MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 소분자 화합물인 PD0325901와 비타민 C를 사용하여 마우스 배아 줄기 세포에서 저메틸화 및 만능 상태를 유지하는 것입니다. 이 방법은 형태학의 이질성 및 탈과메틸화와 같은 FBS 배양 마우스 배아 줄기 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술의 주요 장점은 마우스 배아 줄기 세포가 우수한 형태와 저메틸화 및 미분화 상태를 유지할 수 있다는 것입니다.

플레이트와 완충액을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 마우스 ES 세포, 배양 배지, 트립신 및 PBS를 섭씨 37도의 수조에서 예열합니다. 세포를 계대에 넣으려면 접시에서 배지를 흡인하고 2밀리리터의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 세포에 0.3ml의 트립슨 EDTA를 첨가하고 접시를 빠르게 기울여 용액의 세포를 덮습니다.

즉시 트립신을 제거하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1분 동안 배양하여 세포를 분리합니다. 2ml의 예열된 혈청 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 5ml 피펫을 사용하여 세포 콜로니를 단일 세포 현탁액으로 10회 다시 현탁시킵니다. 150마이크로리터의 세포 용액을 젤라틴으로 코팅된 새로운 6cm 접시에 넣고 갓 만든 VCPD0325901배지 3ml를 보충합니다.

섭씨 37도에서 세포를 배양하고 CO2 5%를 이산화시킵니다. Vc의 불안정성으로 인해 배양하는 동안 24시간마다 오래된 배양 배지를 제거하고 3밀리리터의 새로운 Vcpd0325901 배지를 추가합니다. 70-80%의 포화도에 도달한 후 세포를 통과시키고 방금 설명한 대로 배양을 계속합니다.

DNA 추출을 수행하려면 앞에서 설명한 대로 트립신으로 세포를 수집하고 제조업체의 지침에 따라 게놈 DNA 정제 키트를 사용합니다. DNA 튜브에 100마이크로리터의 초순수를 넣고 약 15회 피펫팅하여 DNA를 용해시킵니다. 그런 다음 분광 광도계를 사용하여 Od260 대 280 비율을 측정하여 DNA의 농도와 품질을 결정합니다.

DNA 농도는 마이크로리터당 약 500노그램이어야 합니다. 다음으로, 5마이크로그램의 DNA를 100밀리몰 트리스 하이드로클로라이드 PH7.6 5마이크로리터, 송아지 장 포스파타제 2단위, Dnase 1 1단위, 뱀독 0.005 단위, 포스포디에스테라제 1과 결합하여 분해합니다. 그런 다음 초순수를 사용하여 부피를 50마이크로리터로 올립니다.

밤새 섭씨 37도에서 반응을 배양합니다. 이튿날 아침, 1개에 원심분리에 의하여 표본을 모으십시오, 1 분 동안 실내 온도에 000xg. 그런 다음 용액을 한외 여과 튜브로 옮기고 소화 효소를 제거하기 위해 30분 동안 섭씨 13, 000xg 및 4도에서 샘플을 회전시킵니다.

5HMC 분석을 위해 샘플을 준비하려면 여과액 36마이크로리터를 새 1밀리리터 튜브로 옮기고 4마이크로리터의 D35HMC를 추가하여 최종 농도 3나노몰을 만듭니다. 5MC 분석의 경우, 196마이크로리터의 초순수를 새로운 원심분리기 튜브에 피펫으로 주입하고 게놈 DNA에 5MC의 밀도가 높기 때문에 4마이크로리터의 여과액을 첨가합니다. 36마이크로리터의 희석된 5MC 용액을 새 원심분리기 튜브에 옮기고 4마이크로리터의 D35MC를 추가하여 최종 농도를 50나노몰로 만듭니다.

D35HMC 및 D35MC를 내부 표준으로 사용하여 각각 5HMC 및 5MC를 교정합니다. UHPLCMS 소프트웨어에서 5MC 및 5HMC를 분석하기 위한 매개변수를 설정한 후 텍스트 프로토콜에 따라 MS QQQ를 클릭하여 QQQMSM에 대한 매개변수를 설정합니다. 중지 시간(Stop time)에서 제한 없음(No limit)/펌프로(As Pump)를 선택합니다.

