Name: 치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 배우세요 제2고조파 발생 현미경법을 이용하여 토끼 공막 조직의 콜라겐 가교 효과를 시각화하고 측정하는 방법을. 이 비침습 기법은 치료 조직 가교 연구에 신뢰할 수 있는 평가 도구를 제공합니다.

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저자는 세인트 주입;에 대 한 상담에 감사 Tongalp Tezel, 메릴랜드, 테레사 Swayne, 박사, SHG 현미경;에 관한 상담 그리고 디자인 및 생물 통계학 리소스 및 컬럼비아 대학 의료 센터에서 어 빙 연구소의 Biostatistical 핵심 시설에서 지미 둥.
실명 방지 연구에 의해 및 국가 연구소의 건강 보조금 NCRR UL1RR024156, 네이 P30 EY019007, NCI P30 CA013696, 그리고 네이 R01EY020495 (DCP)에 의해 부분에서 지원. 관련된 지적 재산권을 소유 하는 컬럼비아 대학: 발행 하는 미국 특허 아니오: 8,466,203,: 9,125,856. 국제 특허 출원: PCT/US2015/020276.
이미지는 Confocal에 수집 및 전문 현미경 공유 리소스 컬럼비아 대학, NIH에서 지원에서 허버트 어 빙 종합 암 센터의 #P30 CA013696를 부여 (국립 암 연구소). Confocal 현미경 NIH 함께 구매 #S10 RR025686를 부여.

