Name: 양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 학습하세요 3D 콜라겐 매트릭스에서 포유류 세포 분열을 동기화 및 실시간 영상으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 세포-기질 상호작용과 조직 발달 및 질병 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01CA174388 및 U54CA143868를 부여. 저자는 PURA 수상 웨이 통 첸의 지원에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 인정 하 고 싶습니다. 이 자료는 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 보조금 번호 1232825 아래에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.

제공 하는 프로토콜의는 홈 우드 기관 검토 위원회 (HIRB) 지침을 따릅니다.
1. 안정적인 표현의 H2B mCherry 마커로 세포 유사 분열에 대 한
<ol><li>
인간 미 발달 신장 293T에서에서 lentiviral 입자 (HEK 293T)의 세포
	<ol>
<li>HEK 293T 세포 세포 배양 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 포함 된 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 1%에에서 106 셀/접시 x 5의 밀도에서 10 cm 세포 문화 접시에 접시 페니실린-스 (펜/Strep)). 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 24 h에 대 한 품 어. Transfection 당일 셀의 원하는 confluency 약 70-80% 이다. 참고: HEK 293T 세포는 여기 사용 됩니다 나중 transduce MDA-MB-231 셀을 안정적으로 H2B mCherry 표현 셀 라인을 생성 하려면 바이러스 입자를 생산 하는 데 사용 됩니다. 셀은 접시에 걸쳐 고르게 분포 하 고 있는지 확인 합니다. 셀의 추가 삭제 플레이트, 현명 하 고 부드럽게 이동 뒤로 앞 접시 분산에 도움이 될 수 있습니다. 셀 또는 바이러스 성 입자의 다른 볼륨의 컬렉션 귀 착될 것 이다 다른 크기의 플라스 크에 시드할 수 있습니다.</li>
		<li>Transfection 시 약을 사용 하 여 3 개의 플라스 미드 (lentiviral 벡터, CMV ΔR 8.91, 및 pMDG-VSVG)와 HEK 293T 세포 transfect H2B mCherry 인코딩 플라스 미드 lentiviral 벡터 phosphoglycerate 키 발기인 (PGK)에서 복제 됩니다. CMV ΔR 8.91 3 필수 HIV 유전자, 개 그, 폴및 회전을 포함합니다. pMDG-VSVG VSV G 봉투 유전자를 포함 되어 있습니다. 참고: 여러 transfection 에이전트에서 선택할 수 있습니다.<ol>
<li>Transfection 시 약 실 온 (RT) 도달의 유리병 사용 하기 전에 수 있습니다. 반전 또는 소용돌이 짧게 유리병입니다.</li>
			<li>H2B mCherry 플라스 미드의 6 µ g, CMV ΔR 8.91의 8 µ g의 감소 된 혈 청 미디어의 1 mL에 pMDG-VSVG, 2 µ g으로 구성 된 DNA의 믹스 16 µ g. 5 분에 대 한 RT에서 품 어. 참고: 금액 및 3 개의 벡터의 비율은 다양 하 고 다른 lentiviral 전송 벡터에 대 한 최적화.</li>
			<li>48 µ L 추가 (DNA의 1:3 비율을 사용 하 여: transfection 시 약) 위의 DNA 솔루션으로 transfection 시 약의 다음 RT에 적어도 15 분 동안 품 어 고. 참고: transfection 시 약 대 DNA의 비율은 다양 하 고 다른 lentiviral 전송 벡터에 대 한 최적화. Transfection 시 약 1.5 mL 원심 분리기 튜브의 측면을 연결 하지 못한 다는 것을 확인 하십시오.</li>
