FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 FITC 표지 알부민의 경정맥 내 주사에 의한 퇴행성 장애의 마우스 모델에서 뇌-혈액 장벽 투과성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 뇌 항상성 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 혈액-뇌 장벽 손상과 신경 퇴행 사이의 가능한 연관성을 조사하는 것이 특히 유용할 수 있습니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 빠르고 쉽게 수행할 수 있으며 더 큰 동물 모델 및 기타 신경 병리학적 설정에도 적용할 수 있다는 것입니다. FITC-알부민의 경정맥내 주사 수술 절차를 시연하는 사람은 Luca Capocci입니다. 살바토레 카스탈도(Salvatore Castaldo)는 뇌의 조직학적 절단을 시연할 것입니다.

그리고 Enrico Amico는 현미경 사진 획득 절차를 시연할 것입니다. FITC-알부민 분말을 인산염 완충 식염수에 10밀리리터로 용해시켜 FITC-알부민 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 오토클레이브 수술 기구를 배치합니다.

70% 에탄올로 수술 벤치를 청소하고 수술용 멸균 일회용 드레이프를 놓습니다. 그런 다음 작동 실체 현미경을 설정합니다. 적절한 케타민 자일라진 용액을 복강내 주사로 마우스에 마취한 후, 발가락을 부드럽게 꼬집어 금단 반사가 없는지 확인하여 동물 진정을 모니터링합니다.

마취된 마우스를 앞면이 위로 향하게 누운 자세로 놓고 접착 테이프로 수술 작업대에 4개의 다리와 꼬리를 고정합니다. 마우스를 고정한 후 목의 적절한 수술 가장자리를 조심스럽게 면도하고 70% 에탄올의 포비돈-요오드 용액으로 소독합니다. 노출된 면도 표면을 면봉으로 말리십시오.

다음으로, 쇄골 중간선을 1.5cm 길이로 절개하여 흉부 중간에서 시작하여 목 바로 아래까지 뻗어 현미경 관찰 하에 겸자로 결합 조직을 조심스럽게 펴서 외부 경정맥을 노출시킵니다. FITC-알부민 용액의 주입을 위해 30 및 반 게이지 바늘의 삽입을 용이하게 하기 위해 경정맥의 오른쪽과 왼쪽에 충분한 공간을 확보하십시오. 100 μm의 10 밀리리터 FITC- 알부민을 3 분에 걸쳐 오른쪽 경정맥에 주입합니다.

이 단계는 절차 중 가장 중요한 단계입니다. 바늘을 잘못 삽입하면 정맥 벽이 돌이킬 수 없는 손상을 입고 전체 실험을 손상시킬 수 있습니다. 주사 후 15분 후, 참수로 쥐를 안락사시킨 후, 두개골에서 뇌를 빠르게 제거하고 뇌의 10배인 미리 식힌 이소펜탄에 15분 동안 담근다.

이소펜탄이 얼어붙은 뇌를 미리 냉각된 튜브에 넣고 조직학적 절편이 이루어질 때까지 섭씨 80도의 냉동고에 보관합니다. 저온 유지 장치 절편 전에 얼어붙은 뇌를 최적의 절단 온도 화합물에 내장합니다. 저온 유지 장치로 뇌를 20미크론 두께의 절편으로 자르고 현미경 유리 슬라이드에 장착합니다.

앞서 설명한 바와 같이 특정 항 라미닌 항체를 사용하여 FITC-알부민 라미닌 동시 염색을 수행합니다. DAPI가 포함된 장착 매체로 슬립 슬라이드를 덮고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 밤새 건조시킵니다. 다음날, FITC와 Cy3 필터를 모두 장착한 형광 현미경으로 20배 배율

사용 약 10분 전에 형광 램프를 켭니다. 현미경, 연결된 컴퓨터 및 디지털 카메라를 켭니다. 이미지 분석 소프트웨어를 실행합니다.

최적의 신호 수집 및 공간 분해능을 위해 적절한 대물렌즈를 사용하고 적절한 필터를 선택합니다. 뇌 슬라이스당 최소 4개의 24비트 색상 노출을 획득합니다. 무료로 제공되는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 단일 채널의 형광 강도를 분석합니다.

뇌 동결절편의 다음의 대표적인 형광 현미경 사진은 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 녹색 형광 알부민의 차별적 분포를 보여줍니다. 여기에 표시된 빨간색 염색은 생리학적 조건 및 혈액-뇌 장벽 손상 조건에서 혈관 마커인 라미닌을 나타냅니다. 이러한 병합된 이미지는 녹색 형광 알부민과 라미닌의 공동 국소화와 함께 손상되지 않은 혈액-뇌 장벽과 손상된 혈액-뇌 장벽에서 핵의 DAPI 염색을 보여줍니다.

이 그래프는 FITC-알부민에 의해 방출되는 녹색 형광의 정량화를 표시하며, 이는 건강한 조건과 손상된 조건 모두에서 녹색 형광 강도로 보고됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 시약을 새로 준비하고 수술 벤치에 배치하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 녹색 형광 알부민이 뇌 실질에 부착되는 것을 측정하여 신경퇴행성 질환의 동물 모델에서 혈액 뇌 장벽의 투과성을 평가하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.