Name: 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 학습하세요 ER-Seq 방법을 사용하여 ctDNA에서 희소한 변이를 정밀하게 검출하는 기술입니다. 이 기법은 양방향 오류 수정과 특수 배경 필터를 통해 높은 민감도와 특이도를 제공하여 암 진단 및 치료 반응 모니터링에 활용됩니다.

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북경 대학 사람들의 윤리 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 종양 표본과 혈액 샘플을 가져온 &#39; s 병원. 서 면된 동의 그들의 샘플을 사용 하 여 환자 로부터 얻은 했다. 참가자는 다음 기준에 따라 상영 했다: 여성, 고급 비 작은 세포 폐암, EGFR p.L858R 돌연변이 질병 진행 EGFR의 두 세션을 다음 타겟으로 Erlotinib, 치료 이전 생어 시퀀싱, 표시 및 저항의 원인을 분석 하 여 새로운 대상 약물을 찾을 ctDNA에 적용 된 응급실-Seq.
 1. cfDNA 및 genomic DNA (gDNA) 주변 혈액에서 DNA 추출 <ol><li>주변 혈액 컬렉션 튜브에서의 10 mL를 수집, 반전 부드럽게 위아래로 6-8 번을 혼합. 셀 전단 하지 마십시오. 혈액 샘플 컬렉션 튜브 6-37 ° C에서 최대 72 시간까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>1600 ()에서 10 분 동안 실내 온도에 컬렉션 튜브 원심 g. x</li>
	<li>컬렉션 튜브에서 원심 분리기 튜브 일회용 피펫으로 펠 릿 레이어 (백혈구)를 방해 하지 않고 사용 하 여 적절 하 게 표시 4 청소 2 mL 상쾌한 (플라즈마)를 전송.</li>
	<li>Transfer1 mL 2 mL를 깨끗 한 일회용 피펫으로 적절 하 게 사용 하 여 셀의 원심 분리기 관 이라는. 셀 또는 단계 1.8 전에 추운-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분 및 16000 () (1.3 단계)에서 플라즈마 원심 g. x</li>
	<li>전송으로 제대로 표시 하는 원심 분리기 튜브 청소 플라즈마 &#34; 플라즈마 &#34;, 오염을 피하기 위하여 하단에 잔여 볼륨의 ~0.1 mL를 두고. 1.7 단계까지-80 ° C에서 플라즈마를 저장.</li>
	<li>단계 1.6에서에서 플라즈마의 3 mL cfDNA (ctDNA 포함)을 사용 하 여 제조 업체에 따라 상용 키트를 사용 하 여 &#39; s 지침.</li>
	<li>GDNA 제조 업체에 따라 상용 키트를 사용 하 여 분리 단계 1.3에서에서 백혈구의 사용 200 µ L &#39; s 지침. 
	참고: 모두 cfDNA 및 gDNA를 사용 하기 전에-20 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>는 CfDNA 및 gDNA (표 2)에 대 한 다른 품질 컨트롤을 적용합니다. 샘플 저하 및 gDNA 오염 수준을 결정 하는 bioanalyzer에 대 한 표준화 된 방법으로 품질 관리를 수행 합니다. CfDNA 추출의 품질의 피크 분석 그림 1과 유사한 표시 되어야 합니다. 
	참고: cfDNA의 최대 크기는 약 170 bp.는 DNA의 양을 증가 귀 착될 것 이다 cfDNA에 드문 돌연변이의 효과적인 탐지에 대 한 높은 품질 라이브러리 참고. 적어도 30 ng cfDNA (3만 부)를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol> 2. 도서관 준비 참고: 조각난된 DNA에 기본 라이브러리 건설에 관한 cfDNA 피크 크기 ~ 170 bp와 조각에 존재 하 고 따라서 조각화 될 필요가 없습니다.
<ol><li>조각 컨트롤 샘플 (gDNA) 의해 얻을 200-250 bp 파편을 쥡니다.
	<ol><li>트리 스-EDTA 청소 쥡니다 튜브에 버퍼의 100 µ L에서 gDNA 샘플의 준비 1 µ g.</li>
		<li>30으로 쥡니다 프로그램 설정 s 12 분의 총 12 사이클에 대 한 해제 및 30 s</li>
		<li>쥡니다, 후 (5 µ L) 제품 2 %agarose 젤 분석을 실행 하 여 200-250 bp 파편을 포함 하는 것을 확인.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 튜브에 모든 조각화 제품을 전송 하 고 올바른 조각을 선택 하 5 분에 대 한 자석 구슬의 150 µ L로 품 어.</li>
		<li>는 상쾌한 30 자석 선반에 튜브를 넣어 제거 s.</li>
		<li>자석 선반에 머물고 튜브 80% 에탄올 (갓 준비)의 200 µ L와 구슬 씻어. 30 알을 품는 상쾌한을 제거 하기 전에 s. 한번 반복.</li>
		<li>공기 튜브 뚜껑 자석 선반에 머무는 동안 오픈 비즈 건조. Overdried 구슬을 DNA 대상 복구 잘 다는 것을 확인 하지 마십시오. UV/Vis 분광학에 의해 정량화 다음 DNA 파편을 해결 하려면 구슬에 10 mM Tris HCl (pH 8)의 32 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 파편을 elute. 
		참고: 적어도 200 ng 다음 실험에 필요한.</li>
	</ol></li> <li>끝 준비 반응 참고: 따라 제조 업체 &#39; s 명령 및 필요에 따라 수정. CfDNA;의 사용 30 ng 그리고 컨트롤과 gDNA의 1 µ g입니다.