모든 절차는 그대로 outbred 토끼 머리에서 싱가포르로 토끼 눈을 사용 하 여 수행 되었다. 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 모든 기관 및 국가 지침 따라 했다.
1입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>서울시 의회에 대 한 준비:<ol>
<li>나트륨 중 탄산염 솔루션 (NaHCO3) 솔루션 NaHCO3 파우더는 증류수의 1 mL에 용 해의 0.0165 g를 사용 하 여 0.2 M 농도의 1 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>800 mM SMG의 최종 농도를 증류수의 1 mL에 가루 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시)의 0.1016 mg을 디졸브. 나트륨 중 탄산염 해결책 0.1 M NaHCO3 및 400 mM SMG의 최종 농도를 조정 합니다. 원하는 상호 효과 따라 서울시의 농도. 여기에 설명 된 프로토콜에서 우리 사용 40, 100, 400 mM 서울시.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. subTenon의 주입 SMG를 사용 하 여 의회에 대 한
<ol><li>400 µ L 제어와 SMG 솔루션 두 1 mL 인슐린 주사기 (바늘 25 G)를 각각 작성.</li>
	<li>쿠션의 도움으로 프로 파일 평면에서 토끼의 머리를 배치. 스티로폼 또는 종이 스택 최적의 위치에 머리를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>소아 안과 검 경으로 눈 꺼 풀을 철회.</li>
	<li>초기 안구 내부 압력 (IOP) applanation tonometry 장치를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>조직 표시와 함께 limbus의 상단 중간 부분에 의도 된 주사의 사이트를 표시 합니다.</li>
	<li>철회 conjunctival 집게 (또는 톱니 모양의 라운드 팁으로 어떤 겸)과 주사의 사이트를 둘러싼 결 막 및 결 막, 입력 표시 limbal 사이트 (즉, 2-3 단지 약간 넘어 장부의 캡슐을 통해 바늘을 삽입 m m는 limbus에서)입니다. 결 막에 작은 절 개를 통해 장부의 캡슐 바늘의 통과 촉진 하기 위해 아이리스가 위로 만들 수 있습니다.</li>
	<li>한 번 장부의 캡슐 내에서 바늘은 그것에 게 사이드-투-사이드를 이동 하 여 자유롭게 모바일 있는지 확인 합니다. 이 기간 동안, 전 세계 이동 하지 한다. 하위-장부의 (sT)에서 sclera 위에 바늘의 적절 한 배치를 확인 하는이 공간.</li>
	<li>주사기에서 솔루션을 삽입 하 고 바늘을 삭제. 즉시 다음 주입, 액체 결 (즉, chemosis)을 통해 본 앞쪽 볼록한 만드는 sT 공간에 축적 됩니다.</li>
	<li>그것은 세계의 실수로 구멍 뚫 기 때문에 변경 되지 않았다 확인 IOP 측정을 반복 합니다.</li>
	<li>뚜껑 금속을 제거 하 고 약 2-3 분 동안 닫힌된 눈 꺼 풀을 통해 디지털 마사지를 수행 합니다.</li>
	<li>3.5 h의 잠복기에 대 한 머리를 두고 (실내 온도 18 ° C =), 다음 단계로 이동 하기 전에.</li>
</ol>3. 조직 준비
<ol><li>세계에 대 한 액세스를 최적화 하기 위해 눈 꺼 풀 검 경을 사용 하 여 눈 꺼 풀을 철회. 눈의 크기에 따라 최적으로 크기의 금속을 선택 합니다.</li>
	<li>분리는 limbus를 둘러싼 결. 이미 사출 사이트 근처 베인 되었습니다, 원주 확장 테두리 약 1 x 1 cm의 inoculum 크기를 포함 하는 것 그래서.</li>
	<li>Scleral 삽입의 자신의 사이트에 여분의 눈 근육을 잘라.</li>
	<li>안구 후부 측면에서 추진 하는 집게와 함께 상승 합니다. 이 사후 세계에 대 한 액세스를 제공 하 고 안과 동맥 및 정 맥 부근 세계의 후부 극 시 신경의 절단을 촉진 한다.</li>
	<li>잘라는 corneoscleral 복잡 한, 표시 된 주사 사이트를 포함 하 여 외부 테두리와 함께. 얼룩은 여전히는 공 막의 나머지 부분에 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>코 퍼스 vitreus 및 조직 집게와 견인을 적용 하 여는 공 막의 안쪽에 연결 된 모든 레이어를 제거 합니다. 참고: 추가 단계는 수행 중인 다음 절차에 따라 달라 집니다.: 4.-DSC 분석, 5.-SHG 현미경 검사 법.</li>
</ol>4. 지역 DSC 분석을 위해
<ol><li>
치료 눈: 4 scleral 분야에서에서 잘라 나머지 scleral 컵은가 위 주사의 사이트 상단 부문에 있으며 중앙 정렬 있도록. 잘라 모두 측면 (즉, 비 강 및 임시), 측면과 하단에서 남은 3 분야. 참고: 그림 1A에 시연은 (1-4) 사각형 (1-16)으로 더 분할 되는 섹터의 번호 매기기.</li>
	<li>약 4 x 4 mm 각의 작은 사각형 (1-16)에 scleral 분야 (1-4) 잘라. 섹터 1 9 사각형 (개별 사각 [스퀘어 2] 주입의 정확한 사이트 확인)으로 나눌 수 합니다. 2 및 3 2 사각형으로 (정사각형 10-11, 12-13) 분야 및 부문 4 3 사각형 (사각형 14-16)으로 나눕니다.</li>
	<li>주입 영역의 위치에서 분석 된 조직의 거리를 지역화 하려면 그림 1A와 같이 각 사각형에 숫자를 할당 합니다.</li>
	<li>
