Name: 형광 현미경 검사 법에 의해 방사선-유도 Clonogenic 세포 죽음의 모드의 평가 위한 1 단계 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 배우세요 방사선에 의한 클로노제닉 세포 사망의 주요 양상을 DAPI 염색과 형광 현미경으로 동시에 평가하는 방법을. 이 기법은 암 연구와 방사선 생물학 이해에 필수적입니다.

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우리는 기술 지원에 대 한 부인 아키코 시바타를 감사합니다. 이 작품 최고의 졸업 학교, 무거운 이온 치료제와 공학에 글로벌 리더 양성을 위한 프로그램에 대 한 교육, 문화, 스포츠, 과학, 그리고 일본의 기술에서 연구비 지원 했다.

1. 재료의 준비 <ol><li>압력솥 커버 전표.
	<ol><li>유리 비 커에 커버 전표 장소.</li>
		<li>호 유리 비 커를 커버.</li>
		<li>20 분에 대 한 15 psi에서 121 ° C에 고압</li>
		<li>문화 후드에 실 온에서 50 ° c.가 게에서 건조.</li>
	</ol></li> <li>고정 솔루션 준비: 3 %paraformaldehyde + 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 2% 자당.
	<ol><li>1000 mL 유리병 700 mL PBS와 30 g paraformaldehyde 추가. 
		주의: Paraformaldehyde 부식성, 적절 한 장갑을 착용 하십시오.</li>
		<li>전자 레인지를 사용 하 여 80 ° C에가 열 하 여 완전히 분해 paraformaldehyde. 
		주의: Paraformaldehyde 연기 독성, 마스크를 착용.</li>
		<li>하룻밤 실 온에 둡니다.</li>
		<li>추가 20 g 자당.</li>
		<li>1 총 볼륨을 추가 PBS L.</li>
		<li>약 수 50 ml에서 튜브입니다. -20 ° C에서 3 년 또는 4에서 3 개월간 고정 솔루션 저장 될 수 있다 ° c.</li>
	</ol></li></ol> 2. 세포 배양의 준비 참고:이 절차는 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
로그 성장 5를 유지 하기 위해 <ol><li>문화와 통로 U2OS 인간의 다리 셀. 
	참고: 다른 세포 유형 최적의 방사선 복용량을 결정 한 후에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 적신 종이 타월로 메스를 닦으십시오. 35 mm 셀 문화 접시에 커버 슬립을 배치, 메스를 사용 하 여 (이 단순히 라고도 &#34; 접시 &#34;). 
	참고: 한 접시에 커버 실수할 수는 실험에 따라 늘릴 수 있습니다 (토론 참조) 디자인.</li>
	<li>추가 1 mL 문화 미디어: 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 DMEM. 
	참고: 다른 미디어는 선택한 셀 형식을 사용할 수 있습니다.</li>
	종이 수건으로 닦아 <li>겸 70% 에탄올과 습. 커버 슬립의 중심을 잡고 부드럽게는 집게를 사용 하 여. 커버 슬립에 보류를 유지 하면서 접시에서 배양을 완전히 발음. 
	&#8203; 참고:이 단계는 접시 커버 슬립의 동원 정지 촉진.</li>
	<li>부착 배양된 세포를 트립 신 5를 사용 하 여 분리.
	<ol><li>배양 접시에서 발음.</li>
		<li>1 mL PBS를 추가 하 고 요리를 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>접시에서 PBS 발음.</li>
		<li>1 mL의 트립 신 [0.25w/v% 트립 신-1mmol/L EDTA] 요리 추가.</li>
		<li>품 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 5 분.</li>
		<li>9 mL 문화 미디어 요리를 추가.</li>
		<li>1000 μ micropipette를 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션 준비.</li>
	</ol></li> <li>계산 셀 5.
	<ol><li>1.5 mL 튜브에 더하고 0.9 mL 세포 현 탁 액 0.1 mL 0.4 %Trypan 블루 솔루션.</li>
		<li>는 hemocytometer 적용 10 μ.</li>
		<li>검사의 수는 반전 단계 현미경 셀 (즉, 라이브) 흠 없는.</li>
	</ol></li> <li>15ml 튜브에서 3 mL 세포 현 탁 액 0.5 x 10 5 셀/mL의 조밀도에 문화 미디어에서 준비. 
