Name: 듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 학습하세요 폴리에틸렌글리콜과 아연산화물 템플릿법을 이용해 초박형 다공성 생체 모방 기저막을 제작하는 방법을 이중 세포 배양을 지원하며 기계적·화학적 특성을 조절할 수 있습니다.

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저자는 그들의 사려깊은 대화 및 재료 과학 전문 교수 폴 반 술과 교수 Chinedum Osuji 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에 대 한 자금 Dubinsky 새로운 이니셔티브 상 EB16629-01A1 건강 NIBIB BRPR01의 국가 학회에 의해 제공 했다.

재료 안전 데이터 시트 (MSDS)는 이전 하는 모든 자료의 읽어 보시기 바랍니다 사용 하 고 모든 안전 예방 조치를 사용 하 여 시간.
1입니다. 산화 아연 바늘의 합성
<ol>
	<li>0.04 M Zn (3)2의 250 mL 준비 * 물 250 mL에 아연 질 산의 2.9749 g을 추가 하 여 6 H2O 솔루션.</li>
	<li>150ml의 물에 NaOH의 6 g을 추가 하 여 1 M NaOH의 150 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>핫 플레이트 활동가와 미네랄 오일 목욕을 설정 하 고 실 온에서 기름 목욕에 500 mL 둥근 바닥 플라스 크를 잠수함.</li>
	<li>Zn (3)2의 250 mL를 추가 * 6 H2O를 플라스 크 반응 교 반 시작.</li>
	<li>150 mL (흰색 침전 짧게 형성 되며 다음 두 가지 솔루션을 혼합 계속 사라집니다) NaOH 솔루션을 추가 합니다. 2 h 발견에 대 한 저 어입니다.</li>
	<li>55-60 ° C에 플라스 크를 열 고 24 h에 대 한 교 반 계속 합니다.</li>
	<li>끄고 열을 교 반 하면서 실내 온도에 냉각 솔루션을 허용.</li>
	<li>11 µ m 기 공 크기와 Büchner 퍼 널에 솔루션을 필터링 하 고 하룻밤, 발견 건조를 허용 합니다. 필터 종이 더 이상 부 솔루션에서 젖은 백색 분말 깔때기 구멍을 통해 형성 하는 때 입자 완전히 건조 됩니다.</li>
	<li>ZnO 바늘을 수집 하 고 바늘 같은 형태를 확인 하기 위해 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 대 한 준비. 간단히, 핀 스텁에 탄소 테이프를 탑재 하 고 금속 주걱을 사용 하 여 탄소 테이프에 ZnO 바늘을 얼룩. 8mm 이리듐 22.4 g/c m3 의 밀도 코트 스퍼터 및 10에서 이미지를 수집 kV.</li>
</ol>
2. HCl에 대 한 현미경 슬라이드에 희생 아연 층의 추가 유도 못의 출시
<ol>
	<li>메탄올의 200 mL에 아연 아세테이트의 1.756 g을 용 해 하 여 아연 아세테이트 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올과 일회용 지우기 3 "x 1" 일반 현미경 슬라이드를 청소 합니다. 10 분 동안 건조 공기를 허용 합니다.</li>
	<li>150 m m 유리 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓고 150-160 ° c 예 열</li>
	<li>아연 아세테이트, 슬라이드에 분산 된 박막 형성의 5 방울을 적용 하 여 족집게와 코트 슬라이드 유리 슬라이드를 잡고 유리 피펫으로 피펫으로 전구를 사용 하. 초과 솔루션 다시 재고 솔루션에 물방울을 허용 합니다.</li>
	<li>아연 아세테이트 코팅 면이 미리가 열된 페 트리 접시 (150-160 ° C)에 슬라이드를 놓습니다. 15 분 열판에 남겨 주세요.</li>
	<li>핀셋으로 슬라이드를 제거 하 고 실내 온도에 냉각 수 있습니다. 슬라이드 흰색 줄무늬와 코팅 표시 됩니다.</li>
	<li>저명한 백색 줄무늬를 제거 하는 일회용 지우기를 사용 하 여 슬라이드에 남아 있는 과잉 아연을 제거 합니다. 표면 균일 해야 합니다.</li>
	<li>노출에 UV 준비 슬라이드 무 균을 보장 하기 위해 적어도 1 시간을 위한 biosafety 두건에서 빛. 주의: 자외선 눈에 해 롭 다 고 피부를 노출. 눈 이나 피부에 직접 노출 하지 않도록 하 고 사용 하지 않을 때 전기 공급을 끄십시오.</li>
</ol>
