치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호

이 프로토콜의 전반적인 목표는 서브 테논의 포름알데히드 방출제 주입에 의해 유도되고 시차 주사 열량계로 확인된 바와 같이 공막 조직에서 콜라겐 가교 효과를 시각화하고 측정하기 위해 2차 고조파 생성 현미경을 사용하는 것을 입증하는 것입니다. 이 방법은 유도된 가교 효과를 평가하기 위한 비침습적 방법을 제공함으로써 치료 조직 가교 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 2차 고조파 생성 신호가 콜라주 원섬유에 매우 특이적이기 때문에 항체 염색과 같은 특별한 조직 준비가 필요하지 않다는 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어는 치료용 각막 조직 가교에 적용되는 절차에 대해 읽었을 때 처음 떠올랐습니다. 성공적인 2차 고조파 발생 현미경 검사는 조직을 신중하게 배치하고 올바른 이미징 조건을 설정하여 신호 측정에서 조직 손상 및 아티팩트를 방지해야 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 입증하는 것이 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 토끼의 안구에 서브테논 주사로 치료를 시작합니다.

여기에 표시는 서브 테논의 주입 부위를 개략적으로 표현한 것입니다. 눈의 크기에 따라 최적의 크기의 검경을 선택합니다. 3시간 30분의 배양 후 눈꺼풀 검경을 사용하여 눈꺼풀을 후퇴시켜 지구본에 대한 접근을 최적화합니다.

윤부를 둘러싼 결막을 분리하고 공막 삽입 부위에서 여분의 안구 근육을 절단합니다. 공막의 윗부분을 가위나 칼날로 잘라 주사 부위가 중앙에 위치한 1cm 단위의 영역을 만듭니다. 남아 있는 망막층과 맥락막층을 긁어내고 새 PBS로 두 번 씻어내고, 매번 약 10초 동안 조각을 용액에 그대로 둡니다.

이미징 시설로 운송하기 위해 PBS 용액으로 채워진 1밀리리터 튜브에 조직을 넣습니다. SHG 현미경 검사를 수행할 때 신호와 해상도를 최대화하려면 적외선을 투과하도록 최적화되고 개구수가 높은 대물 렌즈를 사용하십시오. 샘플의 깊이에 맞게 렌즈의 보정환을 조정합니다.

이 경우 0.17mm입니다. 현미경에 25배 대물 렌즈를 장착하고 렌즈 표면을 덮기 위해 충분한 양의 수성 침지 젤을 추가합니다. 조직을 수화한 상태로 유지하고 렌즈 대물렌즈와 슬라이드 사이의 이멀젼 젤이 건조되는 것을 방지하기 위해 SHG 신호에 변화를 일으킬 수 있으므로 현미경에 샘플을 장착한 후 30분 이내에 조직 이미징을 수행하는 것이 중요합니다.

챔버 하단 부분에 25mm 원형 커버 슬립을 배치하여 셀 챔버를 조립합니다. 공막 조직 조각을 커버 슬립에 놓고 50-100마이크로리터의 완충액을 추가합니다. 두 번째 원형 커버 슬립으로 조직을 덮고 조직을 누르거나 평평하게 하지 않고 챔버 상단 부분을 나사로 조입니다.

그런 다음 조직 샘플이 있는 세포실을 현미경 스테이지에 장착합니다. 스테이지를 배치하고 대물렌즈의 높이를 조정하여 샘플의 아래쪽 표면이 접안렌즈를 통한 명시야 검사에 의해 결정된 대로 초점이 맞춰지도록 합니다. 컴퓨터 모니터를 제외한 모든 조명을 끄고 현미경 스테이지에 드리워진 알루미늄 호일 시트로 모니터에서 나오는 빛을 최대한 차단합니다.

소프트웨어에서 Eye Port 모드를 끕니다. TI Pad 패널에서 렌즈 정의가 올바른지 확인합니다. A1 Compact Graphical User Interface(A1 컴팩트 그래픽 사용자 인터페이스) 패널에서 이미징용 적외선 레이저를 선택하고, Non Descanned Detectors(비스캔 검출기)를 선택하고, 400-450나노미터 대역 통과 필터가 장착된 DAPI 채널을 선택합니다.

A1 Multi Photon 그래픽 사용자 인터페이스 패널에서 적외선 레이저의 파장을 860나노미터로 설정하고 셔터를 엽니다. 녹색 표시등이 계속 켜져 있는 대로 방출 파장이 변경될 때까지 기다립니다. A1 Compact Graphical User Interface 패널에서 레이저 스캐닝 조건을 설정하려면 Galvano 스캐너, 단위 방향 스캐닝, 1024 x 1024 픽셀의 프레임 크기, 6.2마이크로초의 픽셀 체류 시간, 2X의 라인 평균을 선택합니다.

그런 다음 찾기 모드로 실시간 상상을 켜고 레이저 출력과 검출기 게인을 조정하여 AI Compact Graphical User Interface 패널에서 상상 조건을 설정합니다. 레이저 출력을 50밀리와트에서 150밀리와트 사이, 즉 860나노미터 레이저의 경우 2%에서 6% 사이로 설정합니다. 이 범위를 초과하면 조직 손상이 발생할 수 있습니다.

현재 이미지의 픽셀 강도 값의 히스토그램을 표시하는 조회 테이블 패널을 열고 HV 레이블 막대에서 감지기의 게인을 추가로 조정하여 채도를 피하면서 픽셀 값의 범위를 최대화합니다. SHG 신호가 가장 높은 샘플을 사용하여 최적의 레이저 및 게인 설정을 찾습니다. 한 번의 실험에서 비교할 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 유지합니다.

