다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

이 기술의 전반적인 목표는 순환 종양 또는 ctDNA에서 빈도가 낮은 돌연변이를 감지하여 임상 의사에게 종양을 진단하고 치료에 대한 반응으로 종양 역학을 모니터링할 수 있는 강력한 도구를 제공하는 것입니다. ctDNA를 검사하는 방법은 단일 핵형 변이, 삽입 삭제, 복제 수 변이 및 구조적 변이와 같이 환자가 어떤 종류의 돌연변이를 가지고 있는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 ctDNA에서 저주파 돌연변이를 정밀하게 검출하는 높은 민감도와 특이성입니다.

절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Yuliang Yang입니다. 먼저 채취 튜브에 10ml의 말초 혈액을 채취하고 튜브를 위아래로 6-8회 부드럽게 뒤집어 내용물을 혼합합니다. 혈액 샘플을 채취 튜브에 넣어 섭씨 6도에서 37도까지 최대 72시간 동안 보관합니다.

수집 튜브를 1, 600 회 g의 실온에서 10 분 동안 원심 분리하십시오. 그런 다음 폐기 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 튜브의 상층액 또는 혈장을 펠릿을 방해하지 않고 적절하게 라벨이 지정된 4개의 깨끗한 2밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 깨끗한 폐기 피펫을 사용하여 1ml의 셀을 적절하게 라벨링된 2mL의 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

게놈 또는 gDNA를 분리하기 전에 세포를 섭씨 영하 20도 이하에서 보관하십시오. 다음으로, 플라즈마를 섭씨 4도에서 1, 600배 g으로 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음 플라즈마를 플라즈마로 적절하게 표시된 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 오염을 방지하기 위해 바닥에 약 0.1ml의 잔류 부피를 남겨둡니다.

버피 코트는 분리 과정에서 혈장에서 피해야 합니다. 그렇지 않으면 세포에서 추출한 큰 DNA 단편이 ctDNA를 희석시켜 검사의 민감도에 영향을 미칠 수 있습니다. 시판되는 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수집된 혈장 3ml에서 cfDNA를 분리합니다.

그런 다음 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 200마이크로리터의 백혈구에서 gDNA를 분리합니다. 초음파 처리로 gDNA 대조군 샘플을 단편화하려면 깨끗한 초음파 처리 튜브에서 100 마이크로 리터의 Tris-EDTA 버퍼에 1 마이크로 그램의 gDNA 샘플을 준비하십시오. 초음파 처리 프로그램을 총 30분 동안 30주기 동안 12초 켜기 및 32초 끄기로 설정합니다.

산물에 200 - 250개의 염기쌍 단편이 포함되어 있는지 확인한 후, 모든 단편화 산물을 150마이크로리터의 자성 비드가 들어 있는 새로운 1.5ml 튜브로 옮기고 5분 동안 샘플을 배양하여 올바른 단편을 선택합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 30초 동안 놓고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 튜브를 랙에 유지하면서 갓 준비한 200% 에탄올 80마이크로리터를 추가하여 비드를 세척합니다.

상층액을 제거하기 전에 30초 동안 비드를 배양하고 세척을 반복합니다. 비드를 자연 건조시키기 위해 뚜껑을 열어 둔 상태로 튜브를 랙에 보관하십시오. 그런 다음 비드에 32마이크로리터의 10밀리몰 Tris-HCL을 첨가하여 DNA 단편을 용리시킵니다.

제조업체의 지침에 따라 엔드 프렙 반응을 수행하려면 멸균 뉴클레아제가 없는 튜브에 7마이크로리터의 반응 완충액, 3마이크로리터의 효소 혼합물, 30나노그램의 cfDNA 및 2배 증류수를 총 60마이크로리터의 부피로 추가합니다. 별도의 튜브에 동일한 성분을 넣되 cfDNA 대신 1마이크로그램의 gDNA를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 20도의 열 순환기에서 30분 동안 배양한 다음 뚜껑을 가열하지 않고 섭씨 65도에서 30분 동안 배양합니다.

배양 직후, 30 마이크로리터의 ligation master mix, 1 microliter inligation enhancer, 4 microliter의 unique sequencing adapter를 튜브에 추가합니다. 뚜껑을 가열하지 않고 섭씨 20도의 열 순환기에서 15분 동안 반응을 배양합니다. Vortex는 마그네틱 비드를 다시 현탁시키고 비드를 최소 30분 동안 실온에 둡니다.