3입니다. 실리콘 절연체의 준비
<ol>
	<li>사각형 보다 작은 1 "x 1" 으로 컷된 실리콘 시트 (절연체 6-잘 접시에 맞게 수 있어야 함).</li>
	<li>생 검 펀치와 함께 사각의 센터에 8-12 m m 구멍을 펀치.</li>
	<li>20 분 동안 고압 실리콘 절연체 121.0 ° C와 1.12 kg/cm.</li>
</ol>
4. 말뚝 솔루션 및 젤 합성 말뚝의 준비
참고: 기능화 및 말뚝의 중 합 되어 광범위 하 게 탐구과 우리의 실험실과 다른 사람에 의해 이전 상세한. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
<ol>
	<li>보 건국 acryloyl-말뚝-50 m m 탄산 (pH 8.5) 아크릴 moiety, 이전 된 생 화 확 적인 반응으로 펩 티 드의 아민 말단의 기능화 수 있도록 1:1 어 금 니 비율에 RGD 셀 접착제 펩 티 드 결합 85% 이상의 효율을 얻을 수이 특징. 17</li>
	<li>2, 2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone 1-비닐-2-pyrrolidone 300 mg/mL의 농도에서 혼합 하 여 사진 시작자를 준비 합니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브를 별도에서 다음 밖으로 무게: ZnO 바늘의 20 mg, 못 다의 12.5 mg 및 말뚝 RGD의 2.5 mg.</li>
	<li>10 %FBS / PBS 솔루션;의 270 µ L에서 ZnO 바늘의 20 mg을 일시 중단 혼합 하는 소용돌이 (약 15 s).</li>
	<li>간단히 (&#60; 1 s) 튜브 베이스에 어떤 ZnO 집계를가지고 벤치탑 미니 원심 분리기에서 솔루션을 회전.</li>
	<li>집계는 튜브의 아래쪽에 유지 되도록 ZnO 솔루션의 상단에서 250 µ L를 수집 합니다. 와 못 다 못 RGD 솔루션을 만드는 못 약 2.5 m m RGD와 결합. 혼합 하는 소용돌이 (약 15 s).</li>
	<li>Acetophenone/n-비닐 pyrrolidone 사진-초기자와 혼합을 짧게 소용돌이의 2 µ L 추가 (약 5 s).</li>
	<li>ZnO 코팅 슬라이드의 중앙에 따라 폴리머 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>ZnO 코팅 얼굴 위에 두 번째 슬라이드를 천천히 낮은 다운 (페그 솔루션 두 ZnO 코팅 층 사이 있어야 함). 어떤 기포의 형성을 방지 하려고 합니다. 어떤 거품 탈출 하 고 얇은 층을 솔루션을 확산 수 있도록 주요 축을 따라 옆으로 슬라이드를 이동 합니다. 폴리머 솔루션 슬라이드의 대부분을 커버. 슬라이드 떨어져 나중 단계에서 끌어올 수 있도록 상단 슬라이드와 약간의 돌출을 만듭니다.</li>
	<li>Crosslink 365 nm UV 램프 (약 10 mW/cm2) 15 분 동안 아래 슬라이드.</li>
</ol>
5. 말뚝의 릴리스 유리 슬라이드에서 젤
<ol>
	<li>돌출 된 슬라이드 및 수동으로 순서에 느린 속도로 떨어져 두 개의 슬라이드 슬라이드를 크래킹 방지 풀에 압력을 적용 됩니다. 적어도 5 분, 건조 또는 하룻밤 젤을 허용 합니다.</li>
	<li>살 균 25 m m 유리 페 트리 접시에에서 슬라이드를 배치 하 고 부드럽게만 충분히 커버 슬라이드 (약 10-20 mL)을 사용 하 여 슬라이드에 1 M HCl 솔루션을 붓는 다. 부드럽게 바위 페 트리 접시; 젤은 HCl에 녹이 고 희생 적인 아연 코팅 및 바늘으로는 슬라이드 해제를 시작 한다. 일단 젤은 슬라이드에서 재고 솔루션으로 다시 HCl를 붓는 다.</li>
	<li>슬라이드와 젤 빠져들 때까지 부드럽게 페 트리 접시에 1 x PBS의 약 25 mL를 붓는 의해 젤 린스.</li></ol>신중 하 게 PBS에서 폐기물 용기에 붓는 다.
	<li>부드럽게 붓고 약 25 mL 1 x PBS의 페 트리 접시까지 젤 솔루션에 떠.</li>
	<li>젤 아래 실리콘 아이 솔 레이 터를 밀어 신중 하 게 핀셋을 사용 하 고 그것에 젤을 들어.</li>
	<li>6-잘 접시 가득 살 균 1 x PBS에는 아이 솔 레이 터와 젤을 전송.</li>
	<li>젤의 모든 슬라이드에서 제거 하 고 PBS에 몸을 담글 때까지이 과정을 반복 합니다. 무 균을 보장 하기 위해 적어도 1 시간을 위한 biosafety 두건에서 자외선에 준비 된 젤을 노출 합니다.</li>