제어 눈: 후 다음 위치에서 조직의 사각형 조각을 잘라 4 scleral 섹터 (치료 조직에 유사한)에 나누어 조직: 3 사각형 상위 섹터 (섹터 1)에서 각 측 (분야 2, 3), 그리고 1에서 1는 하단 부문 (부문 4)입니다.</li>
	<li>나머지 망막과 안 층 떨어져 긁 고 씻어 두 번 신선한 PBS 각 시간 약 10 솔루션에 잠긴 조각을 떠나 한 번에 s.</li>
</ol>5. 대 한 SHG 이미징
<ol><li>가 위를 사용 하 여 중앙 정렬 하는 주입의 사이트는 1 x 1 cm 영역을 만들려면 sclera의 상단 부분을 잘라.</li>
	<li>나머지 망막 및 맥락 막 층 떨어져 긁 고 씻어 두 번 신선한 PBS 약 10 솔루션에서 조각을 떠날 때마다 s.</li>
	<li>장소 1 mL 튜브에 조직 이미징 시설에 수송을 위한 PBS 솔루션으로 가득합니다. 모든 절차, 보육 시간에 따라 안구의 해 부 시작 1 시간 내에서 수행 되어야 합니다.</li>
</ol>6. 현미경 검사 법 프로토콜
참고: 이미지 다시 흩어져 SHG 신호 sclera 조직의 콜라겐에서이 프로토콜은 레이저 현미경 검사에 대 한 지어진 다.
<ol><li>
현미경 검사 법 설정
	<ol>
<li>최대화 하기 위해 신호 및 해상도 렌즈를 사용 하 여 수행 SHG 현미경 빛과 높은 수 가늠 구멍 (NA)와 적외선 전송 최적화. 우리의 목표는 니콘 Apo LWD 25 x / NA1.1 물 침수.</li>
		<li>Coverslip 0.17 밀리미터의 두께이 경우에 샘플의 깊이 맞게 렌즈의 교정 칼라를 조정 합니다.</li>
		<li>25 x 객관적 렌즈를 탑재 하 고 윤 활 샘플을 탑재 하기 전에 이미지 표면 커버를 수성 젤의 관대 한 금액을 추가 합니다. 물 기반 젤 실험 기간 동안 증발 하지 것입니다 하 고 따라서 이미지 품질을 유지 합니다.</li>
		<li>episclera와 coverslip 표면 사이 두 개의 25 m m 라운드 coverslips (episcleral 면이 아래로) 제공 최대한 접촉 사이 건조 하지 않고 PBS 1 mL 튜브에서 scleral 조직을 놓습니다. 참고: 조직의 수 또한 발견에 놓일는 coverslip. PBS의 좋은 금액 이미징 동안 수 화 된 조직을 유지 한다. 이 경우에 cellchamber를 조립 후 조직 조각과 PBS 추가 합니다.</li>
		<li>25 m m 라운드 coverslip, 단일 배치 또는 챔버의 하단 부분에는 샌드위치 기법에 셀 챔버를 조립 하 고 챔버 라운드는 봉인 만들려면 아래로 상단 부분을 나사. 밀접 하 게 사용 될 때 최고 coverslip, 인위적으로 병합을 방지 하 고 조직을 손상 아래로 나사 하지 않습니다.</li>
		<li>현미경 단계에서 조직 샘플 셀 챔버를 탑재.</li>
		<li>에 전송 빛 눈 보기에 대 한 현미경을 설정 합니다.</li>
		<li>무대를 놓고는 샘플의 낮은 표면에 초점, 눈 조각을 통해 밝은 분야 검사에 의해 결정 되는 목표의 높이 조정 합니다.</li>
		<li>컴퓨터 모니터를 제외 하 고 모든 조명을 끄고 알루미늄 호 일 시트 현미경 스테이지에 draped 가능한 모니터에서 많은 빛을 차단. 길 잃은 빛 감지기에 도달 최소화 GaAsP NDD 검출기는 높은 감도 저 잡음 수집, 지킬 것 이다.</li>
		<li>소프트웨어의 Ti 패드 패널에서 렌즈 정의가 올바른지 확인 하십시오.</li>
		<li>A1 소형 GUI 패널 이미징에 대 한 IR 레이저를 선택 하 고 NDD 검출기 선택 DAPI 채널 400-450 nm 대역 통과 필터를 장착을 선택 합니다.</li>
		<li>A 1 MP GUI 패널에서 설정 적외선 레이저의 파장 860 및 오픈 셔터.</li>
		<li>레이저 스캐닝 A1 소형 GUI 패널에서 다음과 같이 설정 합니다. 선택: (a) Galvano 스캐너, (b) 단방향 검색, (c) 픽셀 망설임 시간 6.2 µs, (d) 프레임 크기 1024 x 1024 픽셀, (e) 선 평균 2 배 참고: Galvano 스캐너 및 단방향 검색 하면 정확한 포인트에 의해 정렬. 보기의 전체 필드에 대 한 1024 x 1024의 크기는 0.5 μ m /pixel의 픽셀 크기를 변환합니다. 선 평균 이미지에서 총된 소음을 줄일 것 이다.</li>
		<li>레이저 파워 및 검출기 이득을 조정 하 여 A1 소형 GUI 패널에서 이미지를 설정 합니다. 현재 이미지에서 픽셀 휘도 값의 막대 그래프를 표시 하는 테이블을 보고 패널 (Lut)을 엽니다. "찾기" 모드로 라이브 이미징 켜고 레이저 파워 및 검출기 이득을 조정 하 여 픽셀 값의 감지 범위를 극대화. 채도를 하지 마십시오. 일반적인 값은 2.5% 레이저 전원, 2.35 W 860에서의 총에서 및 100 HV (검출기 이득).</li>
		<li>참고:이 설정에 대 한 내부 전원 측정기로 측정 레이저 파워는 5.2 mW. 실험 수행 때마다 다시 조정 레이저 비율 같은 내부 전력 측정은 5.2에서 일정 이미징 세션 간에 mW. 레이저 파워를 설정할 때 주의 해야 합니다. 카멜레온 II 레이저는 3 W 레이저 800 nm와 10% 또는 더 높은 전원 잠재적으로 조직의 손상을 유발 수.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 수집
	<ol>
<li>미리 보기 모드에서 XYZ 개요 도구를 사용 하 여 조직 영역을 스캔 합니다.</li>
		<li>이 모드에서 이미지의 인수를 속도를 더 낮은 해상도 (256 x 256 픽셀 및 아무 선 평균)는 이미지를 설정 합니다.</li>
