 측면을 분리하여 테이퍼 팁을 만듭니다.그런 다음 해부 현미경으로 저전력으로 테이퍼 팁을 검사합니다. 팁이 갈라지거나 말려 있으면 섬유를 버리십시오. 많은 연습을 하더라도 섬유의 약 1/3에는 끝이 갈라지거나 말려 있습니다.우리는 다른 섬유를 뽑는 것이 너무 빠르고 저렴하기 때문에 수리하려고 하지 않고 그 섬유를 버립니다. 원하는 팁 길이를 노출시킨 상태로 팁 끝 근처에 실험실 테이프 조각을 배치하여 테이퍼 팁을 에칭할 준비를 합니다. 여기서 마지막 5mm가 노출됩니다.테이프는 섬유가 원하는 발광 길이 이상으로 에칭되지 않도록 보호합니다. 그런 다음 엄지와 검지 사이에 5마이크로미터 탄화규소 랩핑 시트의 작은 사각형을 접습니다. 랩핑 시트의 양면 사이에 섬유의 끝을 놓고 작은 원을 그리며 섬유를 부드럽게 에칭합니다.모든 면이 균일하게 에칭되도록 섬유를 자주 회전시킵니다. 다음으로, 22게이지 와이어 스트리퍼를 사용하여 조명기의 반대쪽 끝에서 약 5mm의 폴리에틸렌 재킷을 제거합니다. 그런 다음 뜨거운 칼로 반대쪽 끝을 평평하게 잘라 표면을 매끄럽게 합니다.에칭된 팁 반대쪽의 조명기 끝에 커넥터를 부착합니다. 이를 통해 조명기를 광 케이블이나 레이저에 연결할 수 있습니다. 그런 다음 반대쪽 끝을 연속적으로 더 미세한 랩핑 시트로 평평하게 연마합니다.그런 다음 평평한 반대쪽 끝을 페룰 끝과 같은 높이가 될 때까지 260마이크로미터 내경의 스테인리스강 페룰에 삽입합니다. 반대쪽 끝이 섬유 현미경으로 매끄럽고 균일하게 연마되었는지 육안으로 확인합니다. 페룰의 작은 구멍이 아래를 향하도록 테이블 가장자리에 페룰을 수직으로 테이프로 붙입니다.그런 다음 1ml 주사기에 플라스틱 에폭시를 채우고 뭉툭한 18게이지 바늘을 주사기에 부착합니다. 그런 다음 바늘을 사용하여 페룰에 에폭시를 도포합니다. 페룰을 에폭시로 완전히 채웁니다.페룰에 파이버를 삽입하여 페룰 바닥과 같은 높이가 되도록 합니다. 필요한 경우 건조하기 전에 보푸라기가 없는 젖은 물티슈로 섬유의 광택 표면에서 과도한 에폭시를 닦아냅니다. 이 단계에서는 각 테스트 세션 전에 타워 마이크로드라이브를 준비합니다.그런 다음 비스듬한 팁이 있는 25게이지 가이드 튜브를 드라이브의 하단 클램프에 부착합니다. 상단 cl에 대용량 조명기를 고정합니다.amp 동일한 드라이브에서. 이 clamp 구동 모터에 부착되어 있습니다.그런 다음 큰 부피의 조명기를 가이드 튜브에 완전히 끼우고 조명기의 끝이 가이드 튜브의 끝을 지나 확장되는지 확인합니다. 또는 실험실 테이프를 광섬유에 적용하여 섬유 자체가 아닌 테이프가 고정되어 섬유를 보호할 수 있습니다. 다음으로, 가이드 튜브와 조명기를 살균을 위한 소독액에 담그십시오.클린 챔버 내부에 1mm 구멍 간격의 맞춤형 멸균 그리드를 배치하고 챔버 측면에 있는 나사로 미리 지정된 방향으로 고정합니다. 멸균된 무딘 집게를 사용하여 조명기를 위로 당겨 가이드 튜브에서 살균된 조명기를 집어넣습니다. 조명기의 끝은 가이드 튜브의 끝에서 5-10mm 위에 있어야 합니다.마이크로드라이브를 홀더에 부착하고 가이드 튜브를 대상 그리드 구멍에 넣습니다. 그런 다음 가이드 튜브가 경막 높이를 통과할 때까지 마이크로 드라이브 단계를 내립니다. 동시에 멸균 집게로 조명기를 수동으로 내립니다.저항이 있으면 조명기를 5-10mm 후퇴시키고 10분 정도 기다렸다가 다시 시도하십시오. 두 번째 시도에서도 여전히 저항이 있으면 조명기 팁을 가이드 튜브에 집어넣고 가이드 튜브를 0.25mm 낮춘 다음 다시 시도하십시오. 조명기의 다른 쪽 끝에 있는 페룰을 더 큰 광학 설정 또는 레이저에 연결합니다.이 그림은 조명에 따라 오류율이 크게 증가했음을 보여줍니다. 그리고 여기 래스터 플롯은 2.5mm 두께의 피질에 걸쳐 있는 뉴런의 억제를 보여줍니다. 그리고 4.5mm에 걸친 광 아티팩트를 보여주는 국소 자기장 전위.마스터링되면 이 기술을 사용하여 10-15분 안에 대용량 조명기를 구성할 수 있으며 에폭시 건조 시간도 가능합니다. 보정에는 30분 정도가 더 추가되므로 효율성을 극대화하기 위해 일반적으로 한 번에 여러 개의 조명기를 만듭니다. 이 절차를 수행하는 동안 많은 조명기가 품질 관리 표준을 충족하지 못한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.괜찮아요. 팁 검사에 실패하면 폐기합니다. 그러나 보정에 실패하면 일반적으로 다시 연마하고 보정을 반복합니다.개발 후 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 광유전학을 사용하여 인간이 아닌 영장류의 신경 세포 발화를 억제하고 행동을 조절할 수 있는 길을 닦는 데 도움이 되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 대용량 조직 조명기를 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