6. 시드 셀 Bilayers
<ol>
	<li>시드의 A549 세포를 준비 합니다. 간단히, 1 x PBS의 5 mL와 75 c m2 플라스 크를 씻어, 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 2-3 분 동안 앉아 보자<ol>
		<li>기계적으로 플라스 크를 선동, 끄다 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스와 3 mL Dulbecco의 수정이 글 매체 반응 고 15 mL 원뿔 플라스 크에 수집 합니다. 완전 한 Dulbecco의 수정이 글 미디어의 추가 4 mL와 린스와 동일한 원추형으로 수집. 475 x g 6 분에 세포를 스핀.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>셀 아래로 회전 하는 동안 6 잘 플레이트의 각 음에 완전 한 Dulbecco의 수정이 글 중간의 작은 방울을 추가 합니다. 새로운 6 잘 플레이트에는 젤과 실리콘 절연체를 전송 족집게를 사용 하 여 젤 미디어 방울에 휴식 하는. 이제는 젤 얇은 층으로 확산은, 눈에 보이는 큰 구멍을 확인 합니다. 이 셀 건조와 젤의 크래킹을 피하기 위해 시드 전에 즉시 행해져야 한다.</li>
	<li>10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 6 x 105 셀/mL의 농도에서 Dulbecco의 수정이 글 중간에 셀 resuspend 추가 셀 서 스 펜 션 드롭 젤, 실리콘 막의 밖으로 구멍을 뚫은 영역에서 초승달 모양 유지 하의 중심에는 것이 현명 합니다. 4 h에 대 한 준수를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>4 h 후 잘 Dulbecco의 수정이 글 완전 한 매체의 0.5 mL을 추가 하 고 완전 한 접착을 위해 수 있도록 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>다음 날, 셀 시드를 위한 HUVECs를 준비 합니다.<ol>
		<li>1 X PBS의 5 mL와 75 c m2 플라스 크를 씻어, 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 2-3 분 동안 앉아 보자</li>
		<li>기계적으로 플라스 크를 선동, 담금질 3 mL 20% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스와 1% 성장 보충 M199 미디어와 함께 반응 고 15 mL 원뿔로 수집 합니다.</li>
		<li>M199 완전 한 미디어의 4 mL와 린스와 동일한 원추형으로 수집. 475 x g 6 분에 세포를 스핀.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>셀 아래로 회전 하는 동안 각 잘 새 6 잘 플레이트에에 완전 한 매체 199의 작은 방울을 추가 합니다. 실리콘의 센터에 있는 미디어의 드롭 잘에서 새로운 실리콘 아이 솔 레이 터를 놓습니다.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 신중 하 게 새로운 6 잘 플레이트에 못 젤은 아이 솔 레이 터에 A549 세포를 지 원하는 실리콘 아이 솔 레이 터를 플립.</li>
	<li>6 x 105 셀/mL의 농도에서 HUVECs를 resuspend 하 고 현명 하 고, 실리콘 막의 밖으로 구멍을 뚫은 영역 내에서 젤에 초승달 모양 유지 하려고 뒤집힌된 젤 드롭의 중심에 세포 현 탁 액을 추가 합니다. 2 시간에 대 한 준수를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>2 시간 후 부드럽게 각 우물에 M199 완전 한 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>
7입니다. 면역 형광 검사
<ol>
	<li>조심 스럽게 수동 피 펫과 젤에서 미디어를 제거 하 고 셀 시드는 젤의 센터에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 약 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자. 주의: PFA는 독성 화학; 보호를 착용 하 고 처리는 생물 안전 캐비닛에서 수행 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 제거는 PFA 고 각 젤을 PBS에 2 %BSA 대략 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 1 h 동안 앉아 보자.</li>
	<li>BSA는 조심 스럽게 제거 합니다. PBS에 2 %BSA 1: 100 희석에서 1 차 항 체를 준비 하 고 각 젤을 500 µ L를 추가. 실 온에서 1 h 동안 앉아 보자. 1 x PBS의 500 µ L 부드럽게 린스 합니다.<ol>
		<li>2 차 항 체와 동일한 프로세스를 반복 합니다. 항 체에 따라 사용: 1) 반대로 인간 CD144 (VE-Cadherin) 클론 16B1; 2) 안티 인간 CD324 (E-Cadherin) 클론 6714; 3) 안티 인간 CD31 (PECAM-1) 복제 C-20; 4) 안티-A549; 5) 반대로 마우스 FITC; 6) 알 렉 사 Fluor 647 항 염소입니다. F-말라를 시각화 하려면 500 µ L Phalloidin의 추가 (PBS에 10 µ g/mL) 20 분.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>조심 스럽게 2 차 항 체 또는 phalloidin를 제거 하 고 500 µ L DAPI의 추가 (0.1 µ g/mL) 20 분에 대 한 신중 하 게 DAPI 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 1 x PBS의 1.5 mL를 추가 각 잘 젤에에서는.<ol>
		<li>족집게와 실리콘 절연체를 사용 하 여, 유리 슬라이드에 한 젤을 전송 합니다. 이미징, 직전 각 젤에 대 한이 작업을 수행 하 고 영상 후 PBS 솔루션으로 젤을 바꿉니다.</li>
		<li>또는 젤 DAPI 설치 매체를 사용 하 여 탑재 합니다. 잘 매니큐어와 샘플 인감, 건조 하 고 젤의 균열을 방지 하기 위해 2 일 이내에 이미지를 수집. 문제 해결 표 1을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