		<li>5 x 5, 3 x 3, 또는 직물의 전체 표면을 커버 하는 보기의 단일 필드를 캡처하십시오. 개요 캡처 전에 각 위치에서 라이브 "스캔" 모드를 설정 하 고 조직 초점을가지고. 참고 조직의 다른 지구 축 방향으로 약간 다른 위치에 있을 것 이다.</li>
		<li>콜라겐 섬유 보기의 전체 필드에서 특정 위치에 단계를 이동 하려면 개요 도구에서 해당 위치를 두 번 클릭 플랫 영역을 찾아.</li>
		<li>라이브 "스캔" 모드, 플레인 초점에는 목표의 Z 위치를 조정 켜고, Ti 패드를 사용 하 여 Z 드라이브 광학 비행기 10-15 μ m이 하단 레이어 위에 이동.</li>
		<li>1024 x 1024 픽셀, 2 x 선 평균, "캡처" 버튼을 사용 하 여 높은 해상도에서 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>"+" 버튼을 사용 하 여 XYZ 개요에 위치를 저장 합니다. 이렇게 하면 조직의 같은 지역 탈환 하지.</li>
		<li>직물의 각 조각을 위해 겹치지 시야의 10 이미지를 캡처하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. DSC 프로토콜
참고: 조직 준비 지역 DSC 분석을 위해 또는 조직 이미징 SHGM 수행 후에, 완료 되 자 마자이 단계를 진행 합니다.
<ol><li>DSC 팬, 무게와 표시를 준비 합니다. 참고:이 단계 이루어져야 조직 해 부 하기 전에 조직의 건조를 최소화 합니다.</li>
	<li>흡수 성 조직으로 각 scleral 광장을 건조 하 고 이빨된 집게를 사용 하 여 DSC 팬의 바닥에 평평 하다.</li>
	<li>조직 내부와 곱슬 머리 뚜껑 팬 무게 고 무게 젖은 조직을 적용 (샘플의 질량 5 ~ 11 밀리 그램의 범위에 있어야 합니다). 참고: 각 인감 다음 조직 샘플을 진행 하기 전에 뇌관 집게를 사용 하 여 이동 합니다. 팬, 열 분석 이전 물 손실 방지 밀봉 밀폐 된다.</li>
	<li>일단 샘플 구겨지지 DSC 트레이에 지정 된 위치에 놓습니다. 컨트롤에 대 한 6 샘플 및 치료 눈에 대 한 16 이어야 한다.</li>
	<li>소프트웨어 관리, 조직의 무게를 지정 하는 악기를 사용 하 여 메서드를 만들고 실행 하는 다음 매개 변수를 사용 하 여 열 분석: 난방 속도 40 ~ 80 ° C의 온도 범위: 1 ° C/min, 열 흐름: 17.37 mW, 가스 (N2) 흐름: 19.8 mL/min, 가스 압력: 2.2 바.</li>
	<li>완료 되 면, 어떤 열 변성에 전환 온도 피크 발생 관리 소프트웨어 악기를 사용 하 여 추출 하 여 각 샘플에 대 한 데이터를 분석 합니다.</li>
</ol>8. 이미지 분석
<ol><li>
SHG 신호
	<ol>
<li>선택 적어도 5-10의 각 치료 및 그것의 통제에서 가장 대표적인 이미지 같은 이미지의 영역 대부분 콜라겐 섬유에 의해 점유 된다.</li>
		<li>ImageJ 소프트웨어에서 각 이미지를 업로드 하 고 선택 하 여 평균 픽셀 강도 측정 분석 > 측정 활성 이미지에 대 한.</li>
		<li>추출 값 평균 픽셀 강도로 보고 하 고 메뉴에서 선택 하 여 농도의 히스토그램을 그려서 표시 또한 수 있습니다 분석 > 히스토그램.</li>
		<li>따라 모든 측정된 데이터를 문서에 테이블을 만들고 Excel 시트를 사용 하 여 샘플 id입니다.</li>
		<li>평균 및 각 치료 및 제어 조건에 대 한 픽셀 강도의 표준 편차를 계산 합니다.</li>
		<li>학생의를 사용 하 여 t-검정, 농도 (즉, 0과 0 대 400 mM 서울시 대 40 m m SMG)의 모든 인덱스도 비교에 대 한 차이 비교 합니다. [P≤0.05]입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
파형
	<ol>
<li>콜라겐 섬유를 표시 하는 이미지를 선택 합니다. 샘플 당 적어도 10 이미지 (를 포함 하 여 각 농도-총에서 40 이상에 대 한 컨트롤 샘플) 분석 되어야 합니다.</li>
		<li>오픈 ImageJ > 플러그인 > NeuronJ. NeuronJ 사전 설치를 해야합니다.</li>
		<li>모든 imagesby는 열린된 NeuronJ 창에 드래그를 업로드 합니다.</li>
		<li>마우스로 fibril의 윤곽에 따라 섬유를 따라 추적 선 만들기 (그리기 태블릿 펜 사용 될 수), 총 섬유 길이의 거리를 측정 하는 M을 클릭 합니다.</li>
		<li>접선 직선을 그릴 시작과 이전 그려진된 섬유 윤곽선의 끝 연결을 "옵션"을 선택 합니다. 엔드-투-엔드 길이 측정 하는 M을 클릭 하세요.</li>
		<li>이미지 당 적어도 10 소에 동일한 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>10 소의 각각에서 그 두 측정을 수집 하 고 각각 길이 [곡선] 및 [선형], 길이 총 섬유 길이 (윤곽선) 및 엔드-투-엔드 길이 (바로 연결 라인)을 표현 하는 excel 스프레드시트에 데이터를 입력 합니다.</li>
		<li>계산 하는 수식을 사용 하 여 파형 인덱스 (W): W = 길이 [곡선] / [선형] 길이.</li>
		<li>수식을 사용 하 여 컨트롤 샘플에서 이미지와 함께 대우 samples(SMG)의 이미지에서 데이터를 비교 하는 파형의 %를 계산: (W [서울시]-1) / (W [제어]-1)</li>
		<li>통계의 차이점 (p-값) 콜라겐 섬유 형태학의 다른 처리 조건 및 제어를 결정 하기 위하여 파형 인덱스 (W)에 대 한 인덱스도 t-테스트를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