그런 다음 87마이크로리터의 부유한 마그네틱 비드를 ligation 반응에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합한 다음 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 비드를 세척하고 공기 건조한 후 20마이크로리터의 10밀리몰 Tris-HCL을 첨가하여 비드에서 DNA 표적을 용리합니다.

20마이크로리터의 어댑터 결찰 DNA 단편, 5마이크로리터의 인덱스 프라이머 i7, 25마이크로리터의 라이브러리 증폭 마스터 믹스 및 총 부피 50마이크로리터까지 이중 증류수를 추가합니다. PCR은 어댑터 결찰 cfDNA 또는 gDNA를 증폭합니다. 그런 다음 45마이크로리터의 부유 마그네틱 비드를 PCR이 풍부한 DNA에 추가합니다.

위아래로 피펫팅하여 샘플을 혼합하고 5분 동안 배양합니다. 상등액을 제거하고 비드를 세척한 후 30마이크로리터의 10밀리몰 Tris-HCL을 사용하여 어댑터로 DNA 단편을 용리합니다. 표적 DNA 캡처를 수행하려면 멸균 튜브에서 1.5마이크로그램의 풀링 라이브러리, P5 블록 100P 및 P7 블록 100P 각각 8마이크로리터, 마이크로리터 콕 1개당 1마이크로그램의 DNA 5마이크로리터를 추가하여 샘플을 차단합니다.

섭씨 60도로 설정된 진공 농축기를 사용하여 튜브의 내용물을 건조시킵니다. 8.5마이크로리터의 2X 혼성화 완충액, 2.7마이크로리터의 혼성화 인핸서, 1.8마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 이중 증류수를 추가하여 DNA 캡처 프로브를 라이브러리와 하이브리드화합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 섭씨 95도의 써멀 믹서에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 즉시 4 마이크로 리터의 맞춤형 프로브를 추가하십시오. 뚜껑을 섭씨 75도로 가열한 상태에서 섭씨 65도의 열 혼합기에서 샘플을 4시간 동안 배양합니다. 혼성화된 타겟 DNA를 스트렙타비딘 비드로 배양한 다음 비드를 세척하여 결합되지 않은 DNA를 제거합니다.

제조업체의 지침에 따라 상업용 키트를 사용하여 캡처된 DNA 단편이 포함된 최종 20마이크로리터의 재현탁 비드를 얻으십시오. 스트렙타비딘 비드에서 결합되지 않은 DNA의 세척 단계는 빨라야 합니다. 그렇지 않으면 표적 DNA의 포획 효율에 영향을 미칠 수 있습니다.

제조업체의 지침에 따라 두 개의 마이크로몰 백본 올리고뉴클레오티드가 있는 상용 키트를 사용하여 PCR을 수행하여 캡처된 DNA 단편을 증폭합니다. 마지막으로, 45마이크로리터의 현탁 비드를 PCR 산물에 직접 첨가하고 30마이크로리터의 10밀리몰 Tris-HCL로 용출에 의해 비드에 결합된 증폭된 표적 DNA 단편을 농축합니다. 단편을 정량화하고 텍스트 프로토콜에 따라 염기서열분석 및 데이터 분석을 수행합니다.

이 표는 ER-seq가 기존 방법에 비해 커버리지 깊이를 23% 향상시키는 방법을 간략하게 설명합니다. 이는 cfDNA 분자의 효율적인 회수 덕분이며, 따라서 희귀 돌연변이의 분석을 크게 향상시킵니다. 또한 ER-seq에 사용되는 고유한 염기서열분석 어댑터를 통해 자연 복제와 PCR 유도 복제를 쉽게 구별할 수 있다는 점도 분명합니다.

호출 결과에 대한 이 표에 자세히 설명되어 있듯이 ER-seq 기반 분석은 EGFR pL858R 검출에 대해 100% 일치했으며 기존 분석과 비교할 때 검출 빈도가 약간 더 높았습니다. 중요한 것은 ER-seq 분석을 통해 높은 배경 잡음으로 인해 기존 분석에서는 인식되지 않았던 EGFR pT790M을 포함한 다른 상대적으로 낮은 빈도의 돌연변이를 검출할 수 있었다는 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 48시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 추출, 라이브러리 준비 및 혼성화 후 bead wash 중에 매우 적은 양의 cfDNA가 손실되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 염기서열분석을 위해 식별된 고유한 항목을 기반으로 환자의 ctDNA를 수집, 준비 및 표적화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후, 이 기술은 액체 생검 분야의 연구자들이 임상적 결정을 내리는 데 있어 더 나은 방법을 모색할 수 있는 길을 열었습니다.