여기서 설명 하는 프로토콜을 가변 PEG 하이드로 겔 biomimetic BM 비 계 역할을 만들 수 있다. 특히, 다양 한 PEG 분자 무게 펩 티 드 활용 전략, 그리고 산화 아연 미정 질 구조 또는 농도, 탄성 계수, 생 화 확 적인 속성과 hydrogels의 다공성 구조 수정할 수 있습니다, 각각. Ultrathin 못 비 계는 높은 기 공 밀도 더 많은 기능을 vivo에서 지 세포 막 투과성 지원 모델 (표 2)에 비해 발견의 모방은 작은 기 공 직경을 갖추고 있습니다. 또한,이 방법을 통해 우리 20 µ m의 평균 두께 ultrathin 구조를 달성 했다. 폴 리 카보 네이트 침투성 지원 모델 이미 우리의 지식, 10 µ m의 ultrathin 레이어를 달성 하는 동안 이것은이 두께 달성 하기 위해 첫 번째 부동성 및 가변 하이드로 겔 시스템. 마지막으로, 페그 hydrogels 이다 크기 순서 보다 적게 전통적인 침투성 지원, 조직 문화, 플라스틱과 유리, 모든 평점 범...

세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질 건설 기계 셀 첨부 파일을 지 원하는 다른 세포 유형 사이 방 벽으로 봉사 하 고 복잡 한 조직 및 장기의 필수 구성 요소를 확인 합니다. 간 질 성 결합 조직, 달리 지하실 멤브레인 (BM) 다른 조직 구획 분할 하는 장벽 역할 ECM의 특수 유형입니다. BMs 약 100 µ m 두께, 그리고 따라서 양쪽에 셀 사이의 직접 및 간접 통신에 대 한 허용. BMs의 두 가지 일반적인 예 혈관 BMs, pericytes 및 내 피 세포 사이의 microvascular 벽에서 발견 되며 내 피 및 상피 세포 사이 발견 되는 기도 BMs. BMs는 건강과 질병, 세포 극성 및 마이그레이션 등 세포 기능 조절에 중요 한 역할을 제공 합니다. 1 구성, 강성, 건축, 및 BMs의 다공성 고유한 생리 기능을 촉진 하기 위하여 기관 시스템 간에 다릅니다. 예를 들어 BM 모 셀 통신, 수용 성 분자 확산, 유지 하 고 감염 시 염증 또는 박테리아 면역 세포의 마이그레이션에 대 한 중요 하다. 항공에 모 공 0.75에서 3.86 µ m.2 까지 직경 BM의 전체 두께 걸쳐
BM의 얇은 자연 세포 유형 물리적으로 서로에서 분리 되어, 비록 세포 통신 신호 paracrine 및 연락처 중재를 통해 유지 되는 보장 합니다. 따라서, 생체 외에서, 인간 질병 연구에 연구원 문화 셀룰러 bilayers에 다공성 침투성 지원 삽입에 의존 했습니다. 3 이러한 모델 건강과 질병에 있는 역할 셀룰러 통신을 이해 하기 위한 중요 한 되었습니다. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 침투성 지원 삽입 어떻게 백혈구 신규 모집 및 세균 침투; 등의 생리 적 프로세스 조절-셀 신호를 이해 하기 위한 기본 요건을 충족 그러나, 삽입 중요 한 제한이 고 인간 BM. Permeable 지원 모방 하지 삽입 기계 및 생 화 확 적인 tunability 부족과 단순한 다공성 구조를 불규칙 한 숨 구멍을 만드는 섬유 구조를 모방 하지 않습니다 BMs의 전형. 따라서, 세포 프로세스를 영향을 미치는 기본 BM 속성을 다시 만들 수 있는 가변 시스템에 대 한 필요성이 있다.
폴리머 기반 기판 biomimetic 셀룰러 bilayers 맥락을 더 밀접 하 게 비보에 환경에서 공부 하는 BMs의 개발을 위한 이상적인 후보자 이다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 중합체는 기계적으로 가변 및 화학적 통합 biomimetic 펩 티 드 파편. 을 수정할 수 있습니다. 11 , 12 , 13 bioinert 폴리머 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) biomimetic BMs를 만드는 데 사용할 수 있습니다 및 최근 작품 자세한 기계적으로 가변 못 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 젤 세포 성장을 지 원하는 다공성 네트워크와의 합성 그리고 염증 성 세포 chemotaxis입니다. 14 못 기반 출판 침투성 지원 보다는 인간의 ECM의 보다 현실적인 모델을 제공 하는 기판, 이러한 모델의 대부분은 매우 셀 셀 bilayer 문화를 만들 수 있는 능력을 제한 하는 대략 775 µ m의 깊이와 두께 연락처입니다. 14
여기, 우리는 못 폴리머 기반 BM 모방 많은 현재 셀 bilayer 문화 기술의 한계를 극복 하는의 창조에 대 한 프로토콜을 제시. 고분자 합성 및 가교은 이후에 선택적으로에서 제거 하는 동안에 산화 아연, 미정 질 생산의 제조에 광범위 하 게 사용 된 자료를 통합 하는 템플릿 방법 개발 했습니다는 결과 대량 중합체입니다. 이 프로세스는 인간의 BMs의 꼬불꼬불한 고 상호 공 네트워크를 흉내 낸 임의의 다공성 네트워크를 생성 합니다. 또한,는 다공성 바늘 생산 동안 반응 산출할의 수정을 통해 산화 아연 microcrystals의 형태와 크기를 변경 하 여 변경할 수 있습니다. 여기에 개발 된 기술은 인간 BM.을 마지막으로, 역학, 다공성, 두께 모방한 ultrathin 히드로 만들고 이러한 BM 비슷한 구조의 생 화 확 적인 구성 쉽게 대부분은 microenvironment를 생성 하기 위해 변경 될 수 있습니다. 비슷한 그 본 vivo에서.