			<li>셀에 drop-wise 단계 1.1.2.3에서에서 만든 DNA 지질 복잡 한 솔루션을 추가 합니다. 부드럽게 접시에 복잡 한의 동등한 배급을 보장 하기 위해 플레이트를 소용돌이 친다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transfection, 후 대략 6 h 매체를 발음 하 고 신선한 세포 배양 매체 추가 (DMEM과 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 1% 펜/Strep).</li>
		<li>표면에 뜨는 24, 48, 및 72 h 후 transfection 수확. 각 수확 후 매체를 대체 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당, 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).</li>
		<li>세포질 파편을 제거 하는 0.45 μ m 필터를 통해 lentiviral 입자를 필터링 합니다. 또는, 세포 파편 분리 하 상쾌한 아래로 회전 합니다. 상쾌한 변환, 바로 사용할 수 있습니다 또는-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀의 세대 라인 안정적으로 표현 H2B-mCherry 참고:이 프로토콜은 MDA-MB-231 셀에 대 한 세부 사항에 설명 되어 있습니다. 실험에 사용 하기 전에 인간의 유 방 암 세포 MDA-MB-231 (물리 과학 종양학 센터, NIH) 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 포함 된 DMEM에 교양 펜/Strep.<ol>
<li>35 mm 문화 접시에 1 x 105 셀의 밀도에서 MDA-MB-231 셀 접시 참고: 다른 셀 라인에 대 한 도금의 밀도 최적화 해야 하 고 따라서 MDA-MB-231 셀에 대 한 최적의 밀도에서 다를 수 있습니다.</li>
		<li>셀, 도금 후 24 h 1 mL 신선한 매체의 1 mL 및 바이러스의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).</li>
		<li>하룻밤에 6 h의 시간 동안 세포를 품 어. 참고: 바이러스의 외피 시간 모두 볼륨 다른 세포에 최적화 될 필요가 있다. 예를 들어, 셀 보이지 않는 건강 한 바이러스의 추가 후에 몇 시간, 바이러스 및 2 mL 신선한 매체의 1 mL 사용 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 단계 1.2.2. 1.2.3 단계에서 부 화 시간 또한 줄어들 수 있습니다.</li>
		<li>매체를 발음 하 고 10 mL 신선한 매체의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep). 37 ° C, 5% CO2에서 24 ~ 72 시간 사이 품 어.</li>
		<li>H2B-mCherry epifluorescence 현미경을 사용 하 여 셀에 식을 확인 합니다. 참고: 변환 효율 셀에 낮은 경우에, 단계 2.2에서에서 바이러스와 단계 2.3에서에서 보육 시간 볼륨 수 증가.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 안정적으로 H2B mCherry을 표현 하는 세포의 동기화
<ol><li>50 ~ 60 %confluency, 즉 플레이트 2 x 104 MDA-MB-231에서 셀 24-잘 접시의 각 음에 세포 격판덮개.</li>
	<li>24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 문화를 품 어.</li>