	참고: 셀 밀도 실험에 따라 수정할 수 있습니다 필요 (내용 참조).</li>
	<li>부드럽게 접시에 세포 현 탁 액의 2 개 mL를 추가.</li>
	<li>5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 하룻밤 품.</li>
</ol> 3. 방사선 주의: 신중 하 게 제조 업체에 따라 x 선 irradiator 처리 &#39; s 지침.
<ol><li>거꾸로 위상 현미경 세포 검사. 커버 슬립 하 고 살아있는 셀 연결 되어 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>6 Gy 엑스레이와 접시를 비추는 (1.4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).</li>
	<li>품 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ℃에서 72 h. 
	참고: 보육 시간 실험에 따라 변경 될 수 있다 (토론 참조) 디자인.</li>
</ol> 4. 고정 <ol><li>배양 접시에서 발음.</li>
	<li>사용이 위, 1000 μ micropipette의 끝을 잘라 팁 끝에서 5 mm. 
	참고: 컷된 팁 부드럽게 고정 솔루션을 적용 하는 데 도움이.</li>
	<li>접시의 측면 벽에서 접시에 1 mL (단계 1.2 준비) 고정 솔루션 컷된 팁을 사용 하 여 추가. 
	참고:이 단계 시간적 이며, 따라서 여러 샘플을 처리할 때 micropipette 팁을 변경 하지 않고 수행 되어야 한다. 접시의 바닥에 직접 고정 솔루션의 응용 프로그램은 세포를 손상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>광장 문화 접시에 접시를 놓습니다. 흔들어 균등 하 게 커버 슬립 고정 솔루션 배포를 부드럽게 광장 문화 접시.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 품.</li>
	<li>접시에서 고정 솔루션 발음.</li>
	<li>접시의 측 벽에서 접시에 PBS의 2 개 mL를 추가. 
	참고: 응용 프로그램 PBS의 접시의 바닥을 직접 세포를 손상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>접시에서 PBS 발음.</li>
	<li>4.7-4.8 두 번 반복 단계. 
	참고: 접시 저장 될 수 있다 4 ° C에서 1 주 동안 2 mL PBS에에서 목욕 커버 미끄러져와.</li>
</ol> 5. DAPI 얼룩 <ol><li>슬라이드 유리, 5 μ 1 μ g/mL DAPI 얼룩 적용 시 약. 
	참고: 시 약 얼룩 DAPI는 6 개월에 대 한 안정적인 저장 될 때-20 이하로 빛 으로부터 보호 ° c.</li>
	<li>접시에서 커버 슬립을 제거, 메스를 사용 하 여.</li>
	<li>종이 타월 커버 슬립의 가장자리를 만져 커버 슬립에 초과 PBS에서 그릴.</li>
	<li>마운트 커버 슬립 DAPI 셀 DAPI 얼룩 시 약에 노출 되는 있도록 슬라이드 유리에 시 약을 얼룩의 드롭에 거꾸로. 
	참고:이 단계는 시간적. DAPI에서의 건조 시 약 얼룩 이어질 수 있는 차선의 얼룩.</li>
	<li>샘플-20에서 1 년 동안 저장 될 수 있다 ° c.</li>
</ol> 6. 이미지 수집 <ol><li>검사에는 형광 현미경 샘플. 핵 DAPI 필터를 사용 하 여 시각화 됩니다. 
	참고: 중 하나는 20 X 또는 60 X 오일 렌즈를 사용할 수 있습니다, 연구원에 따르면 &#39; s 관심. 60 X 오일 렌즈를 사용할 때 커버 슬립에 오일 한 방울을 추가 합니다. 샘플; 렌즈를 만지지 마십시오 조심 그렇지 않으면, 렌즈 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>다음 설정 및 매개 변수는 CCD 카메라와 디지털 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 핵의 이미지: DAPI 필터, 단층 이미지, 1 X, 및 자동 노출의 이득.</li>
	<li>완료 이미지 수집: 20 X 렌즈 렌즈 클리너 적신 종이 타월로 닦아. 클로 프롬을 적신 종이 타월로 기름 렌즈 X 60을 닦아.</li>
</ol> 7. Clonogenic 세포 죽음 모드의 평가 <ol><li>계산된 핵의 총 수는 300에 도달할 때까지 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 기준을 충족 하는 핵의 수를 계산 하는 무작위로 선택 된 이미지에서. 각 실험 설정에 대 한 3 중에이 단계를 수행.