실시 실험 콜라겐 cross-linking sclera, cross-linking 치료에 대 한 모니터링 도구로이 기법을 사용 하 여 미래의 가능성 제기에 효과의 평가 위한 방법으로 SHG 신호 현미경의 사용을 지 원하는 증거를 나타났습니다. 그는 콜라겐 단백질을 대상. 메모의 악기는 이미 잠재적으로이 SHG 신호를 캡처할 수 있는 임상 사용 중에서입니다. 이 악기는 주로 이미징 피부 인간의 피에 대 한 설계, 이미지 각 막과 공 막23성공적으로 사용 되어 있다.
동일한 검색 및 제어를 비교할 때 조건 이미지를 유지 하기 위해 필요한 샘플을 처리 하 고. 2 고조파 세대 sclera 조직에 콜라겐의 현미경 필요 호환 다 광자 영상, 형광 현미경 펄스 적외선 레이저는 GaAsP 등 매우 민감한 검출기에 800-900 nm 파장 범위 조정 비 descanned (NDD) 감지기입니다. 이 원고에 설명 된 지침에는 시작 지점입니다. 조건 또는...

으로 콜라겐 효소 cross-linking 차단 실험 양식 부족 (FD)을 증가 시킬 수 있습니다 (광화학 또는 화학), 비 효소 scleral cross-linking를 통해 치료할 수에 진보적인 근 시 가정은-유도 근1. Elsheikh 및 필립스2 최근 타당성과 표준 A 자외선 방사선 (UVA)를 사용 하 여의 가능성 논의-리 보 플 라빈 광화학 cross-linking (드레스덴 프로토콜 라고도 함), 약식 중재 (리 보 플 라빈 CXL) 여기 근 시 축 신장 중단 후부 scleral 안정화. 이 광화학 방법 keratoconus와 포스트 LASIK keratectasia에서 본 앞쪽 글로브 표면 (즉, 불 룩 한 각 막)의 불안을 치료에 성공적으로 사용 되었습니다. 그러나,의 공 막이 CXL 프로토콜 응용 프로그램 액세스는 자외선 (UV) 광원, 뿐만 아니라 훨씬 더 조직 표면 영역을 수정 하려면 필요 후부 sclera에 어려움에 관련 된 문제에 의해 방해 된다. 비록 후부 sclera의 여러 지역 여러 별도 방사선 조사 영역 그 연구3에 필요한 토끼 (tarsorrhaphy)에 의해 박탈 그 말했다 되는, CXL 접근 사용 되었습니다 시각적 형태로 축 신장 중단 하. 대조적으로, 화학 안정화 에이전트의 (즉, cross-linking 대리인) 세인트 공간을 통해 주입 UV 광원 도입에 대 한 필요성을 피하고 후부 sclera를 수정 하는 간단한 방법을 대표할 수 있었다. 이 주입 기술은 백 내장 수술4,,56등 안과 절차 동안 안구 마 취를 유도 하는 유용한 방법으로 유명 하다. Wollensak7 glyceraldehyde (화학 가교 에이전트 에이전트 (FARs)이이 연구에서 설명 공개 포름알데히드 비슷한 개념)를 사용 하 여 성 주사를 사용 하 여 위에서 설명한는 토끼 sclera 및 genipin 완고 하는 FD 기니 피그8,9축 길이 제한 하는 것을 보였다. 이 광화학 CXL 기술을 통해 수용 성 화학 약품을 사용 하 여의 명확한 이점을 설명 했다. 따라서, scleral cross-linking FARs (즉, 광장)를 포함 하 여 어떤 종류의 주 사용 화학 약품을 사용 하 여10, scleral 신장에서 근 시의 진행을 중단 하는 가능한 치료 방법을 제공할 수 있다.
여기에 제시 된 프로토콜, 싱가포르로 토끼 눈의 공 막 엔 세인트 주입을 통해 전달의 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시), 화학 가교 솔루션 사용 하 여. 우리는 각 막에 국 소 화학 cross-linking 이전 유사한 프로토콜을 실행 했다. 그 이전에 보고 된 연구에 특히 집중 효과 cross-linking 종속 얻어질 수 효과 범위를 넘어서는 열 변성 분석11 정한 광화학 CXL와 달성 스패닝 SMG를 사용 하 여 .
여기는 성 주사 scleral 조직, 차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC), 그리고 두 번째 고조파 세대 현미경 검사 법 (SHGM)를 사용 하 여 열 변성을 통해 전달 하는 SMG의 가교 효과 평가 하기 위해 프로토콜에 설명 합니다.
차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC), 라고도 열 분석를 사용 하 여 열 변성 변화 측정, scleral 조직에는 주로 그들은 대량 대다수 구성 이후 원 collagens의 속성에 의해 유도 단백질. 이 메서드는 콜라겐 분자 구조의 안정성과 교원 질 소 주 3 차 단백질 구조 안정화 복사해올된 채권 평가 합니다. DSC에 난방, 동안 중요 한 전환 온도 트리플 헬릭스, 젤라틴으로 알려져 일반적으로 형성 하는 과정의 풀기 결과 콜라겐 분자의 변성 결과 얻을 수 있다. 이 열 변성 콜라겐 분자를 따라 수소 결합을 방해 하 고 유도 가교 방법12,13더 높은 온도에 이동 될 수 있다. 이 방법은 특히 바이오 산업에에서 많은 십 년간 동안 그리고 가죽 만들기를 포함 하는 프로세스에 대 한 사용 되었습니다. 그러나,이 메서드 sclera 조직 추출 필요 하며 따라서만 수 비보 전 기법으로.
2 차 고조파 생성 현미경 (SHGM) 비 centrosymmetric 분자 환경 특정 재료의 비선형 광학 특성을 기반으로 합니다. 같은 자료, 강렬한 빛에에서 예 빛 레이저에 의해 생성 하, SHG 신호, 사건 빛 주파수에서 두 배가 됩니다 생성 합니다. SHG 신호를 만드는 것으로 알려진 생물학 물자는 콜라겐, microtubules, 및 근육 myosin. 예를 들어 콜라겐 860 nm 파장의 적외선으로 흥분된 430 nm 파장을 가진 보이는 범위에서 SHG 신호를 방출 합니다. 둘째로 고조파 생성 (SHG) 신호 영상 치료 콜라겐 cross-linking 평가 하는 유망한 방법 이다. 그것은 30 년 이상에 대 한 조직에 콜라겐 소 SHG 신호14방출 알려져 있다. 그러나, 최근에 수 고해상도 이미지 얻을 수15 콜라겐 젤19와 조직, 힘 줄16, 피부, 연골17,18, 혈관 등의 다양 한에서.
이 지식을 바탕으로,이 연구 서울시 화학적으로 유도 된 콜라겐의 cross-linking 통해 sclera에 유도 SHG 신호 변화를 평가 합니다. 결과 표시는 공 막의 SMG 수정 SHG 신호 조직 콜라겐 섬유 번들 (높은 순서 제 사기 구조 교원 질 소의 구성)에서 생산을 증가 하 고 또한 콜라겐에 구조적인 형태 론 적 변화를 생산 하 고 섬유 네트워크, 섬유 번들 "교정."에 반영