	살 균 nuclease 무료 튜브에 cfDNA의 <ol><li>반응 버퍼, 효소 혼합, 30의 3 µ L의 추가 7 µ L ng ddH 2 O 60 µ L의 전체 볼륨에 추가. 별도 튜브에 위의 구성 요소를 추가 하지만 1 µ g의 cfDNA 대신 gDNA.</li>
		<li>믹스 고 65 ° C는 thermocycler에서 30 분가 열 하는 뚜껑 없이 다음 30 분 동안 20 ° C에 혼합물을 품 어. 다음 단계로 바로 진행.</li>
	</ol></li> <li>어댑터 결 찰 <ol><li>결 찰 마스터 믹스의 추가 30 µ L, 결 찰 증강의 1 µ L 및 단계 2.2에서에서 혼합물에 독특한 시퀀싱 어댑터 4 µ L.</li>
		<li>열 뚜껑 없이 thermocycler에 15 분 동안 20 ° C에서 품.</li>
		<li>자석 구슬 resuspend을 다음 단계 전에 적어도 30 분 동안 실내 온도에 비즈를 두고 소용돌이.</li>
		<li>이전에 언급 한 혼합물에 resuspended 자석 구슬의 87 µ L 추가; 아래로 pipetting으로 잘 혼합 하 고 5 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
		<li>단계 2.1에 설명 된 대로 세척 및 공기 건조 구슬.</li>
		<li>10 mm Tris HCl (pH 8) 20 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 대상 elute.</li>
	</ol></li> <li>농축의 DNA 파편 어댑터 출혈 <ol><li>추가 20 µ L 어댑터 출혈 DNA의 파편, 인덱스 뇌관/i 7의 5 µ L (2.5 µ L 뇌관-P7 (10 분) 및 시퀀싱을 위해 뇌관-P5 (10 분)의 2.5 µ L), 25µL의 라이브러리 증폭 마스터 믹스, 그리고 ddH 2 O 50 µ L의 총 볼륨.</li>
		<li>PCR 증폭 어댑터 출혈 DNA 및 열 주기 다음과 같습니다: 98 ° C 45에서 초기 변성 뒤 8 사이클 (cfDNA) 또는 4 사이클 (gDNA) 15 ° C에 어 닐 링의 s s, 30 위한 65 ° C s, 72 ° C 30에 대 한 s) 그리고 60 72 ° C에서 최종 확장 s, 다음 4에 온도 들고 ° c.</li>
		<li>일시 자석 구슬 획득된 파편을 PCR 농축 DNA의 추가 45 µ L.</li>
		<li>10 mM Tris HCl (pH 8)의 30 µ L에서 어댑터와 함께 elute DNA 조각.</li>
	</ol></li> <li>라이브러리 품질 관리 <ol><li>제조 업체에 따라 &#39; 어댑터를 측정 하는 상업 키트에 대 한 s 프로토콜 출혈 DNA 농도. DNA 품질을 결정 하는 bioanalyzer를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 3. 타겟 DNA 캡처 참고: 대상 농축 1021 kb 대상 농축 지역 12에서 알려진된 종양 관련 드라이버 돌연변이 취재에 대 한 특별히 설계 된-프로브 사용자 지정 시퀀스 캡처를 사용 하 여 수행한 종양의 종류입니다. 제조 업체에 대 한 수정 &#39; s 프로토콜 다음 단계에 자세히 나와 있습니다.
<ol><li>풀링 라이브러리의 차단 <ol><li>추가 1.5 µ g (cfDNA에 대 한 풀으로 라이브러리의 최대 수는 6, gDNA 20) 8 µ L P5 Block(100P), P7 Block(100P)의 8 µ L 및 침대 1 DNA의 5 µ L의 2 단계에서 (1 µ g / µ L) 무 균 튜브에. 60에서 설정 진공 집중 장치를 사용 하 여 튜브의 내용을 건조 ° c.</li>
	</ol></li> <li>DNA 캡처 라이브러리 조사 Hybridize.
	<li>3.1: 8.5 µ L 2 X 교 잡 버퍼, 교 잡 증강, 그리고 nuclease 무료 ddH 2 오의 1.8 µ L의 2.7 µ L의 단계에서 튜브를 구성 하는 다음 요소를 추가</li> 하는 <ol>
		<li>믹스를 위아래로 pipetting으로 하 고 10 분 동안 95 ° C에 thermomixer에서 품 어</li>
		<li>인큐베이션, 다음 즉시 사용자 정의 프로브의 4 µ L을 추가. 65 & # 17에서 열 cycler에서 샘플을 품 어6; 뚜껑이 있는 C 4 헤에 75 ° C에가 열</li>
	</ol></li> <li>DNA 조각 캡처 <ol><li>streptavidin 구슬 구슬 언바운드 DNA를 제거 세척 뒤 교배 대상 DNA를 품 어. 제조 업체에 따라 상업 키트를 사용 하 여 &#39; resuspended 구슬 캡처된 dna의 최종 20 µ L을 s 지침 조각.</li>
	</ol></li> <li>캡처된 DNA의 확대 조각 <ol><li>상업을 사용 하 여 수행 PCR 키트 2 µ M 백본 oligonucleotides, 제조 업체에 따르면 &#39; s 지침.</li>
		<li>때에 PCR 반응 완료, PCR 제품에 직접 정지 구슬의 45 µ L을 추가 하 고 10 mM Tris HCl (pH 8)의 30 µ L로 차입 하 여 구슬에 바인딩된 증폭된 대상 DNA 파편을 풍요롭게.</li>
	</ol></li> <li>라이브러리 정량화 키트와 함께 DNA 파편을 계량 하 고 Bioanalyzer ( 그림 2)에 의해 평균 조각 길이 결정.</li></ol>