	<li>매체의 0.5 mL에 성장 매체를 바꿉니다 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 2mm 티 미 딘을 포함 하 고 24 시간에 대 한 인큐베이터에서 두고. 참고: 셀에 티 미 딘 노출 세포 성장 (G1)의 단계에서 체포 / DNA 합성 (S) 전환 및 DNA 종합의 금지로 인해 S 단계에 걸쳐. 보육 시간 다양 하 고 다른 셀 라인에 대 한 최적화 해야 합니다.</li>
	<li>티 미 딘 노출에서 셀을 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 세 번 그들을 세척 하 여 놓습니다. 다음, 정상적인 세포 배양에 있는 셀을 품 어 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep) 5 h. 참고: 티 미 딘 노출에서 셀의 릴리스 수 있습니다 세포 성장 (G2)을 진행 하는 세포/셀 mitotic (M) 단계 이전 g 1/S 단계에서 체포 하 고는 S에서 체포 이전 셀에 대 한 g 1 단계로 단계. 출시 시간 다양 하 고 다른 셀 라인에 대 한 최적화 해야 합니다.</li>
	<li>12 h에 대 한 nocodazole의 250 ng/mL로 세포를 차단 합니다. 참고: 모든 nocodazole에 노출 셀 G2/M 단계에서 체포 됩니다. Nocodazole은 세포 독성. Nocodazole에 장기간된 노출은 apoptosis를 발생할 수 있습니다. 세포 죽음은 관찰 하는 경우 기간 또는 다른 세포에 대 한 노출의 농도 조정 합니다. 성공적으로 동기화 되는 셀 구형 형태를 전시할 것 이다.</li>
	<li>45에 대 한 셀을 흔들어 s 궤도 셰이 커를 사용 하 여 150 ~ 200 rpm에서 1 분. 참고: 있는 기판에 작은 부착, Mitotic 세포 됩니다 수 동요 과정에서.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 매체를 pipetting으로 세포를 추출 하는 매체를 제거 한 다음 0.5 mL 신선한 매체의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 격판덮개의 각각 잘.</li>
	<li>2.6 및 2.7 3 번 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>3 분 동안 800 x g에 mitotic 세포를 포함 하는 수집된 매체 원심 참고:이 단계는 셀 매체에서는 nocodazole를 제거 하는 데 사용 됩니다.</li>
</ol>3. 법인은 동기화의 세포는 콜라겐으로 나 행렬
참고: 유형 I 교원 질은 인간의 신체에서 가장 풍부한 단백질의 결합 조직 ECM에 따라서은 널리 사용 되 고 함수는 3D 환경17,23,24에 의해 변조는 어떻게 진 핵 세포를 조사 하 . 콜라겐은 초 산에 용 해. 중화 후 20-37 ° c 콜라겐 솔루션 온난화, 콜라겐 단위체 교원 질 소의 meshwork에 유해.
<ol><li>DMEM 분말, 나트륨 중 탄산염 (NaHCO3)의 3.7 g, 증류수 50ml에 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)의 1 g의 패킷을 용 해 하 여 10 x DMEM 솔루션을 준비 합니다. 다음 증류수 50 mL 펠 릿 NaOH 2g을 용 해 하 여 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)의 준비 및 솔루션을 필터링 합니다. 필터 하 고 약 1.5 mL 원심 분리기 관으로 수. 참고: 일반 DMEM 솔루션이이 단계에서 사용할 수 없습니다. 콜라겐 솔루션의 중요 한 볼륨의 추가 매체를 희석 것 이다. 따라서 집중된 DMEM 솔루션 콜라겐 매트릭스에서 DMEM의 최종 농도 정상 DMEM 동일 될 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>세포 단계 2.9에서에서 수집한와 함께 작동 하도록 계속 합니다. 