제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

이 비디오의 전반적인 목표는 경내피 또는 경상피 전기 저항 측정 또는 TEER 측정을 위해 전극이 통합된 마이크로 유체 칩을 제작하고 사용하는 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 마이크로 유체 칩의 혈액 뇌 장벽을 사용하여 입증됩니다. 이 방법은 예를 들어 통합 전극을 사용하여 혈액-뇌 장벽 조직의 장벽 기능을 직접 측정할 수 있도록 함으로써 Organs-on-Chips 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

우리 기술의 주요 장점은 전극이 장기 칩 시스템에 쉽게 통합되고 그 결과를 서로 다른 시스템 간에 비교할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 건강 및 질병, 신약 개발 및 개인 맞춤형 의학에서 혈액 뇌 장벽 기능을 이해하는 데로 확장됩니다. 이 방법은 혈액-뇌 장벽 기능에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 Lung-on-Chip 및 Gut-on-Chip과 같은 다른 장기 칩 시스템의 맥락에서도 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 PDMS 기제 27g과 경화제 2.7g을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 약 45분 동안 건조제에서 혼합물의 가스를 제거하여 기포를 제거합니다. 한편, 금형 주위에 투명 테이프를 붙여 액체 PDMS 혼합물을 위한 금형을 준비하거나 금형을 적절한 웨이퍼 홀더에 넣습니다.

가스가 제거된 PDMS 혼합물을 금형에 붓습니다. 다음으로, PDMS 혼합물을 섭씨 60도의 오븐에서 4시간 동안 경화시키고 나중에 식힙니다. 교차 흐름 후드에서 경화된 PDMS를 금형에서 당겨 빼냅니다.

PDMS의 절단선을 사용하여 PDMS 복제본을 별도의 상단 및 하단 칩 부품으로 절단합니다. 그런 다음 직경 1mm의 날카로운 생검 펀치를 사용하여 상단 부분에 4개의 구멍을 뚫어 입구와 출구를 만듭니다. PDMS 파편이 칩에 모이는 것을 방지하기 위해 내부에서 외부로 펀치를 날립니다.

그런 다음 칩 부품을 투명 테이프로 덮어 먼지로부터 보호하십시오. 그런 다음 트랜스웰 인서트의 폴리카보네이트 멤브레인을 약 3 x 3제곱밀리미터의 정사각형으로 자릅니다. 그런 다음 다공성 멤브레인과 인터페이스된 2층 장치를 조립하기 위해 두 PDMS 부품 사이에 누출이 없는 다공성 멤브레인을 조립합니다.

이를 위해 PDMS 염기제 0.7g, 경화제 07g 및 톨루엔 540마이크로리터를 사용하여 PDMS 톨루엔 모르타르를 준비합니다. 모르타르를 철저히 소용돌이친 다음 200마이크로리터의 모르타르를 1500rpm의 유리 커버슬립에 60초 동안 스핀코트하여 얇고 균일한 모르타르 층을 얻습니다. 그런 다음 잉크 롤러를 사용하여 커버 슬립의 모르타르 얇은 층을 칩의 바닥 부분으로 옮깁니다.

바닥 부분을 오븐용 접시에 넣은 다음 모르타르를 칩의 상단 부분으로 옮깁니다. 핀셋 세트를 사용하여 멤브레인의 가장자리를 스핀코팅 모르타르에 담그고 바닥 부분의 중앙에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 정렬에 주의하면서 상단 부분을 하단 부분에 조심스럽게 놓습니다.

칩에 먼지가 들어가지 않도록 투명 테이프로 칩 입구를 덮고 섭씨 60도에서 3시간 동안 굽습니다. 이 단계에서는 주의하는 것이 매우 중요합니다. 모르타르가 채널에 들어가 멤브레인을 막는 것을 방지하기 위해 칩에 압력을 가하지 말고 상단 부분을 하단 부분 위로 밀어 넣지 마십시오.

전극을 측면 채널에 통합하려면 백금 와이어를 2cm 길이의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 아세톤에 30분 동안 담가둡니다. 그런 다음 물과 에탄올로 헹구고 말리십시오.

직교류 후드에서 플라스틱 접시에 칩을 놓습니다. 핀셋을 사용하여 4개의 백금 와이어를 칩의 전극 채널에 삽입하고 플라스틱 접시에 구부려 다음 단계에서 접시에 고정할 수 있습니다. 0.7-1mm의 와이어를 T자형 채널 접합부를 지나 배양 채널에 삽입합니다.

그런 다음 전극 채널 입구에 UV 경화 접착제 한 방울을 바르고 접착제가 모세관 힘에 의해 채널을 채우도록 합니다. 그런 다음 UV를 켜고 전극 채널의 끝에 도달하면 접착제를 경화시킵니다. 4개의 통합 전극을 2액형 에폭시 접착제로 플라스틱 접시에 고정했습니다.

