연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

연골과 피부 아날로그 bioprinted nanocellulose-alginate 근거한 bioink를 사용 하 여 했다. bioinks 번 수동 혼합 장치를 통해 인쇄 하기 전에 cellularized 했다. 구문 균일 하 게 cellularized, 높은 생존 능력, 그리고 차별화의 유리한 마커 전시를 시연 했다.

이 절차의 전반적인 목표는 세포 생존력을 보존하면서 바이오프린팅 응용 분야를 위한 바이오잉크의 빠르고 재현 가능한 사전 셀룰룰라화를 촉진하는 것입니다. 이 방법은 세포 현탁액과 바이오잉크를 혼합할 때 재현성을 간소화하고 개선하여 생존 가능한 세포의 프린팅을 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 밀폐된 시스템에서 바이오잉크와 세포를 혼합하여 최소한의 취급과 샘플 손실 위험을 제거함으로써 혼합하는 능력을 제거한다는 것입니다.

이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 어셈블리가 잘못 수행될 경우 부적절한 혼합의 위험이 있기 때문입니다. 시작하려면 두 개의 주사기를 구하십시오. 한 주사기는 세포 현탁액용이고 다른 주사기는 바이오잉크용입니다.

본 연구에서 사용된 혼합 비율은 10 대 1이다. 따라서 10 대 1 혼합 장치에 필요한 대로 12ml 주사기와 1ml 주사기를 사용하십시오. 또한 루어 잠금 연결 및 멸균 암-암 루어 잠금 커넥터를 통해 이중 주사기와 결합할 수 있는 멸균 수동 혼합 장치를 구하십시오.

두 개의 멸균 주사기에서 부피를 제어된 속도로 동시에 압출할 수 있는 디스펜싱 장치를 검색합니다. 마지막으로, 바이오잉크와 세포 현탁액을 직접 혼합할 멸균 카트리지를 구합니다. 이 프로토콜에서는 나노셀룰로오스 알긴산 기반 바이오 잉크가 사용되며, 이는 인쇄 후 염화칼슘 용액을 첨가하여 가교됩니다.

세포를 준비하려면 0.5% 트립신 EDTA 용액을 사용하여 세포를 분리합니다. 이 프로토콜에서는 인간 섬유아세포가 사용됩니다. 그런 다음 trypan blue exclusion 방법을 사용하여 총 셀 수를 계산합니다.

최종 인쇄된 구성물에서 원하는 세포 밀도를 결정합니다. 이 목표 최종 세포 밀도를 달성하기 위해 희석해야 하는 수확된 세포의 농도를 계산합니다. 이 프로토콜에서는 밀리리터당 500만 개의 최종 세포 밀도가 활용되었습니다.

세포 현탁액을 세포 현탁액 주사기로 옮깁니다. 또한 바이오잉크를 다른 주사기로 옮깁니다. 다음으로, 바이오잉크 주사기 플런저를 뒤로 당기고 주사기를 디스펜싱 장치에 삽입합니다.

풀백 주사기 부피의 절반 이상이 바이오 안전 캐비닛 내부의 멸균 공기인지 확인하십시오. 주사기 플런저의 위치는 디스펜싱 장치에 삽입하는 동안 유지되는 것이 중요합니다. 루어 잠금 커넥터가 위쪽을 향하도록 장치를 수직으로 배치합니다.

그런 다음 세포 주사기의 플런저를 bioink 주사기와 비슷한 길이로 다시 당겨 분주 장치에 삽입합니다. 혼합 장치가 두 개의 주사기에 균일하게 부착되어 있는지 확인하여 세포 현탁액 또는 바이오잉크의 우발적인 방전이 없는지 확인하십시오. 혼합하기 전에 다시 확인하십시오.

루어 잠금 커넥터를 비틀어 두 주사기를 혼합 장치에 부착합니다. 그런 다음 디스펜싱 장치를 눌러 주사기의 공기를 압출하여 혼합 시스템을 프라이밍합니다. 용액이 루어 잠금 장치에 도달하기 전에 프라이밍을 중지하십시오.

프라이밍 후 루어 잠금 커넥터를 통해 충전 카트리지를 혼합 장치 끝에 부착합니다. 부착하기 전에 충전 카트리지의 플런저가 바닥에 있는지 확인하십시오. 디스펜싱 장치를 천천히 압축하여 바이오 잉크와 셀 현탁액을 카트리지에 함께 혼합합니다.