매체, 그리고 중단 다시 셀에 약 0.25-0.5 mL 신선한 세포 배양 매체의 발음 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep). 참고: 콜라겐 매트릭스에 특정 세포 밀도 도달 하는에 셀의 초기 밀도 수 없습니다 너무 낮은. 따라서, 다시 셀을 일시 중단 하는 데 사용 하는 매체의 볼륨 사용할 수 있는 셀의 총 수에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>Hemocytometer를 수 용액에 셀의 밀도에 3.2 단계에서 다시 정지 셀 솔루션의 장소 10 µ L.</li>
	<li>
3D 콜라겐 매트릭스 수 있도록 모든 구성 요소에 필요한 볼륨을 결정 합니다. 500 µ L 2 µ g / µ L 콜라겐 젤의 사용 예를 들어 여기.
	<ol>
<li>40, 000 셀/mL (또는 콜라겐 젤의 500 µ L에 대 한 20000 셀)을 얻는 데 필요한 셀 솔루션의 볼륨을 계산 합니다. µ L에이 숫자는 X. 50 µ L 10 x DMEM 필요 하 게 됩니다. FBS의 50 µ L은 필요 합니다.</li>
		<li>콜라겐 나 재고 필요한 볼륨을 계산 합니다. 콜라겐의 농도 4 µ g / µ L 주위입니다. µ L에 필요한 콜라겐의 양은 Y 이다.</li>
		<li>수산화 나트륨의 볼륨 콜라겐 솔루션에 아세트산을 중화 하는 데 필요한 계산: Y µ L 콜라겐 * 0.023 * 1000 = Z µ L NaOH 필요.</li>
		<li>필러 솔루션의 볼륨을 결정: (500 µ L 총 젤-X µL 셀-50 µ L 10 DMEM-FBS의 50 µ L-Y µ L 콜라겐-Z µ L X NaOH) = R µ L 참고: 필러 솔루션은 증 류 물. 계산된 볼륨 필러 솔루션의 음수 이면 세포 현 탁 액에서 원래 셀 밀도 너무 낮습니다. 셀 다시 스핀 다운을 다시 작은 양의 중간에 중단 해야 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).</li>
	</ol>
</li>
	<li>깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 다음과 같은 순서로 구성 요소를 추가: 매체, 콜라겐, NaOH, 이온된 (DI) 수, FBS, DMEM x 10에에서 셀. 콜라겐 솔루션의 겔 화를 감속 하는 얼음에 모든 구성 요소를 배치 합니다. 적절 한 pipetting 기술을 사용 하 여 거품의 형성을 방지.</li>
	<li>NaOH를 추가 후 1 mL를 피펫으로와 솔루션을 신중 하 게 섞는다. 참고: 콜라겐의 겔 화 시작 됩니다 오른쪽 NaOH의 추가 직후. 혼합 신중 하 고 신속 하 게 수행 되어야 합니다.</li>
	<li>일단 솔루션은 잘 혼합 하 고, 24-잘 접시의 각 음을 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다. 37 ° C 배양 기에서 24-잘 접시를 놓습니다. 37 ° C 물 목욕에 신선한 세포 배양 매체를 배치 합니다. 참고: 플라스틱 바닥 접시는 렌즈의 거리는 1 mm. 유리 바닥 고배율 라이브 셀 현미경 높은의 짧은 거리 때문에 사용 되는 접시 위에 낮은 확대 라이브 셀 microcopy 사용 됩니다. 확대 렌즈입니다.</li>
	<li>미리 데워 진된 매체의 500 µ L 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep) 젤 3.7 단계를 완료 한 후 30 분의 상단에.</li>
</ol>4. 라이브 셀 이미징 3D 콜라겐 매트릭스 (낮은 배율)에 분할 하는 세포의
참고: 셀의 이미지는 10 X 목표 및 이미징 소프트웨어에 의해 제어 위상 대비 현미경에 장착 된 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여 2 분 간격으로 수집 됩니다.