그런 다음 칩을 투명 테이프로 덮고 섭씨 60도에서 2시간 동안 굽습니다. 식히고 사용할 때까지 먼지가 없는 상태로 보관하십시오. 세포 부착을 촉진하기 위해 칩을 코팅하려면 시약을 도입하기 전에 먼저 두 채널을 PBS로 채웁니다.

채널에 기포가 있는지 현미경으로 확인하십시오. 그렇다면 여분의 PBS로 세척하여 제거하십시오. 다음으로, PBS에서 밀리리터당 20마이크로그램의 인간 피브로넥틴 30마이크로리터로 두 채널을 채웁니다.

섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 칩을 내피 성장 배지로 씻어내고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 빈 칩의 TEER을 측정하여 모든 전극이 채널의 유체와 직접 접촉하는지 확인합니다.

이렇게 하려면 인큐베이터에서 칩을 꺼내 최소 10분 동안 실온에 도달하도록 합니다. 칩 외부의 전기 브리징을 방지하기 위해 전극 주변의 플라스틱 접시에서 액체를 제거하십시오. 다음으로, 두 전극의 각 조합에 대해 200Hz에서 1메가헤르츠까지의 임피던스 스펙트럼을 취하여 5-10분 내에 칩당 6개의 임피던스 스펙트럼을 생성하며, 이를 통해 TEER을 직접 결정할 수 있습니다.

임피던스 스펙트럼이 TEER 측정을 검증하기 위해 예상되는 크기와 모양을 가지고 있는지 확인합니다. 이제 hcMEC/D3 세포의 단층이 융합된 배양 플라스크에서 배양 배지를 제거하여 상단 채널에 안착할 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 씻으십시오.

PBS를 제거한 다음 2밀리리터의 05% 트립신 EDTA를 첨가하고 세포가 배양 플라스크에서 분리될 때까지 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다. 그런 다음 20% FBS가 보충된 배양 배지로 트립신을 비활성화합니다. 세포를 세고 현탁액의 총 수를 계산합니다.

한편, hcMEC/D3 세포를 390배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 적절한 부피의 내피 성장 배지에 다시 현탁시켜 칩의 제곱센티미터당 200,000개 세포의 파종 밀도에 해당하는 밀리리터당 500만 세포의 농도를 얻습니다. 다음으로, 잘 혼합된 세포 현탁액 30마이크로리터를 상단 채널로 천천히 피펫팅하고 압력을 가하면서 유창한 동작으로 입구에서 피펫을 제거합니다.

현미경으로 파종 밀도를 확인하십시오. 상단 채널 전체에 걸쳐 세포의 균일한 분포가 달성되어야 합니다. 그런 다음 칩을 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 최소 1시간 동안 배양합니다.

그 후, 부착되지 않은 세포는 내피 배양 배지로 씻어냅니다. TEER은 배양 기간 동안 모니터링된다는 점을 명심하십시오. 이는 셀이 없는 칩과 셀이 있는 칩의 전기 임피던스 분광법에 대한 임피던스 크기 및 위상 변이 대 주파수를 보여주는 일반적인 회로도 임피던스 스펙트럼입니다.

전극의 이중층 커패시턴스, 배양 매체 저항, 세포 장벽 저항 또는 세포막 커패시턴스에 의해 지배되는 4가지 주요 영역이 있습니다. 관심 영역은 세포층의 기여도를 정량화할 수 있는 위치를 나타냅니다. 그리고 이것은 4개의 전극의 6개 조합 모두에서 측정된 저항에서 TEER을 계산하는 공식입니다.

여기에 표시된 것은 3일간의 배양 기간 동안 칩에 있는 4개의 BBB의 평균 TEER이 22 플러스 또는 마이너스 1.3옴 제곱센티미터의 고원에 도달한 것입니다. 비교를 위해 블랭크 칩의 데이터가 포함되어 있으며, 이는 셀이 있는 칩의 TEER 값 변화와 비교하여 같은 기간 동안 0옴 제곱센티미터로부터의 한계 변동 및 편차를 보여줍니다. 염색된 핵의 형광 현미경 복제는 PDMS와 삽입물에 표시된 위치에서 멤브레인 모두에서 연속적인 내피 단층을 보여주었습니다.

면역형광은 밀접연접 단백질(tight junction protein)의 존재를 드러냈고, 하나는 세포 간의 BBB 특이적 밀착연접(tight junction)이 측정된 TEER을 발생시킨다는 것을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Organs-on-Chips에서 TEER 측정을 위한 통합 전극이 있는 칩의 제조 및 사용에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 혈액-뇌 장벽 연구 분야에서 예를 들어 알츠하이머병의 직접 전달 및 질병 특성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차에 따라 인간 유래 유도 만능 줄기 세포와 분화된 뇌 내피의 장벽 기능을 모니터링하여 맞춤형 의학에 적용할 수도 있습니다.