<table><tbody><tr><td>1M 하이드로겔 클로라이드 (HCl)</td> <td>EMD</td><td>HX0603-75 2.5L</td><td>멸균. 흄 후드에 보안경과 장갑을 끼고 사용하십시오.</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133 500 mL</td><td>없음</td></tr><tr><td>아연 질산염 육수화물 (Zn(NO3)2&bull; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228737-500g</td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>수산화나트륨 (NaOH)</td><td>마크롱 화학 물질</td><td>278408-500g</td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>아연 아세테이트 이수화물 ((CH3O2)2Zn2+&bull; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45180010 1kg</td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>메탄올 (CH3OH)</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-05 4L</td><td>흄 후드에 보안경과 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>VWR 생명과학 Seradigm 프리미엄 등급 FBS</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>멸균 필터. 45 mL PBS 미네랄 오일에 5 mL</td></tr><tr><td></td><td>FBS CVS&nbsp;</td><td>PLD-B280B</td><td>없음</td></tr><tr><td>둥근 바닥 플라스크</td><td>ChemGlass</td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>온도계</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>교반 막대</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>일반 사전 세척 현미경 슬라이드 3"x1"x1" mm 두께</td><td>의 Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td>에탄올을 분사하고 사용 전에 건조시킵니다.</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>1mL 고무 전구</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>플라스틱 100mm 페트리 접시</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>멸균 집게</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>실리콘 아이솔레이터</td><td></td><td></td><td>0.8mm 두께</td></tr>의 <tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS) 펀치</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>유리병</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Cellstar</td><td>657 160</td><td>N/A</td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>교반기 핫 플레이트</td><td>VWR Dya-Dual</td><td>12620-970</td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24650-42-8</td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>1-비닐-2-피롤리돈 (C6H9NO)</td><td>Aldrich</td><td></td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)</td><td>Fluka</td><td>81280-1kg</td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>RGDS</td><td>Life Tein</td><td>180190</td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Blak-Ray 장파 UV 램프</td><td>UVP</td><td>모델 B 100AP</td><td>해당 없음</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>해당 없음</td></tr></tbody></table>

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin porated 탄성 hydrogels 세포 배양

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

지하실 막 강성, 구성, 건축, 그리고 다공성과 다양 한 세포질 bilayers의 중요 한 구성 요소입니다. 상피 내 피 bilayers의 학문 생체 외에서 전통적으로 bilayer 문화를 활성화 하는 침투성 지원 모델에 의존 해야 하지만 투과 지원 인간의 지하실 막의 다양성을 복제 하는 기능에 제한 됩니다. 반면, 화학 합성을 해야 하는 하이드로 겔 모델 높은 가락 고 소재 강성 및 biomimetic 펩 티 드 또는 단백질의 결합을 통해 생 화 확 적인 구성의 수정에 대 한 허용 한다. 그러나, 그들은 모 셀 연락처 및 마이그레이션 연구 기능 생체 외에서 부족 하기 때문에 전통적인 히드로 모델 기능에 제한 됩니다. 또한, 전통적인 hydrogels 두께 때문 hydrogels의 전체 두께 걸쳐 있는 숨 구멍의 설립이 되었습니다 도전. 현재 연구 사용 하 여 poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels와 소설 아연 산화물 템플릿 메서드 biomimetic hydrogels의 이전 단점을 해결 하기 위해. 그 결과, 선물이 ultrathin, 지하실 멤브레인 같은 히드로 가변 기 공 구조, 기계적 특성, 및 생 화 확 적인 구성 사용자 정의 발판에 confluent 셀룰러 bilayers의 문화입니다.