	<ol><li>Apoptosis에 대 한 기준: apoptotic 몸 (즉, 압축 및 조각난 핵) 6 , 7의 존재.</li>
		<li>기준 mitotic 재앙: 두 개 이상의 고유한 돌출부 또는 micronucl를 보여주는 핵의 존재이 8 , , 9 10.</li>
		<li>세포 노화에 대 한 기준: 노화 관련 heterochromatic foci (SAHF) (즉, 포함 하는 30-50, 밀도 foci 핵 DNA)의 존재 2 , 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWouters%2C+BG+%22Basic+Clinical+Radiobiology.+4th+ed%22">Basic Clinical Radiobiology. 4th ed</a>. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 첫째, 세포 해야 될 성장 문화 접시에는 단층으로 다층 셀 어렵습니다 DAPI 스테인드 핵의 형태 평가 실시 하기 때문에. 2.9, 단계에서이 끝에 인큐베이터에 문화 접시의 주의 전송 것이 좋습니다; 문화 접시의 동요 문화 접시의 중앙에 세포의 농도에 이르게 중단된 셀의 소용돌이 생성 합니다. 또한, overconfluence 다층 셀 선도 피해 야 한다. 이 위해, 단계, 2.7에서에서 문화 접시에 시드 셀 수 시간과 방사선 및 고정 사이의 간격을 두 배로 하는 인구에 따라 수정할 수 있습니다. 고정 시간에 약 80의 합류는 것이 좋습니다. 둘째, 속도 고정 및 DAPI 얼룩 (즉, 4-5 단계)에서 중요 하다. 이러한 단계에 대 한 시간에 관한 간 샘플 불일치가 형태학 평가 애매 한 것이 핵에 DAPI 신호 강도 발생할 수 있습니다.
2.2 단계에서 단일 문화 접시에 커버 슬립의 수를 증가 수 있습니다; 4 덮개 미 끄 러 짐의 최대 35 mm 접시에 놓일 수 있다 그리고 더 큰 접시를 사용 하 여 수를 더 증가 될 수 있다. 여러 표지 전표 각 문화 접시에 배치 (즉, 커버 전표 관심의 여러 시간 점에서 문화 접시 하나 하나에서에서 수집 될 수 있습니다) 특정된 치료에 대 한 시간 코스 평가의 효율적인 운영 수 있습니다.
3.2 단계에서 방사선 복용량은 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 여러 셀 라인에 일관 된 복용량의 응용 프로그램에는 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 감도의 비교 수 있습니다. 다른 한편으로, 각 셀 라인에 대 한 iso clonogenic 생존 복용량의 사용 비교를 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음 프로필의 있습니다. Iso clonogenic 생존 복용량 clonogenic 생존 분석 결과12에의해 결정 될 수 있습니다. D10 값 10 %clonogenic 생존을 제공 하는 복용량 iso clonogenic 생존 복용량에 대 한 일반적인 끝점입니다.
3.3 단계에서 고정 하는 방사선에서 시간; 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 적외선 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 피크 시간 셀 라인 및 치료에 따라 다르기 때문에 이것이 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 clonogenic 세포 죽음 프로필, 우리의 그룹에 의해 여러 연구에 따라의 초기 심사에 가장 유용할 것 이다 시간 지점으로 방사선 조사 후 72 h를 사용 하 고 다른 설명 다음과 같습니다1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-레이-유도 된 apoptosis 단단한 종양에서 주로 설립 셀에 발생 하는 방사선 조사 후 몇 일. (두 번째 또는 세 번째에서 가장 눈에 띄게 발생 하는 암 세포에 mitotic 재앙 ii) X-레이-유도 방사선에 의해 유도 된 임시 세포 주기 검거에서 출시 후 유사 분열. 릴리스는 일반적으로 다음, 방사선 조사 후 약 24 시간 발생 반복된 mitoses 약 24 h. (iii)의 간격에 의해 X-레이-유도 세포 노화 된다 분명 후 셀 라인에 의존 간격: 2 일 후 일부 초기 사례 및 대부분의 셀 라인에 대 한 방사선 조사 후 7 일에 대 한 조사. 취득 후 clonogenic 셀의 전반적인 그림 죽음 프로필 초기 심사, 시간 과정 실험 clonogenic 세포 죽음의 상태 또는 특정 셀 라인의 각 모드에 대 한 피크 타임의 자세한 설명을 제공할 것입니다 이자4.