<ol><li>대물 렌즈 위에 탑재 라이브 셀 단위를 켭니다. 안정화 될 때까지 온도 37 ° C에서, CO2 농도 5%에 습도 75%에서 기다립니다.</li>
	<li>현미경에 라이브 셀 단위로 젤 24-잘 접시를 넣어. 접시의 바닥을 찾아 이동한 다음 목표 렌즈까지 현미경 접시의 바닥에서 약 500 µ m에 초점을 맞추고 있다. 참고: 셀 콜라겐 매트릭스에 너무 가까이 있는 접시의 바닥에 완전히 3D 매트릭스에 포함 되지 않습니다. 접시의 아래쪽에서 500 µ m 세포 이미징 하는 것은 셀 가장자리 효과16,,1725에 의해 영향을 받지 않습니다 것을 보장 합니다.</li>
	<li>찾을 셀, 무대 주위를 이동 하 고 이미징에 대 한 여러 위치를 선택 합니다.</li>
	<li>시간 경과 실험 2 분 간격을 설정 합니다. 참고: 위치 2 분 간격 동안 수행할 수 있는 최대 수는 전동된 스테이지의 움직이는 속도 이미지 캡처에 대 한 노출 시간의 길이 의해 제한 됩니다.</li>
</ol>5. 콜라겐 네트워크 변형 세포 분열 (고배율 현미경) 동안
<ol><li>대물 렌즈 위에 탑재 라이브 셀 단위를 켭니다. 안정화 될 때까지 온도 37 ° C에서, CO2 농도 5%에 습도 75%에서 기다립니다.</li>
	<li>흠 없는 3D 콜라겐 매트릭스에 콜라겐 섬유를 시각화 하려면 반사 빛 (488 nm)의 샘플을 밝게 하는 데 사용 하는 488 nm 레이저에서 잡으려고 공초점 현미경을 구성 합니다. 레이저 사용 하 여 물 집중 목표, 나 X 60 = 1.2, WD = 200 µ m 및 이미징 소프트웨어에 의해 제어 됩니다.</li>
	<li>라이브 셀 단위로 샘플 (콜라겐 매트릭스 셀)을 넣어. 접시의 바닥을 찾아 이동한 다음 목표 렌즈까지 현미경 접시의 바닥에서 약 100 µ m에 초점을 맞추고 있다. 접시의 아래쪽에서 100 µ m 세포 이미징 하는 것은 셀 가장자리 효과 의해 영향을 받지 않습니다 것을 보장 합니다. 참고: 여기 물 침수 목표 사용 됩니다 기름 침수 렌즈 대신 기름 침수 렌즈의 작동 거리는 약 100 µ m만 하기 때문에. 기름 침수 렌즈의 사용으로 접시의 바닥에 유리의 두께 일반적으로 약 100 µ m 문제가 포즈지 않습니다.</li>
	<li>찾을 셀, 무대 주위를 이동 하 고 이미징에 대 한 여러 위치를 선택 합니다. 참고: Confocal 현미경 광학 샘플 섹션 및만 초점면에서 신호를 캡처. 라이브 셀 시간 경과 실험 기간 동안 초점 밖으로 이동 될 수도 있습니다. 시간의 오랜 기간 동안 셀 이미지를 캡처 수 있도록, Z-스택 5 µ m 간격 연속 분할 영역에서 이미지를 수집 하는 데 사용 됩니다. 25 µ m에 걸친 5 조각의 총 몇 군데 있습니다.</li>
	<li>5 분 간격으로 시간 경과 실험을 설정 합니다. 참고: 5 분 사용 됩니다 대신 형광 H2B mCherry, 반사, 콜라겐에 대 한 검색 및 Z-스택 스캔에 대 한 검색을 포함 하 여 여러 스캔 모드, 각 위치에 적용 됩니다 때문에 섹션 4에서에서 사용 되는 2 분 간격으로 여기. 여러 스캔 모드를 사용 하 여 낮은 확대 영상에 비해 위치 검색의 속도 감소 시킨다.</li>
	<li>계량 이미징 하위 픽셀 해상도20velocimetry (PIV) 입자를 사용 하 여 해당 셀에 의해 발휘 된 힘으로 인해 셀 주변 콜라겐 매트릭스의 변형. H2B mCherry 신호 콜라겐 섬유 모두의 명확한 시각화 2D 이미지에서이 분석을 수행 할 수 있습니다. 이방성 낮은 통과 콜라겐 네트워크20의 신호를 향상 시키기 위해 필터링을 적용 합니다.</li>
	<li>K+ 1 프레임, 15 × 15의 지역 창 추출 프레임에서에서 (x,y)에 있는 관심의 하위 이미지 영역의 로컬 변위를 측정 하기 위해 픽셀 프레임 k에서 (x,y)에 중심으로. 다음 가장 일치 하는 (x,y) 위치 식별 * 프레임 k+ 1에서 얻은 이미지에 최대 정규화 된 교차 상관 계수 기능 위치를 통해. 변형 벡터 (x,y)로 계산 됩니다 *-(x,y).</li>
</ol>