 4. 시퀀싱 <ol><li>시퀀스 다중화 18 h. 총 데이터 생산은 최대 60 기가바이트 75 bp 짝 끝에서 실행 되는 벤치탑 시퀀서를 사용 하 여 라이브러리, 15 G는 컨트롤 샘플 gDNA 환자 샘플 cfDNA 및 1 G에 대 한 필요.</li></ol>
 5. 데이터 분석 워크플로 참고: 그림 3 일반 작업 흐름 및 데이터 분석 프로세스를 표시 합니다. 데이터 분석 매개 변수 및 명령을 다음과 같습니다.
<ol><li>고품질 읽기를 필터링 하 고 오류 및 NCfilter를 사용 하 여 UID의 수정. 
	NCfilter(own) NCfilter 필터-l 5-q 0.5-0.1 n-T 3-G-1 fastq1-2 fastq2 realSeq(own) 파이썬 빈/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2-o 출력 dir-p 접두사-u 4-s 7-m 3-i uidFile-f.</li>
	<li>참조 게놈 hg19 (인간 게놈 19), BWA (버전 0.7.12-r1039) 메모리를 사용 하 여 시퀀싱 결과 찾아서 게놈 분석 툴킷 (GATK) (버전 3.4-46-gbc02625)로 다시 맞춥니다. 
	bwa mem t-3 hg19 fastq1 fastq2 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g- Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-dbsnp 알려진 &#8212; 
	allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10-난 cancerBam-난 normalBam 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T IndelRealigner-R hg19-dbsnp 알려져 -allowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; targetIntervals 간격-난 cancerBam-난 normalBam</li>
	<li>UID와 기지 PCR/시퀀싱에 의해 도입 된 기본 품질 수정 오류 해결 서식 파일 조각의 위치에 따라 중복 클러스터. 
	realSeq(own) 파이썬 realSeq/빈/realSeq 클러스터-b unmarkdup_sort_merge.bam-r chipRegion-o output_dir-p -m 6를 접두사</li> <li>다시 정렬 BWA mem.에 의해 클러스터 중복 
	bwa mem t-3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>GATK (버전 3.4-46-gbc02625)를 사용 하 여 기본 품질 평가 점수에의 한 재 다음 로컬 재배치 수행. 
	Loacal 재배치: 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-알려진 dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10 -CancerBam-난 normalBam 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T IndelRealigner-R hg19-알려진 dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-targetIntervals 간격-난 cancerBam-난 normalBam 기본 품질 점수 재: 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar-T 병 BaseRecalibrator-R hg19-L targetRegion- knownSites dbsnp-knownSites 우주 allowPotentiallyMisencodedQuals-nct 10-나 bam-o grp 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar-T 자 PrintReads-난 bam-BQSR grp-o outbam-R hg19-nct 8-allowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>SNV (단일 뉴클레오티드 변형) 및 INDEL (작은 삽입 또는 삭제) 전화, 낮은 주파수 변이의 정확도 추가 확인 (좋은 지원 읽습니다) 발사 잔여물에 의해 둘 다 정방향 및 역방향 가닥 읽기 제어 그룹 (생식 돌연변이)와 초기 데이터베이스를 통해 여과 및 쌍. 
	realDcaller(own) 파이썬 realDcaller-f hg19-r chipRegion-C baselineDB-O L-2 cancerBam normalBam-p 30</li> <li>CNV (복사 번호 유사) 호출에 대 한 초기 샘플 컨트롤 사용. 
	NCcnv(own) 파이썬 NCcnv-o cnvdir-t tmpdir-r chipRegion cnv-normgt normalBam-tumgt cancerBam-repdb repeatMarsk</li> <li>Realigned 매핑되지 않은, 클립 및 SV (구조적 변화) 전화를 귀에 거슬리는 쌍 읽기. 
	NCsv(own) 파이썬 NCsv-t tmpdir-r hg19-o outputdir x-사본-w bwapath n-4 normalBam cancerBam</li></ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