그 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 방사선 민감도 평가 대 한 표준 메서드는 주목 한다. Apoptosis와 mitotic 재앙만 시간 지속. 따라서, 주어진된 시간 지점에 대 한 분석 결과 얼룩 DAPI apoptosis와 평가의 시간 지점에 mitotic 재앙을 감지 합니다. 다른 한편으로, clonogenic 생존의 결과 포인트 apoptosis와 mitotic 재앙 발생 했다 잠복기 동안 일반적으로 방사선 조사 후 10-14 일의 총 금액을 포함 하는 주어진된 시간에 시험. Apoptosis와 mitotic 재앙, 노화 세포에서 다른 문화 접시;에 남아 그들은 방사선 조사 후 시간이 지남에 따라 점차적으로 축적. 따라서, 둘 다의 결과 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 반영 인큐베이션 기간 동안 발생 한 노화의 총 금액. 중요 한 것은, apoptosis, mitotic 혁명과 방사선에 의해 유도 된 노화의 비율이 다릅니다 널리 셀 선 및 방사선 복용량. 함께 찍은, 이론적으로, 한 시험의 결과 변환할 수 없습니다 그 다른 분석 결과에 직접.
DAPI 시험을 얼룩이 지는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, mitotic 재앙 세포 죽음의 다른 모드 인지 논란이 남아 있습니다. 방사선 생물학의 분야, mitotic 재앙은 clonogenic 세포 죽음1의 다른 장치에서 IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 간주 됩니다. 다른 한편으로, 다른 그 mitotic 재앙은 세포 죽음 그러나 apoptosis와 괴 사13,14를 포함 하 여 세포 죽음 앞에 오히려 프로세스의 고유 모드 논쟁. 따라서, apoptosis와 mitotic 재앙은 어느 정도 겹칠 수 있습니다. 둘째, 이전 연구는 세포 노화 일부 세포 치료 설정2에서 SAHF의 부재에서 발생할 수 있습니다 것이 좋습니다. 각 clonogenic 셀을 위해 설계 된 현재, 다른 분석 실험에서 죽음 모드는 주어진된 실험의 결론의 견고성을 높이기 위해 사용 되어야 한다. 셋째, 시험을 얼룩이 DAPI apoptosis, mitotic 재앙, 세포 노화 (예, 괴 사 및 autophagy) 이외의 clonogenic 세포 죽음의 모드 평가 수 없습니다. 넷째, 분석 결과 종양 방사선 치료 반응의 예측으로 얼룩 DAPI 유틸리티 하지 병원에 해명 되었습니다. 이 관점에서 clonogenic 세포 죽음의 총 금액을 평가, clonogenic 생존 분석 결과 상관 관계 SF2, 셀 2 Gy와 반구의 살아남은 분수 간에 설정 된 때문에 시험을 얼룩이 DAPI에 우수한 X-레이, 그리고 방사선 치료15종양 응답. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 데이터 수집을 위한 clonogenic 생존 분석 결과 주로 전문성의 높은 학위와는 오랜 기간 (즉, 14 일)에 대 한 요구 사항으로 인해 병원에 널리 활용 되지가 주목 된다. 비교 함으로써, DAPI 얼룩 분석 결과 대 한 절차 간단 하 고 시간이 크게 단축, 약 3-4 일, 결과를 생성. DAPI 얼룩의 유틸리티방사선 치료 종양 응답의 예언자로 서 분석 결과 가까운 장래에 병원에서 테스트 됩니다.
요약 하자면, 분석 결과 얼룩 DAPI clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 세 가지 주요 모드를 동시에 평가 하는 비용 효율적인 단계 분석 결과 이다. 이 이렇게 쉽게 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 시간 포인트, clonogenic 세포 죽음의 모드에 있습니다.