<table><tbody><tr><td>MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td><td>EMD Millipore, Massachusetts, USA</td><td></td><td>이중 증류수, 탈이온수. - 프로토콜 단계 1.1.1</td></tr><tr><td>나트륨 하이드록시메틸글리시네이트&nbsp;</td><td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td><td></td><td>가교 시약 - 프로토콜 단계 1.1.2</td></tr><tr><td>루어락 주사기가 있는 주사 바늘</td><td>BD Eclipse, NJ, USA</td><td></td><td>서브 테논 주사기용 주사기. - 프로토콜 단계 2.1</td></tr><tr><td>토끼 머리</td><td>La Granja 가금류</td><td>Outbred</td><td>토끼 머리는 사후 1시간 이내에 분리되어 전달됩니다. - 프로토콜 단계 2.2</td></tr><tr><td>Tono-pen&nbsp;</td><td>Reichter Technologies Depew, NY</td><td></td><td>IOP 측정 - 프로토콜 단계 2.4</td></tr><tr><td>DSC 6000 자동 샘플러</td><td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td><td></td><td>열 변성 분석기 - 프로토콜 단계 7.4</td></tr><tr><td>Pyris 소프트웨어&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td><td>버전 11.0</td><td>&nbsp; 프로토콜 단계 7.5</td></tr><tr><td>CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td> 작동 <td>거리가 2.0mm인 높은 IR 투과율을 가진 침수 대물렌즈 - 프로토콜 단계 8.1.1.</td></tr><tr><td>겐틸&nbsp;</td><td>알콘, 포트워스, 텍사스&nbsp;</td><td>B000URVDQ8</td><td>증발을 방지하기 위해 물 대신 객관적인 침수 매체로 사용되는 수성 젤 - 8.1.1</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II&nbsp;</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>Ti:80MHz에서 140fs 펄스 폭과 680nm에서 1080nm까지 조정 가능한 범위를 가진 사파이어 펄스 레이저. - 프로토콜 단계 8.1.11</td></tr><tr><td>AttoFluor cell chamber</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>A7816</td><td>커버 슬립 고정 - 프로토콜 단계 8.1.3</td></tr><tr><td>25mm 원형 커버 슬립, #1.5</td><td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, 미국</td><td>GG-25-1.5</td><td>프로토콜 단계 8.1.3</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>프로토콜 단계 8.1.4.</td></tr><tr><td>Non-descanned (NDD) GaAsP 검출기</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>400-450 nm 대역 통과 필터 장착 - 프로토콜 단계 8.1.7</td></tr><tr><td>A1R-MP 레이저 스캐닝 시스템</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>적외선(IR) 다광자 여기와 호환됩니다. - 프로토콜 단계 8.1.8</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td>Ver 4.3</td><td>본문에서 "소프트웨어"로 언급됨 - 프로토콜 단계 8.1.9</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>&nbsp; 프로토콜 단계 9.1.2</td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td><td></td><td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, 프로토콜 단계 9.2.2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td><td>Ver 14</td><td>프로토콜 단계 9.2.8</td></tr></tbody></table>