못 RGD hydrogels 사이 2 개의 희생 아연 산화물 층 사이 폴리머 솔루션 및 산화 아연 바늘 기 공 템플릿 만들기 형성 되었다. 희생 아연 산화물 구성 요소는 염 산, 지속적인 모 (그림 1)와 ultrathin 못 hydrogels 생성 다음 제거 되었습니다. 산화 아연 바늘의 형태는 전자 현미경 (SEM), 검색 하 여 확인 되었다 고 평균 길이 너비 각각 3.92 ± 0.089 µ m 및 0.43 ± 0.02 µ m, 되도록 결정 되었다 (그림 2A-2B). 산화 아연 바늘의 제거에 따라 하이드로 겔 모 공 SEM으로 시각화 했다 하 고 (그림 2C-2E) 특징. 평균 기 공 밀도 hydrogels 176,863 ± 49,532 숨 구멍...

현재 bilayer 문화 모델 vivo에서 microenvironments 모방 기능 생체 외에서 연구에 대 한 허용 하지 않습니다. 폴 리 에틸렌 글리콜과 산화 아연 템플릿 메서드를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다 ultrathin biomimetic 지하실 막의 개발을 가변 강성, 다공성와 밀접 하 게 비보에 모방 하는 생 화 확 적인 구성 세포 외 매트릭스입니다.

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 폴리에틸렌 글리콜 및 산화아연 템플릿 방법을 설명하여 이중 세포 배양을 지원하고 조정 가능한 기계적 및 화학적 특성을 가진 다공성 초박형 생체 모방 기저막을 만드는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 초박형, 다공형, 기계적 및 생화학적으로 조정할 수 있는 하이드로겔을 만들 수 있다는 것입니다. 이를 통해 단일 또는 이중 세포 배양을 지원할 수 있습니다.이 방법은 이중 세포 배양이 인간의 기저막을 모방한 미세 환경에 어떻게 반응하고 상호 작용하는지 포함하여 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 다양한 생물학적 시스템과 조직으로 확장되어 궁극적으로 인간 질병에 대한 향상된 번역을 통해 더 많은 생체 모방 연구를 가능하게 합니다. 플라스크에 질산아연 250ml를 넣고 반응을 교반하기 시작합니다.그런 다음 수산화나트륨 용액 150ml를 추가합니다. 흰색 침전물은 잠시 형성된 다음 두 용액이 계속 혼합됨에 따라 사라집니다. 뚜껑을 덮지 않고 2시간 동안 혼합물을 저어줍니다.플라스크를 섭씨 55-60도로 가열하고 24시간 동안 계속 저어줍니다. 불을 끄고 저어주면서 용액을 실온으로 식히십시오. 11미크론 기공 크기의 Buchner 깔때기를 통해 용액을 걸러내고 뚜껑을 덮지 않고 밤새 건조시킵니다.여과지가 주입된 용액으로 인해 더 이상 젖지 않고 깔때기 구멍 위에 흰색 분말이 형성되면 입자가 완전히 건조됩니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 산화아연 바늘의 바늘 다리 형태를 확인한 후 70% 에탄올과 일회용 물티슈로 3인치 x 1인치 일반 현미경 슬라이드를 청소합니다. 핀셋으로 유리 슬라이드를 잡고 피펫 전구가 있는 유리 피펫을 사용하여 슬라이드에 아세트산 아연 5방울을 코팅하여 슬라이드에 얇은 층을 형성합니다.과도한 용액이 원액으로 다시 떨어지도록 합니다. 그런 다음 예열된 페트리 접시에 슬라이드를 아세트산 아연 코팅면이 위를 향하도록 하여 15분 동안 놓습니다. 핀셋으로 슬라이드를 제거하고 실온으로 식히십시오.슬라이드가 흰색 줄무늬로 코팅된 것처럼 보입니다. 슬라이드에 남아 있는 과도한 아연을 제거하고 일회용 물티슈를 사용하여 영구적인 흰색 줄무늬를 제거합니다. 표면은 균일해야 합니다.270마이크로리터의 10% FBS/PBS 용액에 20mg의 산화아연 바늘을 현탁시킵니다. 약 15초 동안 섞이는 소용돌이. 벤치탑 미니 원심분리기에서 용액을 짧게

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연구

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Bioengineering

생명공학

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동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

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