이온화 방사선 (IR) clonogenic 세포 죽음의 여러 모드를 유도합니다. Clonogenic IR 유도 된 세포 죽음에 대 한 연구는 암 방사선 요법의 치료 효능을 증가 하는 방법을 개발 뿐만 아니라 정상 조직에 IR의 독성을 이해 하기 위한 중요 합니다. Apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화는 IR1에 의해 유도 된 clonogenic 세포 죽음의 주요 모드. Apoptosis는 DNA 손상1에 의해 시작 된 세포 죽음의 통제 모드입니다. Mitotic 재앙은 배달된 DNA 이중 가닥 나누기1에서 발생 하는 탈 선 유사 분열으로 인해 발생 하는 세포 죽음 이다. 세포 노화는 돌이킬 수 없는 세포 성장 체포2;의 상태로 정의 됩니다. 세포 노화 세포 죽음 본질적 아니다, 하지만 그것은 clonogenic 세포 죽음의 모드 때문에 노화 세포의 clonogenic 생존 곧 note.
다양 한 세포 기반 분석 실험 개별적으로 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화를 평가 하기 위해 개발 되었습니다. Apoptosis 흐름 cytometry1터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉-끝 레이블 (TUNEL) 얼룩, annexin V 얼룩, DNA 파편 분석 실험, 그리고 하위-G1 세포 주기 단계 결정으로 평가 될 수 있다. Mitotic 재앙 면역 형광 mitotic 마커, MPM2, TUNEL 염색, 전자 현미경1등에 대 한 얼룩에 의해 평가 될 수 있다. 세포 노화 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 얼룩, 성장 검거 분석 실험, 및 전자 현미경1에 의해 평가 될 수 있다. 중요 한 것은, clonogenic 세포 죽음의 우세 모드 셀 라인 및 치료 설정3,4마다 다릅니다. 따라서, 주어진된 실험 설정에 대 한 clonogenic 세포 죽음의 전반적인 프로필, 명료 하 모든 죽음의 이러한 모드를 포함 분석 하는 여러 실험 해야 합니다 실시 함께, 노동 및 비용 집중입니다.
이 문서에서 우리는 apoptosis, mitotic 혁명과 IR3,4에 의해 유도 된 세포 노화를 동시에 평가 대 한 분석 결과 신속 하 고 비용 효율적인 단계를 설명 합니다. 이 방법에서는, 커버 슬립에 성장 하는 세포는 엑스레이와 방사선 하 고 물 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화는 각각 식별 DAPI 스테인드 핵의 각각 특징적인 형태학에 기반. 이 방법은 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 조사 대상 세포 조건에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 시간 포인트에서 clonogenic 세포 죽음 프로필에 대 한 심사를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 도움이 될 것입니다. 관심입니다.

<table><tbody><tr><td>커버 슬립</td><td>Matsunami</td><td>C013001</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-250G</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 식염수</td><td>Cosmo Bio</td><td>16232000</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Kai Medical</td><td>No.20, 520-A</td><td></td></tr><tr><td>35mm 세포 배양 접시</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr>트립<tr><td>신</td><td>와코</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>역상 현미경</td><td>시마즈</td><td>114-909</td><td></td></tr><tr><td>X선 조사기</td><td>Faxitron 바이콥틱</td>스 <td>Faxitron RX-650</td><td></td></tr><tr><td>사각 배양접시</td><td>코닝</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 유리</td><td>Matsunami</td><td>Pro-11</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 염색 시약</td><td>세포 신호</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 DAPI 필터</td><td>Nikon</td><td>U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 렌즈(20배;)</td><td>니콘</td><td>플랜 아포&람다; 20 X/0.75</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 렌즈(60&times;, 오일)</td><td>니콘</td><td>아포&람다;60 X/1.40 오일</td><td></td></tr><tr><td></td><td>오일 올림푸스</td><td>N5218600</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>니콘</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>디지털 이미지 취득 소프트</td><td>니콘</td><td>NIS-Elements 문서</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 클리너</td><td>올림푸스</td><td>OT0552</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>와코</td><td>035-02616</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 현미경 검사 법에 의해 방사선-유도 clonogenic 세포 죽음의 모드의 평가 위한 1 단계 프로토콜

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, IR, 즉, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 의해 유도 된 clonogenic 세포 죽음의 주요 모드를 동시에 평가 대 한 신속 하 고 비용 효율적인 단계 분석 결과 설명 합니다. 이 방법에서는, 커버 슬립에 성장 하는 세포는 엑스레이와 방사선 하 고 물 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화 식별 됩니다 DAPI 스테인드 핵의 특징적인 형태학에 따라. Apoptosis는 apoptotic 몸 (즉, 압축 및 조각난 핵)의 존재에 의해 결정 됩니다. Mitotic 재앙은 두 개 이상의 고유한 돌출부 및 micronuclei 핵의 존재에 의해 결정 됩니다. 세포 노화 노화 관련 heterochromatic foci (즉, 포함 하는 30-50, 밀도 foci 핵 DNA)의 존재에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 쉽게 clonogenic 세포 죽음 모드 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 또는 시간 포인트를 사용 하 여 화면을 실험 수 있습니다.

