양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

이 절차의 전반적인 목표는 생리학적으로 관련된 3D 환경에서 포유류의 세포 분열 및 세포 매트릭스 상호 작용을 연구하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 포유류의 세포 분열 및 세포 매트릭스 상호 작용을 연구하기 위한 효율적이고 일반적인 접근 방식을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 정상 조직 및 질병 조직 발달의 분자적 기초와 같은 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

transfection 하루 전, 100ml 세포 배양 접시에 500만 개의 HEK-293 T 세포를 10mL의 일반 세포 배양 배지 10ml에 플레이트화합니다. 이 세포를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다. transfection을 시작하기 직전 다음날, 섭씨 4도에서 transfection 시약의 바이알을 제거하고 실온에 도달할 때까지 방치합니다.

그런 다음 시작하려면 1ml의 환원된 혈청 배지를 멸균 마이크로fuge 튜브에 추가합니다. 여기에 transfection에 사용되는 지정된 양의 lentiviral vector plasmid를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다.

5분 후, 48마이크로리터의 transfection 시약을 이 튜브에 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그 후, 이 혼합물을 실온에서 최소 15분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 인큐베이터에서 HEK-293 T 세포가 있는 플레이트를 제거합니다.

준비된 DNA transfection 시약 혼합물을 세포에 현명하게 떨어뜨리고 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 플레이트가 균일하게 분포되도록 합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다. transfection 약 6시간 후 플레이트를 제거하고 배지를 흡입합니다.

10ml의 신선한 배양 배지를 추가하고 플레이트를 다시 인큐베이터로 옮깁니다. transfection 후 24시간, 48시간 및 72시간의 여러 시점에서 렌티바이러스 입자를 포함하는 배양 배지를 별도의 튜브에 넣어 수확합니다. 다음으로, 수집된 배양 배지를 멸균 0.45미크론 필터를 통해 여과하여 세포 파편을 제거합니다.

각 수확 후 신선한 배양 배지로 교체하십시오. 렌티바이러스 입자를 함유한 여과액은 즉시 형질도입에 사용하거나 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 인간 유방암 세포 MDA-MB-231을 일반 배양 배지의 35mm 배양 접시에 플레이트화합니다.

이 세포를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 다음날, 플레이트에서 배양 배지를 흡인하고 1 밀리리터의 렌티 바이러스 입자와 1 밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가하십시오. 약 16시간 동안 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

바이러스 입자를 사용한 배양이 완료된 후 플레이트를 제거하여 배지를 흡인합니다. 그런 다음 2ml의 새 배지를 넣고 24-72시간 동안 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 이러한 형질도입된 세포에서 H2B-mCherry의 발현을 상형형광 현미경을 사용하여 확인합니다.

동기화 실험을 시작하기 위해 24웰 플레이트에서 50-60% 포화도로 H2B-mCherry를 발현하는 첫 번째 플레이트 MDA-MB-231 세포를 만듭니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 배양 배지를 2 밀리몰 티미딘을 함유 한 0.5 밀리리터의 배지로 교체하십시오.

플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 그대로 두십시오. 배양이 완료되면 PBS로 세포를 세 번 세척하여 Thymidine 처리에서 세포를 방출합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 5시간 동안 0.5ml의 일반 배양 배지에 세포를 그대로 둡니다.

그 후, 유사 분열에서 이러한 세포를 차단하려면 배양 배지에 Nocodazole을 첨가하십시오. 세포를 인큐베이터에 12시간 동안 그대로 두십시오. 노코다졸 치료가 완료된 후 플레이트를 꺼내 궤도 셰이커를 사용하여 45초에서 1분 동안 세포를 흔들어 유사분열 세포를 방출합니다.

그 후, 추출된 유사분열 세포를 포함하는 배지를 새로운 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 각 웰에 0.5ml의 새 배지를 추가합니다. 그 후, 세포의 흔들림과 추출을 두 번 더 반복하십시오.