이온 소스(Ion source)에서 ESI를 선택합니다. 시간 필터링의 경우 피크 너비를 선택하고 0.07분을 입력합니다. 시간 세그먼트를 설정하려면 시작 시간(start time)에서 0을 선택합니다.

MRM에서 스캔 모드를 설정하여 열의 암시를 분석하려면 스캔 유형에서 MRM을 선택합니다. Div Value(Div 값)에서 To MS(MS로)를 선택합니다. 델타 EMV 플러스의 경우 200을 입력하고 델타 EMV 마이너스의 경우 0을 입력합니다. 먼저 MSQQQ one acquisition을 클릭하여 전환을 모니터링하기 위한 매개 변수를 빌드합니다.

스캔 세그먼트를 설정하려면 드웰에 90을 입력합니다. 프래그먼트 전압(Fragmentor)을 설정하려면 90을 입력합니다. 충돌 에너지에 5를 입력합니다.

셀 가속기 전압에 4를 입력합니다. 양이온 모드를 설정하려면 Polarity(극성)에서 positive(포지티브)를 선택합니다. 모노뉴클레오시드의 UHPLC 분리를 수행하려면 용액 a에 대해 500ml의 초순수와 500마이크로리터의 포름산을 혼합하여 5MC 및 시토신의 암시에 대한 용액 a와 b를 준비합니다.

그런 다음 500 밀리리터의 100 % 메탄올과 용액 b를 측정합니다. 용액 a와 용액 b를 95 대 5 부피 대 부피 비율로 5MC 및 C.Then을 용리하기 위해 이동상으로 측정한 다음 유속을 분당 0.25 밀리리터로 설정합니다. 최적화된 그라디언트 암시를 사용하여 5HMC를 분리합니다.

그런 다음 유속을 분당 0.25밀리리터로 설정합니다. 5MC, D35MC, DC, 5HMC 및 D35HMC에 대한 전이를 모니터합니다. 모세관 전압을 3, 500볼트로 설정합니다.

그런 다음 주입량을 5마이크로리터로 설정하고 각 샘플을 세 번 분석합니다. 해당 표준 곡선을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 5MC 및 5HMC의 양을 평가합니다. UHPLC MSMS에 의한 마우스 ES 세포의 게놈 DNA 분석에서 볼 수 있듯이, VcPD0325901 처리는 DNA 메틸화가 더 빠르게 감소하고 5일 후에 안정적인 5MC 수준에 도달한 반면, Vc 2i 처리는 11일째에 비슷한 수준에 도달했습니다.

이 그래프는 Vc 함유 처리가 하루 후 5HMC 빈도를 급격히 증가시킨 후 5MC 기질의 점진적인 감소로 인해 5HMC 수치가 점차 감소했음을 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 세포가 PD0325901로 후퇴할 때 Prdm14가 현저히 상승한 반면, Dnmt3b와 그 보조 인자인 Dnmt3l은 상당히 하향 조절되는 것으로 나타났으며, 이는 5MC를 제거하는 PD0325901의 작용을 나타냅니다. 이 알칼리성 인산가수분해효소 분석법에서 마우스 ES 세포는 VcPD032590에서 26일 동안 배양했을 때 모두 공 모양의 형태로 보라색으로 염색되어 미분화 상태를 나타냈습니다.

대조적으로, 배지를 단독으로 포함하는 FBS에서 성장한 세포는 색이 옅게 보였으며 부분적인 퍼짐은 부분적인 분화를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 FBS를 사전 스크리닝해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

또한 통로를 통해 세포를 과도하게 피펫팅하지 말고 VcPDO325901 배양 배지를 매일 교체하십시오. 이러한 개발 이후, 이 기술은 생쥐 ES 세포를 in vitro에서 배양하는 분야의 연구자들이 in vitro 배아의 발달 및 과정과 재생 의학에 대한 의학적 관련성을 가진 생성된 세포를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 두 개의 소분자 성분인 MEK 억제제 PD0325901를 사용하여 마우스 ES 세포의 성장 형태와 과메틸화 및 복수 강력 상태를 유지하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.

Trisol, DMS 또는 PMS 및 DTT로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 마스크 및 고글 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.