이 방법은 실험의 샘플이 검출기를 포화시키지 않도록 합니다. 미리보기 모드에 있는 조직을 스캔하려면 XYZ 개요 도구를 엽니다. 이 모드에서 이미지 획득 속도를 높이려면 이미징을 더 낮은 해상도로 설정하십시오.

XYZ 개요 패널에서 현재 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스캔 5 x 5, 3 x 3 또는 단일 보기 캡처를 선택합니다. 스캔이 완료되면 현재 미리 본 영역 밖의 영역을 두 번 클릭하여 새 위치로 이동합니다. 라이브 스캔 모드를 켠 다음 조직의 다른 영역이 축 방향에서 약간 다른 위치를 가질 수 있으므로 조직에 초점을 맞춥니다.

새로운 5 x 5, 3 x 3 또는 단일 시야를 캡처합니다. 조직의 넓은 영역을 미리 볼 때까지 이 과정을 반복합니다. XYZ 개요 도구에서 콜라겐 섬유가 전체 시야에서 보이는 위치를 두 번 클릭하여 스테이지를 특정 위치로 이동합니다.

이미징을 고해상도, 1024 x 1024 픽셀 및 2X 라인 평균으로 설정합니다. Live Find 모드를 켜고, 하단 플레인에 초점이 맞춰지도록 목표의 위치를 조정하고, TI 패드에서 Z 드라이브를 사용하여 광학 평면을 이 하단 레이어에서 10마이크로미터 위로 이동합니다. 캡처 버튼을 사용하여 이미지를 획득하고 XYZ 검토 도구에서 더하기 버튼을 사용하여 위치를 저장합니다.

새 위치를 두 번 클릭하고 깊이 조정 및 이미지 캡처 프로세스를 반복합니다. 각 조직 조각에 대해 10개의 이미지를 캡처합니다. 시야는 XYZ 개요 도구에 저장된 위치에 표시된 것처럼 겹치지 않아야 합니다.

마지막으로, 후속 시차 주사 열량계 분석을 준비하기 위해 현미경 검사가 완료된 직후 공막 조각을 PBS가 있는 1밀리리터 튜브에 넣습니다. 시작하려면 컨트롤의 중앙 부분을 잘라내고 공막을 가위로 처리하십시오. 흡수성 조직으로 각 공막 사각형을 말리고 톱니 집게를 사용하여 DSC 팬 바닥에 평평하게 놓습니다.

조직 내부와 입술을 구부리고 덮은 상태에서 조직의 젖은 무게를 얻기 위해 팬의 무게를 측정합니다. 그런 다음 칭량된 샘플을 DSC 자동 시료 주입기 트레이의 지정된 위치에 놓습니다. 기기 관리 소프트웨어를 사용하여 분석법을 생성하고, 조직의 무게를 지정하고, 텍스트 프로토콜에 나열된 둘레를 사용하여 열 분석을 실행합니다.

완료되면 기기 이미징 소프트웨어를 사용하여 열 변성이 발생하는 전이 온도 피크를 추출하여 각 샘플에 대한 데이터를 분석합니다. 공막의 SHG 이미지는 평균 픽셀 밝기에 대해 피지에서 분석되었습니다. 이미지를 열고 분석 메뉴를 선택한 후 측정을 선택하면 신호의 평균 밝기가 포함된 결과가 포함된 테이블이 열립니다.

또는 분석 메뉴에서 히스토그램을 선택하여 이미지에서 신호의 평균 밝기 및 변동에 대한 정보가 포함된 픽셀 강도 값의 히스토그램을 만듭니다. 이 측정은 대조군 및 가교 샘플의 모든 이미지에 대해 반복되었습니다. 히스토그램 분석과 함께 공막의 대표적인 SHG 이미지(평균 밝기 포함)가 여기에 시연됩니다.

대조군 샘플은 원섬유의 물결 모양 배열이 특징입니다. 여기에 표시된 것은 픽셀 강도가 증가된 400밀리몰 SMG와 가교 결합된 샘플로, 콜라겐 섬유가 더 곧게 보이는 것을 보여줍니다. 열 분석 결과는 변성 온도의 더 높은 피크를 보여주고 가교 효과를 확인합니다.

대조군 샘플과 400밀리몰 가교 시료 변성 곡선이 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 가교 샘플을 준비하는 방법과 공막 샘플에 대해 SHG 현미경을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 주사 부위 주변의 사각형을 외과적으로 추출하고 미리보기 모드에서 조직을 스캔하기 위한 이미지 조건을 설정하여 서브테논 공간에서 정확한 주입에 어려움을 겪습니다.

이 절차에 따라 정량 분석 및 형태학을 포함한 엘라스틴 분석과 같은 추가 질문에 답하기 위해 자동 윤활(autoluorescence)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 가교제 전달 기술의 의미는 공막 안정화를 위해 후극에 더 쉽게 접근할 수 있기 때문에 고도 근시 및 후방 포도상구종 치료로 확장됩니다. 이 현미경 검사 기술의 의미는 병든 공막에서 콜라겐 가교 상태를 측정하거나 원하는 가교 결합 절차가 완료된 후 결과를 측정하여 콜라겐 약화로 인한 고도 근시 및 합병증을 진단하는 데까지 확장됩니다.

따라서 이 가교 방법과 2차 고조파 세대 현미경은 공막 가교에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 각막, 피부, 연골, 힘줄, 심장 판막 및 혈관과 같은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.