형광 현미경 검사 법에 의해 방사선-유도 Clonogenic 세포 죽음의 모드의 평가 위한 1 단계 프로토콜

이 분석의 전반적인 목표는 DAPI로 염색된 핵의 특징적인 형태를 기반으로 전리 방사선에 의해 유도되는 클론 생성 세포 사멸의 주요 모드를 평가하는 것입니다. 이 방법은 방사선 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 빠르고 비용 효율적인 기술의 주요 장점은 전리 방사선에 의해 유도된 클론 생성 세포 사멸의 주요 모드를 동시에 평가할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 방사선 생물학을 처음 접하는 개인은 각 세포 사멸 방식을 평가하기 위해 다른 분석이 필요하기 때문에 방사선 유발 클론 세포 사멸을 평가하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 여러 세포주와 방사선량을 사용하여 방사선 유도 클론 생성 세포 사멸에 대한 대규모 스크리닝을 수행했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 방법은 방사선 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암 화학 요법과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 것은 공동 작업자인 Atsushi Shibata가 맡을 것입니다. 70% 에탄올을 적신 종이 타월로 메스를 소독하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 메스를 사용하여 35mm 세포 배양 접시에 커버 슬립을 놓습니다.

커버 슬립이 있는 배양 접시에 1밀리리터의 배양 배지를 추가합니다. 이제 덮개 중앙을 부드럽게 잡고 멸균 집게로 미끄러지게 한 다음 접시에서 배양 배지를 완전히 흡인합니다. 다음으로, 15 밀리리터 튜브의 배양 배지에서 3 밀리리터 세포 현탁액을 준비합니다.

세포 현탁액을 배양 접시에 추가합니다. 그리고 섭씨 37도와 5%CO2에서 밤새 배양합니다. 세포가 커버 슬립에 부착되어 있고 도립 위상차 현미경으로 검사하여 살아 있는지 확인합니다.

이제 접시에 6 개의 회색 X 선 방사선을 조사하십시오. 방사선 조사 후 인큐베이터에서 섭씨 37도, CO2 5%에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 이제 인큐베이터에서 세포를 꺼내 배양 접시에서 배양 배지를 흡인합니다.

가위를 사용하여 1, 000 마이크로 리터 마이크로 피펫 끝에서 약 5 밀리미터 떨어진 곳을 자릅니다. 그리고 그것을 사용하여 배양 접시에 1 밀리리터의 고정 용액을 첨가하십시오. 세포의 손상을 최소화하기 위해 배양 접시의 벽을 따라 고정 용액을 도포합니다.

그런 다음 이 배양 접시를 정사각형 배양 접시에 옮기고 부드럽게 흔들어 커버 슬립에 고정 용액을 고르게 분포시킵니다. 그 후, 실온에서 10분 동안 접시를 배양합니다. 접시에서 고정 용액을 흡입하십시오.

이제 접시 벽을 따라 PBS 2ml를 추가합니다. 그런 다음 PBS를 흡인합니다. DAPI 염색을 준비하려면 5마이크로리터의 DAPI 염색 시약을 유리 슬라이드에 추가합니다.

그런 다음 메스를 사용하여 접시에서 덮개 슬립을 제거합니다. 그리고 커버 슬립의 가장자리를 종이 타월로 만져 커버 슬립의 여분의 PBS를 배출합니다. 이제 세포가 DAPI 염색 시약에 노출되도록 유리 슬라이드의 DAPI 염색 시약 방울에 커버 슬립을 거꾸로 장착합니다.

마지막으로, DAPI 필터가 장착된 형광 현미경으로 염색된 세포를 검사합니다. 세포 사멸의 세 가지 모드 각각에서 핵 형태학이 표시됩니다. 세포사멸 세포는 응축된 핵을 가지고 있는 것으로 보입니다.

여러 엽은 유사 분열 재앙을 겪고있는 세포의 핵에서 관찰됩니다. 노화를 겪고 있는 세포는 특징적인 노화와 관련된 이염색질 병소를 나타내는 것으로 보입니다. 모의 조사된 핵과 6개의 회색 X선이 조사된 핵의 비교 관찰이 표시됩니다.

원은 세포사멸을 겪고 있는 핵을 나타내고 화살표는 유사분열 재앙을 겪고 있는 핵을 나타냅니다. 모의(mock)와 비교하여 조사된 약 300개의 핵에 대한 평가가 표시됩니다. 6개의 회색 X선 조사는 약 25%에서 유사분열 재앙을 더 자주 일으키고 약 5%에서 세포사멸을 일으키고 매우 드문 노화 사건을 일으키는 것으로 보입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 커버 슬립에 용액을 직접 도포하여 세포를 손상시키지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유세포 분석 또는 세포 사멸 마커 단백질과 같은 다른 방법뿐만 아니라 노화를 평가하기 위한 노화 관련 베타-갈락토시다아제 염색을 수행하여 각 클론생성 세포 사멸 방식을 더 자세히 이해할 수 있습니다.