large-volume-behaviorally-relevant-illumination-for-optogenetics-non

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

후각 망울의 성인에서 태어난 뉴런은 optogenetically Channelrhodopsin2 - 표현 이식 미니어처와 함께 주동이의 철새 스트림과 만성 photostimulation에서 lentiviral 주사를 LED를 사용하여 조절할 수 있습니다.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

여기에서는 마취된 마우스 피질에서 확인된 억제성 중간뉴런으로부터 안정적이고 잘 격리된 단일 단위 기록을 얻기 위한 전략을 설명합니다. ChR2를 발현하는 뉴런은 청색광에 대한 반응으로 식별됩니다. 이 방법은 표준 세포 외 기록 장비를 사용하며 칼슘 이미징 또는 시각적 유도 패치에 대한 저렴한 대안으로 사용됩니다.

에 가이드 생체 단일 단위 기록

이 프로토콜은 광유전학적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 성공적으로 수행하는 데 필요한 단계와 데이터 분석을 설명합니다. ofMRI는 고자기장 fMRI 판독과 광유전학적 자극을 결합한 새로운 기술로, 살아있는 뇌 전체에 걸쳐 기능적 신경 회로와 그 역학의 세포 유형별 매핑을 가능하게 합니다.

Optogenetic 기능 MRI

여기에서, 우리는 마카크 두뇌에 있는 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적 표현을 달성하기 위한 효율적이고 간단한 접근으로 피질로 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도된 대류 강화한 납품 (CED)를 보여줍니다.

대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

아래에 설명된 방법은 3차원(3D) 프린팅 방법과 MRI 데이터 추출의 새로운 조합을 사용하여 비인간 영장류(NHP) 신경외과의 제조를 위한 포괄적인 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

비인간 영장류의 신경 외과 계획을위한 MRI 기반 도구 상자

현재 시행 된 바와 같이, 인간이 아닌 영장류의 광유전학은 바이러스 벡터를 뇌에 주입해야합니다. 최적의 주입 방법은 신뢰할 수 있어야 하며 많은 응용 분야에서 사후 조직학에서 쉽고 명확하게 식별되는 임의의 깊이의 개별 부위를 표적으로 삼을 수 있어야 합니다. 이러한 특성을 갖는 주입 방법이 제시된다.

마취 및 깨어 있는 행동하는 비인간 영장류 뇌에서 광유전학을 위한 AAV 벡터 주사

생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

이 논문은 자기공명영상(MRI) 스캔을 기반으로 한 비인간 영장류 신경외과 계획을 위한 자동화된 프로세스를 간략하게 설명합니다. 이러한 기술은 프로그래밍 및 설계 플랫폼의 절차적 단계를 사용하여 NHP를 위한 맞춤형 임플란트 설계를 지원합니다. 그런 다음 3차원(3D) 프린팅된 실물 크기 해부학 모델을 사용하여 각 구성 요소의 유효성을 확인할 수 있습니다.

비인간 영장류를 위한 신경 임플란트 설계 툴박스

학습하세요 비인간 영장류에서 대용량 조직 침투 조명기를 제작하는 방법을 통해 옵토제네틱스를 활용한 신경과학 연구를 수행하세요. 이 기술은 최소한의 조직 손상으로 행동 관련 뇌 영역을 조작하여 신경 세포 활동과 뇌 기능을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

큰 볼륨, 비 인간 영장류에서 Optogenetics에 대 한 행동-관련 조명

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