그러나 순환 종양 DNA (ctDNA)의 존재는 ctDNA 분석의 응용 프로그램은 여전히 하지 일상적인 임상 연습에 30 여 년 전, 발견 되었다. CtDNA 검출 및 분석을 위한 기술 개발의 ctDNA 방법의 실용적인 응용 프로그램에 대 한 관심 증가 했다. 미세한 잔여 질병, 치료, 그리고 종양 진화와 intratumoral이13의 배경 아래 종양 분자 프로 파일에 대 한 응답의 평가 대 한 최소한-침략 적 접근을 제공 종양 모니터링 ctDNA 14. 향상 된 감도와 특이성 분석의 모든 이러한 응용 프로그램15,16을 촉진할 것 이다.
이 원고에 응급실-Seq, ctDNA 검출의 감도 향상을 목적으로 유망한 방법 예를 들어 NSCLC 케이스를 사용 하 여 시행 했습니...

차세대 시퀀싱 (NGS), 강력한 도구, 게놈의 신비를 조사 하는 유전 변경을 드러낼 수 있는 정보의 대량을 제공할 수 있습니다. 병원에서 NGS 분석의 응용 프로그램은 특히 맞춤된 의학에 대 한 더 일반적인 되고있다. 그러나 NGS의 가장 큰 한계 중 하나는, 높은 오류 비율입니다. 공부 상속 된 돌연변이 적합 하다, 비록 드문 돌연변이의 분석은 크게 제한1,2, 특히 "" 액체 생 검에서 얻은 DNA를 분석.
종양을 순환 DNA (ctDNA) 종양 세포에서 헛간 혈액 세포 무료 DNA (cfDNA) 이다. 대부분의 경우, ctDNA의 수량에서는 매우 낮은 하 게 하는 그것의 탐지 및 분석 매우 도전입니다. 그러나, ctDNA는 많은 매력적인 기능: 그것의 고립은 최소한 침략 적, 종양 성장의 초기 단계에서 검출 될 수 있다, 치료 효율성을 반영 하는 ctDNA 수준 및 ctDNA 기본 및 전이성 병 변에서 발견 DNA 변이 포함 3 , 4 , 5. 따라서, NGS 기술과 분석의 급속 한 발전을 감안할 때, ctDNA 검출 응용 되고있다 더 매력적.
다른 대규모 병렬 시퀀싱 방법 ctDNA 탐지를 위해 이용 되었습니다 있지만 이러한 방법 중 누구도 클리닉 그들의 제한 때문에 일상적인 사용 하기 위해 허용: 낮은 감도, 다양성의 부족 및 상대적으로 높은 비용6 ,,78. 예를 들어 이중 시퀀싱, 고유 식별자 (UID), 태그에 따라 반복적으로 대부분의 시퀀싱 오류 조정 합의 양방향으로에서 오류를 수정 합니다. 그러나,이 방법의 타당성은 그것의 높은 비용 및 낮은 데이터 활용9,10손실. 마찬가지로, CAPP-Seq 및 그것의 향상 된 반복, CAPP IDE11,12에 있는 큰 실용성 cfDNA 탐지 정확성과 이러한 방법의 개선이 필요 하지만.
정확한 ctDNA 탐지 및 분석에 대 한 현재 필요를 충족 시키기 위해 우리는 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq)는 새로운 전략을 개발 했다. 이 방법은 다음 결합: ctDNA 분자, 양방향 오류 수정와 중 단일 변이 구별 하는 기능을 효율적으로 복구 하 고유 시퀀싱 어댑터 &#62; 1 × 107 야생-타입 뉴클레오티드; 1021 kb 프로브 커버 대상 영역의 측정의 질을 높일 12 종양, 폐암, 대 장 암, 위 암, 유방암, 신장 암, 췌장암, 간 암, 갑 상선 암 등 종양 관련 돌연변이의 95% 자 궁 경부 암, 식도 암 및 자궁내 막 암 (표 1). 그리고 초기 데이터베이스 심사 하기가 효율적이 고 정확 하 게 ctDNA에 드문 돌연변이 검출 하기 쉽다.
초기 데이터베이스를 구축, 샘플 (처음 ~ 1000)의 같은 종류의 숫자에서 응급실-Seq에 의해 모든 유전자 돌연변이 찾아. 이 진짜 돌연변이 다른 여러 신뢰할 수 있는 검출 방법 및 분석 하 여 확인 해야 합니다. 다음, 거짓 변이의 패턴을 요약 하 고 초기 기준선 데이터베이스 구축 모든 거짓 돌연변이 클러스터. 계속이 데이터베이스에 후속 시퀀싱 실험에서 발견 하는 거짓 변이 추가 합니다. 따라서,이 기준선 데이터베이스 동적 확장된 데이터베이스, 시퀀싱 정확도 크게 향상 됩니다.
진행을 촉진 하 종양 진단 및 모니터링에서 우리는 응급실-Seq, 유니버설 데이터의 수집에 대 한 저비용이 고 실현 가능한 방법 제시. 우리 병원에서 희귀 한 돌연변이 및 사용에 대 한 타당성을 탐지 하기 위한 그것의 정확도 보여주는 수술 응급실-Seq 분석, 사례 연구를 제시.