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<li>Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+biomolecular+diffusion+in+extracellular+matrix+condensed+by+fibroblasts+using+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy.</a> PLoS One. 8 (11), e82382(2013).</li>
<li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+convection+in+collagen+gels%3A+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li>
<li>Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+effect+of+cancer+invasiveness+and+collagen+concentration+on+3D+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling.</a> PLoS One. 6 (9), e24891(2011).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

3d에서 세포 분열의 이전 연구 실험 제한 및 기술 과제18,19효율적인 아니었다. 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열의 효율적인 연구를 위한 중요 한 단계는: (1) 셀;에 mitotic 마커 형광 표시 관 (2) 세포 분열;의 동기화 (3) 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경 검사 법, 양적 이미지 분석을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링.
2D 기판에 mitotic 세포는 그들의 형태에 따라 interphase 셀에서 구별 될 수 있다, 즉, mitotic 세포는 원형 interphase 세포 밖으로 확산 하 고 기판에 단단히 부착 기판에 간신히 연결. 그러나 3 차원 행렬에서, 세포 형태학 mitotic 세포에 대 한 신뢰할 수 있는 마커 간신히 밖으로 확산 하는 일부 셀부터 이며 매트릭스<sup class="xre...

세포 유사 분열의 규제 조직 및 장기 개발에 중요 한 역할 세포 인생에서 중요 한 이벤트입니다. 비정상적인 유사 분열은 자연 유전 변이, 인간의 노화 과정과 암1,2,3,,45의 진행에 연루 됩니다. 정상 세포와 비교 하는 종양 세포의 증식의 증가 속도 사실 셀 동작 종양의 종류 및 환자 중 에서도 상당히 이질적인에 불구 하 고 암의 특징 중 하나입니다. 유망한 임상 결과도 불구 하 고 일부 새로 개발 된 antimitotic 약물 임상 시험6,7,,89,10 에에서 효과가 표시 되지 않은 11. 실험 및 전 임상 모델의 관련성 고려 될 수 있다. 많은 유형의 정상 포유류 및 암 세포 섬유 아 세포와 콜라겐-풍부한 3D 결합 조직, fibrosarcoma 셀과 전이성 암 세포는 3D stromal 세포 외 기질 (ECM)에 같은 3 차원 (3D) 행렬에 나눕니다. 그러나, 포유류 세포 분열 실험 및 분석의 대다수가 2 차원 (2D) 기판에 경작 하는 세포에 수행 되었습니다. 미세, 기계적 특성, 및 두 정상과 pathologic 조직12,,1314, 의 3D ECM의 생 화 확 적인 신호 설계 3D 매트릭스 정리 더 수 15,,1617.
어떻게 포유류의 세포 연구 규제 차원에서 환경 생리 관련성 및 치료 중요성18,19도 불구 하 고 크게 미개척 남아. 가능한 이유는 기술적인 어려움 및 3D 매트릭스에서 세포 분열을 공부와 관련 된 실험 과제 포함 됩니다. 세포의 유사 분열 전체 세포 주기20에 극히 일시적인 구성합니다. 이전 작업을 인간 유 방 선 암 MCF-7, 인간의 다리 U2OS, 그리고 인간의 간 같은 많은 포유류 세포의 확산 속도 보이고 있다 HepG2에 훨씬 낮은 3D 매트릭스 2D 기판21에 그들의 대조 물과 비교 22. 또한, 세포 3D 매트릭스에 포함 된 라이브 셀 이미징 동안 초점 밖으로 이동 합니다. 이러한 모든 요소는 이미징 기술을 사용 하 여 3D 문화에서 세포 분열 이벤트 캡처의 매우 낮은 효율에 기여.
세포와 ECM 사이 상호 작용 세포 분열 조절에 중요 한 역할을 재생 합니다. 여기, 우리는 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 효율적으로 공부 하는 방법을 설명 합니다. 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 뿐만 아니라 세포, 세포 분열의 동기화 mitotic 마커의 포함 하는 메서드 및 양적 이미징 분석입니다. 형광 표시 된 히스톤 단백질 H2B mitotic 차별화 및 interphase 셀 표식으로 셀에 처음 소개 된다. 다음 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 세포는 직접 3D 콜라겐 매트릭스에 캡슐화 됩니다. 여러 셀의 세포 분열 이벤트 낮은 확대 경과 라이브 셀 이미징에 효율적으로 사용 하 여 모니터링 됩니다. 세포-매트릭스 상호 작용은, 콜라겐 섬유의 변형 고배율에서 반사 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 모니터링 됩니다.
우리가 감시 하 고 세포-매트릭스 상호 작용 하는 동안과 이후, 이전 두 개의 전이성 암 세포 선, 인간의 침략 적인 ductal 암 MDA-MB-231 및 3D 콜라겐에서 인간의 fibrosarcoma HT1080 세포의 유사 분열을 계량이 기술을 사용한 이전 행렬19. 여기에 제시 된 방법 3D 환경과 세포-매트릭스 상호 작용에서 모두 포유류 세포 분열을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근을 제공 합니다. MDA-MB-231 셀 라인 종이 걸쳐 예제로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 정상 조직과 질병, 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 하 고 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인간 배아 신장 293T</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>물리 과학 종양학 센터, NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 분말</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 100X</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>Life technologies</td><td>11668-07</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 벡터에서 H2B-mCherry 인코딩</td><td>플라</td>스<td>미드 Addgene plasmid 21217</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>GibcoBRL</td><td>11810-025</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113375-100</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐</td><td>코닝</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>JT Bake</td><td>3722-01</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV 주사기 필터 장치, 0.45-&mu; m, PVDF, 33mm</td><td>Millipore</td><td>SLHVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000E 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>TE2000E</td><td></td></tr><tr><td>Cascade 1K CCD 카메라</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>A1</td><td></td></tr></tbody></table>