치료 조직 (txl) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 sclera에 제 2 고조파 발생 신호

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

치료에 대 한 구조 단백질 (원 collagens)로 화학 채권 (비 효소 cross-linking)을 도입 하 여 조직을 강화 하는 방법 등 광화학 cross-linking 조직 cross-linking (TXL) 방법. 유도 하는 기계적 조직 속성 변경에 대 한 이러한 메서드는 고용 되 고 각 막에 원추 각 막으로 진보적인 근 시에서 sclera (기계적으로 약화) 각 막 숱이 장애에 숱이 고 뒷부분의 약화 공 막과 가능성이 축 신장에 기여 한다. 이러한 조직 강화에 대 한 기본 대상 단백질은 원 collagens 각 막과 공 막에 건조 중량 단백질의 대다수를 구성 하는. 우연히, 원 collagens 조직 세포 외 공간에서 제 2 고조파 발생 신호의 주요 원천입니다. 따라서, 콜라겐 단백질 요법, cross-linking를 통해 유도 등의 수정 수 잠재적으로 감지 되며 두 번째 고조파 세대 현미경 (SHGM) 통해 quantitated. 레이저 적외선 여기 가벼운 현미경 시스템을 스캔을 사용 하 여 신호 모니터링 SHGM 소스는 즐기고 생명 과학 분야에서 광범위 하 게 사용 하는 흥미로운 현대 이미징 방법입니다. 따라서, 현재 연구 에이전트 하위-장부의 공간 (sT), cross-linking 화학 물질의 주입에 따라 토끼 sclera, ex vivo에서 에서 가교 효과 유도 하는 측정 하는 수단으로 SHGM 현미경 검사 법의 사용을 평가 하기 위하여 착수 했다는 사출 접근 즉 안구 마 취 안과 임상 절차 동안에 원인에 대 한 표준 연습. 에이전트 cross-linking 화학 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시), 에이전트 (FARs)를 방출 하는 포름알데히드로 알려진 화장품 방부 제의 클래스입니다. SMG와 반응에 따라 scleral 변경 SHG 신호 증가 귀착되 고 열 변성 온도에 변화를 서로 평가 하는 표준 방법을 유도 효과 cross-linking 조직.

광장 cross-linking 효과 평가 하는 시험 방법으로 열 변성 온도 (Tm): 토끼 눈의 16 쌍의 총 의회 절차에 대 한이 실험에서 사용 되었다. 이 연구의 초기 부분으로 싱가포르로 토끼 머리에 세인트 공간 통해 SMG 상호 에이전트의 단일 주사에 의해 유도 된 가교 효과의 지역화 평가 했다. 실험의이 유형은 하나 이상의 위치에 주사 sclera의 원하는 영역을 안정화 하는 데 필요한 수 때문에 환자의 임상 치료에 관련이 있다.
것입니다 기본적인 확산 원리에 따라 예측할 수, 효과가 했다 큰 주사의 사이트에서 솔루션의 농도 따라 인접 한 지역 뿐만 아니라, 유도 하는 효과 함께. 그림 1A scleral 분야 (빨간색 빈 번호 글꼴에서 1-4) (더 사각형 (1-16 검은...

이 프로토콜의 둘째로 고조파 생성 이미징 및 차동 주사를 사용 하 여 토끼 sclera cross-linking 화학 평가 기법을 설명 합니다.