<table><tbody><tr><td>QIAamp 순환 핵산 키트,</td><td>Qiagen</td><td>55114</td>, <td>cfDNA를 위한 말초 혈액에서 DNA 추출</td></tr>, <tr><td>QIAamp DNA 혈액 미니 키트,</td><td>Qiagen</td><td>51105</td>, <td>gDNA를 위한 말초 혈액에서 DNA 추출</td></tr><tr><td>, Quant-iT dsDNA HS 분석 키트</td><td>, Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>측정 cfDNA 농도</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR 분석 키트</td><td>, Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>측정 라이브러리 농도</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 시약</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>cfDNA 및 라이브러리 단편 측정</td></tr><tr><td>Illumina 용 NEBNext UltraII DNA 라이브러리 준비 키트</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>라이브러리 준비</td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect 시약</td><td>Beckman</td><td>B23317</td><td>DNA 단편 스크리닝 및 정제</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>해산</td></tr><tr><td>xGen 잠금 프로브</td><td>IDT</td><td>&mdash; &엠대시;</td><td>xGen 맞춤형 프로브</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>표적 DNA 캡처</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>표적 DNA 캡처</td></tr><tr><td>xGen Lockdown 시약</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>표적 DNA 캡처</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>캡처 후 PCR 농축 라이브러리</td></tr><tr><td>KAPA 라이브러리 정량화 키트</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>라이브러리 농도 측정</td></tr><tr><td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)</td><td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Centrifuge5810</td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>gDNA 농도 측정</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>Incubation</td></tr><tr><td>16-tube DynaMagTM-2 Magnet</td><td>Life</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator plus</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simpllyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 ctdna에서 희소 한 변이의 탐지