양적 confocal 반사 현미경을 통해 3d 매트릭스에 포유류 세포 분열

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

어떻게 포유류의 세포 연구 규제는 3d 환경 크게 그것의 생리 적인 관련성 및 치료의 중요성에도 불구 하 고 미개척 남아. 탐험의 부족에 대 한 가능한 이유는 실험 제한 및 비효율적인 3D 문화에서의 세포 연구를 렌더링 하는 기술적 과제 이다. 여기는 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 상호 작용 3D 콜라겐 매트릭스에 효율적으로 공부 하는 영상 기반 방법에 설명 합니다. 형광 H2B 표시 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 셀 다음 3D 콜라겐 매트릭스에 포함 됩니다. 세포 분열은 라이브 셀 현미경을 사용 하 여 모니터링 됩니다. 변형 콜라겐 섬유의 세포 분열, 세포-매트릭스 상호 작용은, 전후 동안 모니터링할 수 있습니다 그리고 양적 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 계량. 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 순수 관련 3D 환경에서 상호 작용을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 방법은 정상 조직과 질병 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 뿐만 아니라 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.

이 문서의 목표 3 차원 행렬에 포유류 세포 분열 과정을 공부 하 고 동안 그리고 세포 분열 후 세포와 3 차원 기질 간의 상호 작용을 계량 하는 영상 기반 방법을 제시 하는입니다. 촉진 하기 위해 세포 유사 분열의 이미징, 우리 통합 H2B mCherry lentiviral 변환을 사용 하 여 MDA-MB-231 셀. 형광 단백질 활용 된 H2B interphase 셀, mitotic 세포를 구별 하 고 세포 유사 분열19,,2026동안 여러 단계를 정의 하 mitotic 표식으로 사용 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 안정적으로 H2B-mCherry 3D 콜라겐 매트릭스 (그림 1A)에서 표현 하는 MDA-MB-231 셀의 전체 부문 과정을 모니터 ...