예를 들어, U2OS 인간 다리 셀 6 Gy 엑스레이와 치료, 72 h에 대 한 인 큐베이 팅 되었고 DAPI 얼룩이 지는 프로토콜에 따라 분석 결과를 받게. 그림 1 apoptosis, mitotic 혁명과 60 × 오일 렌즈를 사용 하 여 얻은 세포 노화와 관련 된 일반적인 핵 형태학에 대 한 확대 된 이미지를 보여줍니다. Clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 대 한 특성 형태학에 대 한 단계 7.1.1-7.1.3를 참조 하십시오. 그림 2 20 X 렌즈를 사용 하 여 얻은 핵의 개요 이미지를 보여줍니다. 6 Gy 엑스레이와 방사선 유발 mitotic 재앙 자주, 자주, apoptosis와 세포 노화 거의. 이러한 방식으로, 낮은 배율 필드에서 검사는 주어진된 실험 설정에서 clonogenic 세포 죽음 프로필의 전체 그림을 한 눈에 파악 하 하나 수 있습니다. 그림 3 은 정량된 데이터의 그래픽 표현.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg"> 
그림 1: DAPI 스테인드 핵 보여주는 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화의 일반적인 형태학의 이미지를 확대. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이 함께 조사 했다. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵 이미지 오일 렌즈 X 60을 사용 하 여 인수 했다. 눈금 막대 20 μ m =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg"> 
그림 2: 개요 이미지 셀의 핵 DAPI 스테인드의 x-레이로 치료. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이와 방사선 또는 모의 반구. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵의 이미지는 20 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 원, apoptosis; 화살표, mitotic 재앙입니다. 눈금 막대 = 50 μ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg"> 
그림 3: x-레이로 치료 하는 세포에서 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 정량된 데이터. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이와 방사선 또는 모의 반구. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵의 이미지는 20 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 무작위 분야에서 총 300 핵 apoptosis (Ap), mitotic (MC), 혁명과 세포 노화 (Sns)에 대 한 평가 했다. 평가 3 중에서 수행 했다. 평균 값이 표시 됩니다, 그리고 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, 우리는 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)의 형태에 따라 clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 평가 하기 위한 1 단계 분석 결과 설명-스테인드 핵 형광 현미경 검사 법에 의해 시각.