수집된 총 배지를 풀링한 다음 원심 분리하여 유사분열 세포를 펠릿화합니다. 스핀 후, 세포 펠릿을 0.25 밀리리터의 신선한 세포 배양 배지에 재현탁시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포의 수를 세십시오.

이 단계를 시작할 때 50ml의 10x DMEM 용액을 준비하고 필터 멸균합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 지정된 대로 3D 콜라겐 매트릭스를 만드는 데 사용될 모든 구성 요소의 부피를 결정합니다. 이 모든 성분을 얼음에서 미리 식혀 콜라겐의 겔화를 늦춥니다.

이제 미리 냉각된 1.5ml 원심분리기 튜브에 10x DMEM, FBS, 탈이온수, 콜라겐 및 마지막으로 수산화나트륨 매체에 필요한 수의 세포를 추가합니다. 1ml 피펫을 사용하여 조심스럽게 섞습니다. 용액이 잘 혼합되면 500마이크로리터의 혼합물을 24웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

24웰 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 30분 후 플레이트를 꺼내 젤 위에 예열된 배양 배지 500마이크로리터를 추가합니다. 이미징하기 전에 위상차 및 컨포칼 현미경의 라이브 셀 단위를 켭니다.

분열하는 세포를 캡처하려면 콜라겐 매트릭스에 내장된 세포가 포함된 24웰 플레이트를 형광 현미경의 살아있는 세포 장치에 배치합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 플레이트의 바닥을 찾은 다음 현미경이 플레이트 바닥에서 약 500마이크로미터에 초점을 맞출 때까지 위로 이동합니다. 스테이지를 이동하여 유사분열의 여러 단계에 있는 세포를 찾고 이미징을 위한 여러 위치를 선택합니다.

2분 간격으로 타임랩스 실험을 설정합니다. 다음으로, 콜라겐 네트워크를 이미지화하기 위해 488 나노미터 레이저에서 반사된 빛만 캡처하도록 컨포칼 현미경을 구성합니다. 그런 다음 콜라겐 매트릭스의 세포를 포함하는 플레이트를 이 현미경의 살아있는 세포 장치에 놓습니다.

플레이트의 바닥을 찾은 다음 플레이트 바닥에서 약 100마이크로미터에 초점을 맞출 때까지 대물 렌즈를 위로 움직입니다. 스테이지를 움직여 세포를 찾고 이미징을 위한 여러 위치를 선택합니다. 5분 간격으로 타임랩스 실험을 설정합니다.

콜라겐 매트릭스에 내장된 MDA-MB-231 세포를 발현하는 분열하는 H2B-mCherry의 형광 이미지가 여기에 나와 있습니다. 유사분열의 여러 단계가 예상대로 쉽게 관찰됩니다. 컨포칼 반사 현미경을 사용하여 동시에 시각화된 흰색 콜라겐 섬유의 분포는 유사분열 과정에서 거의 변하지 않습니다.

세포가 동기화된 G2-M 단계와 콜라겐 매트릭스에 내장되어 처음 2시간 내에 세포 분열을 완료하는 반면 대조군 비동기 세포는 무작위로 분열합니다. 간기(interphase) 및 유사분열(mitotic phase) 동안 콜라겐 섬유의 분포를 정량화한 것은 세포 분열 중에 매트릭스 변형이 최소화되고 간기 세포에서 더 높다는 것을 시사합니다. 이 기술을 완전히 익히면 안정적인 세포주 생성부터 3D 매트릭스의 비디오 세포 분열 분석까지 7일 만에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 라이브 셀 이미징을 사용하여 3D 매트릭스에서 포유류 세포 분열을 동기화하고 모니터링하는 방법과 컨포칼 반사 현미경 및 정량적 이미징 분석 기술을 사용하여 매트릭스 변형을 결정하는 방법을 잘 이해하게 되었기를 바랍니다.