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여 종양 DNA (ctDNA) 순환의 분석 임상 종양학의 개발을 위한 유용한 도구가 되고있다. 그러나,이 방법의 응용 프로그램 때문에 혈액에 있는 ctDNA의 양을 추적 분석에서 낮은 감도 도전 이다. 또한, 메서드는이 시퀀싱 및 이후 분석에서 거짓 긍정 및 부정적인 결과 생성할 수 있습니다. 타당성과 병원에서 ctDNA 검색의 신뢰성을 개선 하기 위해, 여기 선물이 시퀀싱, 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq) 드문 돌연변이 풍요롭게 하는 기술. ER-Seq 유망한 도구 매우 낮은 주파수 유전 변경 감지를 하 게 하 고 따라서 질병 heterogenicity 공부에 매우 도움이 될 것입니다 1 x 107 야생-타입 뉴클레오티드에서 단일 돌연변이 구분할 수 있습니다. 고유한 시퀀싱 어댑터의 결 찰, 덕이 메서드 동안 오류 양방향으로 (감각과 antisense)에 대 한 동일한 시간 수정에 ctDNA 분자의 효율적인 복구를 수 있습니다. 덮어 대상 영역의 측정을 풍요롭게 하는 우리의 다양 한 1021 kb 프로브 12 종양에서 종양 관련 드라이버 돌연변이의 95%. 비용 효율적이 고 보편적인 방법이 유전자 데이터의 유일 하 게 성공적인 축적 수 있습니다. 효율적으로 배경 오류 필터링, 후 응급실-seq 정확 하 게 희귀 변이 검색할 수 있습니다. 사례 연구를 사용 하 여, 상세한 프로토콜 프로브 디자인, 도서관 건설, 대상 DNA 캡처 방법론, 데이터 분석 워크플로 포함 하는 동안에 시연 선물이. 일반적으로이 메서드를 수행 하는 과정 1-2 일 소요 됩니다.

ER-Seq에 사용 되는 풍부한 대상 지역 표 1에 나와 있습니다 1021 kb 프로브는 커버 12 일반적인 종양의 유전자 돌연변이의 95% 이상. 이러한 프로브의 광범위 암 환자의 대다수에 적용이 프로세스를 만든다. 또한, 우리의 독특한 시퀀싱 어댑터 및 기준선 데이터베이스 검사 가능 하 게 그것은 드문 돌연변이 정확 하 게 감지 하.
GDNA 및 주변 혈액에서 추출한 cfDNA의 다른 속성으로 인해 다른 악기 및 표 2에 표시 된 품질 컨트롤에 의해 결정 되는 데이터 품질의 범위가 있다. 성공적으로 추출 된 cfDNA ~ 170 bioanalyzer QC에 의해 분석으로 혈압과 그림 1</strong...