혼합 후 멸균 피펫 팁으로 충전 카트리지의 플런저를 아래쪽으로 밀어 바이오잉크 셀 혼합물과 접촉합니다. 세포 바이오잉크 혼합물이 혼합 장치로 다시 압출되지 않도록 디스펜싱 장치를 압축된 상태로 유지하십시오. 카트리지의 뚜껑을 덮고 작업 표면을 부드럽게 두드려 기포를 카트리지 상단으로 이동합니다.

이 시점에서 세포 바이오잉크 혼합물을 인쇄할 준비가 되었습니다. 이 프로토콜에서는 4.8 x 4.8 x 0.9 입방 밀리미터 치수의 정사각형 구조를 광조형 파일로 내보냈습니다. 텍스트 프로토콜에 있는 설정을 사용하여 격자 구조의 g-code 파일이 생성되었습니다.

참조된 프로토콜에 따라 환자로부터 일차 인간 비강 연골 세포(HNC)를 분리하고 동결 보존합니다. 동결 보존된 HNC를 해동 및 팽창시키고 섭씨 37도에서 표준 배양 배지를 사용하여 단층 배양에서 한 번 팽창합니다. 0.5%트립신 EDTA 용액을 사용하여 80%에서 90%confluence에서 세포를 분리하고 trypan blue exclusion protocol을 사용하여 계수합니다.

모든 실험은 2 번째 통로에서 HNC를 사용하여 수행되었습니다. 우리는 300 마이크로 리터의 배양 배지 내에서 밀리리터 당 1 억 개의 세포로 HNC를 현탁시키고, 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 및 아스코르브 산 50 마이크로 그램을 보충하여 바이오 잉크와 혼합하기 준비합니다. 10:1 바이오잉크와 세포 현탁액 비율로 수동 혼합 단위 프로토콜에 따라 HNC 세포 현탁액을 나노셀룰로오스 알긴산 기반 바이오잉크에 혼합하여 밀리리터당 900만 세포의 최종 세포 농도를 얻습니다.

바이오프린터가 UV 노출을 통해 멸균되었는지 확인하고 70% 에탄올로 닦아냅니다. Bioprinter를 층류 캐비닛에 배치하여 멸균 상태를 유지하십시오. 그런 다음 멸균 프린팅 노즐을 바이오잉크 세포 현탁액 혼합물이 들어 있는 카트리지에 부착하고 바이오프린터에 삽입합니다.

바이오프린터를 보정한 후, 25 게이지 원추형 노즐을 사용하여 25 킬로파스칼의 압력에서 격자 구조의 세포 적재 구조를 바이오프린트합니다. Bioprint cell-free 구조체를 대조군으로 사용합니다. 100 milimer 또는 염화칼슘의 이온 용액을 첨가하여 구조체를 가교합니다.

5분 후 구조물을 헹굽니다. 그런 다음 표준 배양 조건에서 배양 배지에서 구조체를 배양하고 2일 또는 3일에 한 번씩 배지를 교체합니다. 2주와 4주에 조직학적 분석을 위한 샘플을 수집합니다.

알시안 블루 염색을 사용하여 글리코사미노글리칸 또는 GAG 생성을 위해 샘플을 염색합니다. 여기에 표시된 것은 수동 혼합 장치 또는 수동 혼합 기술과 혼합한 후 24시간 후의 세포 생존율입니다. 수동 혼합 장치는 혼합 범위가 증가함에 따라 더 나은 생존 능력을 보여주었습니다.

이는 전세포화된 바이오잉크를 대량으로 준비할 때 더 긴 혼합 시간이 필요할 수 있기 때문에 중요합니다. 배양 14일째와 28일째의 세포 생존율이 여기에 나와 있습니다. 양호한 세포 생존율이 시각화되어 이 기술을 사용할 때 장기적인 세포 생존을 보여줍니다.

글리코사미노글리칸은 0일차, 14일차 및 28일차에 알시안 블루를 사용하여 염색된 바이오프린팅 연골 구조에서 시각화됩니다. 이러한 이미지는 이러한 생물 인쇄 구조 내에서 신연골의 형성을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 수동 혼합 장치 시스템을 활용하여 바이오잉크를 셀룰룰러화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후 이 기술은 바이오프린팅 분야의 연구자들이 부드러운 혼합 기술로 바이오잉크를 빠르고 균일하게 셀룰화할 수 있는 길을 열었습니다.