형광 현미경 검사 법에 의해 방사선-유도 Clonogenic 세포 죽음의 모드의 평가 위한 1 단계 프로토콜

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

이 분석의 전반적인 목표는 DAPI로 염색된 핵의 특징적인 형태를 기반으로 전리 방사선에 의해 유도되는 클론 생성 세포 사멸의 주요 모드를 평가하는 것입니다. 이 방법은 방사선 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 빠르고 비용 효율적인 기술의 주요 장점은 전리 방사선에 의해 유도된 클론 생성 세포 사멸의 주요 모드를 동시에 평가할 수 있다는 것입니다.일반적으로 방사선 생물학을 처음 접하는 개인은 각 세포 사멸 방식을 평가하기 위해 다른 분석이 필요하기 때문에 방사선 유발 클론 세포 사멸을 평가하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 여러 세포주와 방사선량을 사용하여 방사선 유도 클론 생성 세포 사멸에 대한 대규모 스크리닝을 수행했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 방법은 방사선 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암 화학 요법과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 공동 작업자인 Atsushi Shibata가 맡을 것입니다. 70% 에탄올을 적신 종이 타월로 메스를 소독하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 메스를 사용하여 35mm 세포 배양 접시에 커버 슬립을 놓습니다.커버 슬립이 있는 배양 접시에 1밀리리터의 배양 배지를 추가합니다. 이제 덮개 중앙을 부드럽게 잡고 멸균 집게로 미끄러지게 한 다음 접시에서 배양 배지를 완전히 흡인합니다. 다음으로, 15 밀리리터 튜브의 배양 배지에서 3 밀리리터 세포 현탁액을 준비합니다.세포 현탁액을 배양 접시에 추가합니다. 그리고 섭씨 37도와 5%CO2에서 밤새 배양합니다. 세포가 커버 슬립에 부착되어 있고 도립 위상차 현미경으로 검사하여 살아 있는지 확인합니다.이제 접시에 6 개의 회색 X 선 방사선을 조사하십시오. 방사선 조사 후 인큐베이터에서 섭씨 37도, CO2 5%에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 이제 인큐베이터에서 세포를 꺼내 배양 접시에서 배양 배지를 흡인합니다.가위를 사용하여 1, 000 마이크로 리터 마이크로 피펫 끝에서 약 5 밀리미터 떨어진 곳을 자릅니다. 그리고 그것을 사용하여 배양 접시에 1 밀리리터의 고정 용액을 첨가하십시오. 세포의 손상을 최소화하기 위해 배양 접시의 벽을 따라 고정 용액을 도포합니다.그런 다음 이 배양 접시를 정사각형 배양 접시에 옮기고 부드럽게 흔들어 커버 슬립에 고정 용액을 고르게 분포시킵니다. 그 후, 실온에서 10분 동안 접시를 배양합니다. 접시에서 고정 용액을 흡입하십시오.이제 접시 벽을 따라 PBS 2ml를 추가합니다. 그런 다음 PBS를 흡인합니다. DAPI 염색을 준비하려면 5마이크로리터의 DAPI 염색 시약을 유리 슬라이드에 추가합니다.그런 다음 메스를 사용하여 접시에서 덮개 슬립을 제거합니다. 그리고 커버 슬립의 가장자리를 종이 타월로 만져 커버 슬립의 여분의 PBS를 배출합니다. 이제 세포가 DAPI 염색 시약에 노출되도록 유리 슬라이드의 DAPI 염색 시약 방울에 커버 슬립을 거꾸로 장착합니다.마지막으로, DAPI 필터가 장착된 형광 현미경으로 염색된 세포를 검사합니다. 세포 사멸의 세 가지 모드 각각에서 핵 형태학이 표시됩니다. 세포사멸 세포는 응축된 핵을 가지고 있는 것으로 보입니다.여러 엽은 유사 분열 재앙을 겪고있는 세포의 핵에서 관찰됩니다. 노화를 겪고 있는 세포는 특징적인 노화와 관련된 이염색질 병소를 나타내는 것으로 보입니다. 모의 조사된 핵과 6개의 회색 X선이 조사된 핵의 비교 관찰이 표시됩니다.원은 세포사멸을 겪고 있는 핵을 나타내고 화살표는 유사분열 재앙을 겪고 있는 핵을 나타냅니다. 모의(mock)와 비교하여 조사된 약 300개의 핵에 대한 평가가 표시됩니다. 6개의 회색 X선 조사는 약 25%에서 유사분열 재앙을 더 자주 일으키고 약 5%에서 세포사멸을 일으키고 매우 드문 노화 사건을 일으키는 것으로 보입니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 커버 슬립에 용액을 직접 도포하여 세포를 손상시키지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유세포 분석 또는 세포 사멸 마커 단백질과 같은 다른 방법뿐만 아니라 노화를 평가하기 위한 노화 관련 베타-갈락토시다아제 염색을 수행하여 각 클론생성 세포 사멸 방식을 더 자세히 이해할 수 있습니다.

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JoVE Journal

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