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

이 기술의 전반적인 목표는 순환 종양 또는 ctDNA에서 빈도가 낮은 돌연변이를 감지하여 임상 의사에게 종양을 진단하고 치료에 대한 반응으로 종양 역학을 모니터링할 수 있는 강력한 도구를 제공하는 것입니다. ctDNA를 검사하는 방법은 단일 핵형 변이, 삽입 삭제, 복제 수 변이 및 구조적 변이와 같이 환자가 어떤 종류의 돌연변이를 가지고 있는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 ctDNA에서 저주파 돌연변이를 정밀하게 검출하는 높은 민감도와 특이성입니다.절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Yuliang Yang입니다. 먼저 채취 튜브에 10ml의 말초 혈액을 채취하고 튜브를 위아래로 6-8회 부드럽게 뒤집어 내용물을 혼합합니다. 혈액 샘플을 채취 튜브에 넣어 섭씨 6도에서 37도까지 최대 72시간 동안 보관합니다.수집 튜브를 1, 600 회 g의 실온에서 10 분 동안 원심 분리하십시오. 그런 다음 폐기 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 튜브의 상층액 또는 혈장을 펠릿을 방해하지 않고 적절하게 라벨이 지정된 4개의 깨끗한 2밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 깨끗한 폐기 피펫을 사용하여 1ml의 셀을 적절하게 라벨링된 2mL의 원심분리기 튜브로 옮깁니다.게놈 또는 gDNA를 분리하기 전에 세포를 섭씨 영하 20도 이하에서 보관하십시오. 다음으로, 플라즈마를 섭씨 4도에서 1, 600배 g으로 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음 플라즈마를 플라즈마로 적절하게 표시된 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 오염을 방지하기 위해 바닥에 약 0.1ml의 잔류 부피를 남겨둡니다.버피 코트는 분리 과정에서 혈장에서 피해야 합니다. 그렇지 않으면 세포에서 추출한 큰 DNA 단편이 ctDNA를 희석시켜 검사의 민감도에 영향을 미칠 수 있습니다. 시판되는 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수집된 혈장 3ml에서 cfDNA를 분리합니다.그런 다음 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 200마이크로리터의 백혈구에서 gDNA를 분리합니다. 초음파 처리로 gDNA 대조군 샘플을 단편화하려면 깨끗한 초음파 처리 튜브에서 100 마이크로 리터의 Tris-EDTA 버퍼에 1 마이크로 그램의 gDNA 샘플을 준비하십시오. 초음파 처리 프로그램을 총 30분 동안 30주기 동안 12초 켜기 및 32초 끄기로 설정합니다.산물에 200 - 250개의 염기쌍 단편이 포함되어 있는지 확인한 후, 모든 단편화 산물을 150마이크로리터의 자성 비드가 들어 있는 새로운 1.5ml 튜브로 옮기고 5분 동안 샘플을 배양하여 올바른 단편을 선택합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 30초 동안 놓고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 튜브를 랙에 유지하면서 갓 준비한 200% 에탄올 80마이크로리터를 추가하여 비드를 세척합니다.상층액을 제거하기 전에 30초 동안 비드를 배양하고 세척을 반복합니다. 비드를 자연 건조시키기 위해 뚜껑을 열어 둔 상태로 튜브를 랙에 보관하십시오. 그런 다음 비드에 32마이크로리터의 10밀리몰 Tris-HCL을 첨가하여 DNA 단편을 용리시킵니다.제조업체의 지침에 따라 엔드 프렙 반응을 수행하려면 멸균 뉴클레아제가 없는 튜브에 7마이크로리터의 반응 완충액, 3마이크로리터의 효소 혼합물, 30나노그램의 cfDNA 및 2배 증류수를 총 60마이크로리터의 부피로 추가합니다. 별도의 튜브에 동일한 성분을 넣되 cfDNA 대신 1마이크로그램의 gDNA를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 20도의 열 순환기에서 30분 동안 배양한 다음 뚜껑을 가열하지 않고 섭씨 65도에서 30분 동안 배양합니다.배양 직후, 30 마이크로리터의 ligation master mix, 1 microliter inligation enhancer, 4 microliter의 unique sequencing adapter를 튜브에 추가합니다. 뚜껑을 가열하지 않고 섭씨 20도의 열 순환기에서 15분 동안 반응을 배양합니다. Vortex는 마그네틱 비드를 다시 현탁시키고 비드를 최소 30분 동안 실온에 둡니다.그런 다음 87마이크로리터의 부유한 마그네틱 비드를 ligation 반응에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합한 다음 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 비드를 세척하고 공기 건조한 후 20마이크로리터의 10밀리몰 Tris-HCL을 첨가하여 비드에서 DNA 표적을 용리합니다.20마이크로리터의 어댑터 결찰 DNA 단편, 5마이크로리터의 인덱스 프라이머 i7, 25마이크로리터의 라이브러리 증폭 마스터 믹스 및 총 부피 50마이크로리터까지 이중 증류수를 추가합니다. PCR은 어댑터 결찰 cfDNA 또는 gDNA를 증폭합니다. 그런 다음 45마이크로리터의 부유 마그네틱 비드를 PCR이 풍부한 DNA에 추가합니다.위아래로 피펫팅하여 샘플을 혼합하고 5분 동안 배양합니다. 상등액을 제거하고 비드를 세척한 후 30마이크로리터의 10밀리몰 Tris-HCL을 사용하여 어댑터로 DNA 단편을 용리합니다. 표적 DNA 캡처를 수행하려면 멸균 튜브에서 1.5마이크로그램의 풀링 라이브러리, P5 블록 100P 및 P7 블록 100P 각각 8마이크로리터, 마이크로리터 콕 1개당 1마이크로그램의 DNA 5마이크로리터를 추가하여 샘플을 차단합니다.섭씨 60도로 설정된 진공 농축기를 사용하여 튜브의 내용물을 건조시킵니다. 8.5마이크로리터의 2X 혼성화 완충액, 2.7마이크로리터의 혼성화 인핸서, 1.8마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 이중 증류수를 추가하여 DNA 캡처 프로브를 라이브러리와 하이브리드화합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 섭씨 95도의 써멀 믹서에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음 즉시 4 마이크로 리터의 맞춤형 프로브를 추가하십시오. 뚜껑을 섭씨 75도로 가열한 상태에서 섭씨 65도의 열 혼합기에서 샘플을 4시간 동안 배양합니다. 혼성화된 타겟 DNA를 스트렙타비딘 비드로 배양한 다음 비드를 세척하여 결합되지 않은 DNA를 제거합니다.제조업체의 지침에 따라 상업용 키트를 사용하여 캡처된 DNA 단편이 포함된 최종 20마이크로리터의 재현탁 비드를 얻으십시오. 스트렙타비딘 비드에서 결합되지 않은 DNA의 세척 단계는 빨라야 합니다. 그렇지 않으면 표적 DNA의 포획 효율에 영향을 미칠 수 있습니다.제조업체의 지침에 따라 두 개의 마이크로몰 백본 올리고뉴클레오티드가 있는 상용 키트를 사용하여 PCR을 수행하여 캡처된 DNA 단편을 증폭합니다. 마지막으로, 45마이크로리터의 현탁 비드를 PCR 산물에 직접 첨가하고 30마이크로리터의 10밀리몰 Tris-HCL로 용출에 의해 비드에 결합된 증폭된 표적 DNA 단편을 농축합니다. 단편을 정량화하고 텍스트 프로토콜에 따라 염기서열분석 및 데이터 분석을 수행합니다.이 표는 ER-seq가 기존 방법에 비해 커버리지 깊이를 23% 향상시키는 방법을 간략하게 설명합니다. 이는 cfDNA 분자의 효율적인 회수 덕분이며, 따라서 희귀 돌연변이의 분석을 크게 향상시킵니다. 또한 ER-seq에 사용되는 고유한 염기서열분석 어댑터를 통해 자연 복제와 PCR 유도 복제를 쉽게 구별할 수 있다는 점도 분명합니다.호출 결과에 대한 이 표에 자세히 설명되어 있듯이 ER-seq 기반 분석은 EGFR pL858R 검출에 대해 100% 일치했으며 기존 분석과 비교할 때 검출 빈도가 약간 더 높았습니다. 중요한 것은 ER-seq 분석을 통해 높은 배경 잡음으로 인해 기존 분석에서는 인식되지 않았던 EGFR pT790M을 포함한 다른 상대적으로 낮은 빈도의 돌연변이를 검출할 수 있었다는 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 48시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 추출, 라이브러리 준비 및 혼성화 후 bead wash 중에 매우 적은 양의 cfDNA가 손실되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 염기서열분석을 위해 식별된 고유한 항목을 기반으로 환자의 ctDNA를 수집, 준비 및 표적화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후, 이 기술은 액체 생검 분야의 연구자들이 임상적 결정을 내리는 데 있어 더 나은 방법을 모색할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