이 프로토콜은 효율적으로 세포 분열의 동기화를 통합 하 여 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 연구 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 그리고 양적 이미징 분석입니다.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

이 절차의 전반적인 목표는 생리학적으로 관련된 3D 환경에서 포유류의 세포 분열 및 세포 매트릭스 상호 작용을 연구하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 포유류의 세포 분열 및 세포 매트릭스 상호 작용을 연구하기 위한 효율적이고 일반적인 접근 방식을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 정상 조직 및 질병 조직 발달의 분자적 기초와 같은 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.transfection 하루 전, 100ml 세포 배양 접시에 500만 개의 HEK-293 T 세포를 10mL의 일반 세포 배양 배지 10ml에 플레이트화합니다. 이 세포를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다. transfection을 시작하기 직전 다음날, 섭씨 4도에서 transfection 시약의 바이알을 제거하고 실온에 도달할 때까지 방치합니다.그런 다음 시작하려면 1ml의 환원된 혈청 배지를 멸균 마이크로fuge 튜브에 추가합니다. 여기에 transfection에 사용되는 지정된 양의 lentiviral vector plasmid를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다.5분 후, 48마이크로리터의 transfection 시약을 이 튜브에 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그 후, 이 혼합물을 실온에서 최소 15분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 인큐베이터에서 HEK-293 T 세포가 있는 플레이트를 제거합니다.준비된 DNA transfection 시약 혼합물을 세포에 현명하게 떨어뜨리고 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 플레이트가 균일하게 분포되도록 합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다. transfection 약 6시간 후 플레이트를 제거하고 배지를 흡입합니다.10ml의 신선한 배양 배지를 추가하고 플레이트를 다시 인큐베이터로 옮깁니다. transfection 후 24시간, 48시간 및 72시간의 여러 시점에서 렌티바이러스 입자를 포함하는 배양 배지를 별도의 튜브에 넣어 수확합니다. 다음으로, 수집된 배양 배지를 멸균 0.45미크론 필터를 통해 여과하여 세포 파편을 제거합니다.각 수확 후 신선한 배양 배지로 교체하십시오. 렌티바이러스 입자를 함유한 여과액은 즉시 형질도입에 사용하거나 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 인간 유방암 세포 MDA-MB-231을 일반 배양 배지의 35mm 배양 접시에 플레이트화합니다.이 세포를

mammalian-cell-division-3d-matrices-via-quantitative-confocal

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

세포 분열은 형광성 으로 태그된 단백질 및 시간 경과 현미경 검사법을 사용하여 실시간으로 구상될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 사용자는 세포 분열 타이밍 역학, 유사분열 스핀들 어셈블리 및 염색체 의회 및 분리를 분석할 수 있습니다. RNA 간섭 (RNAi)-매개 유전자 녹다운 다음 이 사건에 있는 결점은 평가되고 정량화될 수 있습니다.

세포 분열의 살아있는 화상 진찰을 위한 초파리 S2 세포의 사용

이 프로토콜은 살아있는 3차원 이미징을 위해 세균 샘플을 준비하고 장착하는 방법과 이러한 이미지에서 대장균의 3차원 모양을 재구성하는 방법을 설명합니다.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

다차원 현미경 데이터를 정확하게 분석하려면 복잡한 워크플로가 필요합니다. 이 문서에서는 소프트웨어 Cell-ACDC를 사용하는 방법을 보여줍니다. 현미경 데이터의 세분화, 추적, 세포 혈통 분석 및 정량화를 위해 최첨단 AI 기반 모델을 활용합니다. 결정적으로, 모델 출력의 반자동 수정을 위한 혁신적인 프레임워크로 이러한 모델을 보완합니다.

Cell-ACDC를 사용한 다차원 현미경 데이터 분석

사용자 정의, 실시간 공촛점 스캐닝 이미징 시스템의 전체 구조는 설명합니다. 쉽게 동영상 속도 현미경 및 microendoscopy 사용할 수있는이 시스템은, 비용의 일부로 표준 상용 공촛점 시스템을 사용하여 액세스할 수 없습니다 이미징 형상 및 응용 프로그램의 배열을 허용합니다.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

학습하세요 3D 콜라겐 매트릭스에서 포유류 세포 분열을 동기화 및 실시간 영상으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 세포-기질 상호작용과 조직 발달 및 질병 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

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