치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 서브 테논의 포름알데히드 방출제 주입에 의해 유도되고 시차 주사 열량계로 확인된 바와 같이 공막 조직에서 콜라겐 가교 효과를 시각화하고 측정하기 위해 2차 고조파 생성 현미경을 사용하는 것을 입증하는 것입니다. 이 방법은 유도된 가교 효과를 평가하기 위한 비침습적 방법을 제공함으로써 치료 조직 가교 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 2차 고조파 생성 신호가 콜라주 원섬유에 매우 특이적이기 때문에 항체 염색과 같은 특별한 조직 준비가 필요하지 않다는 것입니다.이 방법에 대한 아이디어는 치료용 각막 조직 가교에 적용되는 절차에 대해 읽었을 때 처음 떠올랐습니다. 성공적인 2차 고조파 발생 현미경 검사는 조직을 신중하게 배치하고 올바른 이미징 조건을 설정하여 신호 측정에서 조직 손상 및 아티팩트를 방지해야 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 입증하는 것이 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 토끼의 안구에 서브테논 주사로 치료를 시작합니다.여기에 표시는 서브 테논의 주입 부위를 개략적으로 표현한 것입니다. 눈의 크기에 따라 최적의 크기의 검경을 선택합니다. 3시간 30분의 배양 후 눈꺼풀 검경을 사용하여 눈꺼풀을 후퇴시켜 지구본에 대한 접근을 최적화합니다.윤부를 둘러싼 결막을 분리하고 공막 삽입 부위에서 여분의 안구 근육을 절단합니다. 공막의 윗부분을 가위나 칼날로 잘라 주사 부위가 중앙에 위치한 1cm 단위의 영역을 만듭니다. 남아 있는 망막층과 맥락막층을 긁어내고 새 PBS로 두 번 씻어내고, 매번 약 10초 동안 조각을 용액에 그대로 둡니다.이미징 시설로 운송하기 위해 PBS 용액으로 채워진 1밀리리터 튜브에 조직을 넣습니다. SHG 현미경 검사를 수행할 때 신호와 해상도를 최대화하려면 적외선을 투과하도록 최적화되고 개구수가 높은 대물 렌즈를 사용하십시오. 샘플의 깊이에 맞게 렌즈의 보정환을 조정합니다.이 경우 0.17mm입니다. 현미경에 25배 대물 렌즈를 장착하고 렌즈 표면을 덮기 위해 충분한 양의 수성 침지 젤을 추가합니다. 조직을 수화한 상태로 유지하고 렌즈 대물렌즈와 슬라이드 사이의 이멀젼 젤이 건조되는 것을 방지하기 위해 SHG 신호에 변화를 일으킬 수 있으므로 현미경에 샘플을 장착한 후 30분 이내에 조직 이미징을 수행하는 것이 중요합니다.챔버 하단 부분에 25mm 원형 커버 슬립을 배치하여 셀 챔버를 조립합니다. 공막

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

각막 콜라겐 가교(CXL)는 각막 기질의 생체역학적 강성을 개선하여 원추각막 진행을 멈추기 위해 현재 사용할 수 있는 유일한 보존 치료법입니다. 본 논문의 목적은 CXL의 세 가지 프로토콜, 즉 기존 CXL(C-CXL), 가속 CXL(A-CXL) 및 이온토영동 CXL(I-CXL)의 방법을 강조하는 것입니다.

원추 각막의 각막 콜라겐 가교의 세 가지 서로 다른 프로토콜 : 기존의가, 가속 및 이온 토 포레 시스

우리는 축 신장 토끼 눈에 리보플라빈과 UVA와 공막 가교의 효과를 보여줍니다. 축 방향 신장은 오른쪽 눈의 눈꺼풀 (안검 봉합을) 봉합하여 (남성과 여성) 십삼일 된 뉴질랜드 토끼 유도 하였다.

공막 래빗 모델에 축 방향 근시의 예방 리보플라빈 및 자외선-A 방사선을 사용하여 교차 결합

망막 색소 상피 (RPE) 대체 전략 및 유전자 기반 치료는 여러 망막 퇴행성 조건이 고려된다. 임상 번역, 큰 눈 동물 모델은 환자에 적용 할 수있는 수술 기법을 연구해야합니다. 여기에서 우리는 다양하고 비용 효율적인 RPE 이식에 맞 망막 수술 토끼 모델을 제시한다.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

여기를 사용 하 여 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (HR-SD-10 월) subretinal 공간으로 유전자 치료 대리인의 납품을 지원, 그 영역 범위를 평가 하 고 포토 리셉터 활력을 특성화 새로운 접근 방식을 설명 합니다.

초고 해상도 마우스 광학 일관성 단층 촬영 망막 유전자 치료 연구에서 안 구내 주사를 돕기 위해

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

이 원고 소설 설정과 운영 photoacoustic 현미경와 토끼 같은 더 큰 동물의 비 침범 성, 레이블 없는 chorioretinal 이미징 광학 일관성 단층 촬영 듀얼 모달 시스템의 절차에 설명 합니다.

살아있는 토끼 눈에 소설 Photoacoustic 현미경 및 광학 일관성 단층 촬영 듀얼 적임 Chorioretinal 이미징

이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

토끼의 각막 기질 상처 수리를 위한 현장 블루라이트-가교 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 제조, 농축 및 적용을 위한 재현 가능한 프로토콜이 제시되었으며, 수술 처리, 부분 족근경 및 수술 후 관리를 위한 절차적 단계를 포함합니다.

토끼의 각막 상처 수리를 위한 강화 광가교 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 제작 및 외과적 적용

흉부 종양학 데이터베이스는 translational 연구의 목적을 위해 임상 실험 데이터에 대한 포괄적인 저장소 역할을하도록 개발되었습니다. 데이터베이스는 흉부 종양학 연구 프로그램의 translational 암 연구자를 제공합니다. 이 데이터베이스는 다른 암 모델뿐만 아니라 다른 사람의 질병에 적용할 수 있습니다.

종합 흉부 종양학 데이터베이스의 생성 - Translational 연구 도구

배우세요 제2고조파 발생 현미경법을 이용하여 토끼 공막 조직의 콜라겐 가교 효과를 시각화하고 측정하는 방법을. 이 비침습 기법은 치료 조직 가교 연구에 신뢰할 수 있는 평가 도구를 제공합니다.

치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호

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