이 원고는 두 개의 차세대 염기서열분석 패널에 대한 임상 프로토콜을 설명합니다. 한 패널은 혈액학적 악성 종양을 조사하고 다른 패널은 고형 종양에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 유전자를 대상으로 합니다. 인간 악성 종양에서 드라이버 돌연변이의 분자 분류는 귀중한 예후 및 예측 정보를 제공합니다.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

Wild-type blocking PCR에 이어 직접 염기서열분석(direct sequencing)은 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 매우 민감하게 검출할 수 있는 방법을 제공합니다.

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

원고는 칩 기반 디지털 PCR 분석 결과를 신선한 냉동 정상에 드문 CDH1 사본 이체 (CDH1a) 및 위 암 환자에서 얻은 종양 조직 검출을 설명 합니다.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

여기에 제시된 것은 CD4 프로모터 근처의 이중 가닥 파단 복구와 관련된 돌연변이를 확인하는 데 사용할 수있는 sgRNA/CAS9 엔도뉴클레아제 및 차세대 시퀀싱 프로토콜입니다.

차세대 시퀀싱을 사용하여 CD4 프로모터 근처의 CAS9 유도 이중 가닥 파단의 복구와 관련된 돌연변이 확인

이 프로토콜은 비소세포폐암(NSCLC) 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 표적 가능한 게놈 변경을 검출하기 위한 자동화된 ISO15189 인증 차세대 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다.

차세대 시퀀싱을 사용한 비소세포폐암의 표적 변화 검출

학습하세요 ER-Seq 방법을 사용하여 ctDNA에서 희소한 변이를 정밀하게 검출하는 기술입니다. 이 기법은 양방향 오류 수정과 특수 배경 필터를 통해 높은 민감도와 특이도를 제공하여 암 진단 및 치료 반응 모니터링에 활용됩니다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

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