여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

이 절차의 전반적인 목표는 라벨링된 기질을 사용하여 여러 영양소 공급원의 대사를 정량적으로 조사하는 것입니다. 이 워크플로우를 통해 소비된 영양소의 운명과 효모에 의해 합성된 화합물의 대사 기원을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 환경 조건에 따라 모든 신진대사가 어떻게 작동하는지와 같은 미생물 대사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 여러 출처에서 영양 분포 단백질을 설명하고 정량화할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 효모의 질소 대사를 조사하는 데 사용되었지만 다른 대사 및 미생물에도 적용할 수 있습니다. 이 실험의 성공 열쇠는 발효의 재현성에 있습니다.

사용자는 동일한 정의된 생리학적 단계에서 세포를 수집하는 데 특별한 주의를 기울여야 합니다. 기술 직원의 Christian Picou, 실험실의 박사 과정 학생인 Pauline Seguinot, 박사 후 연구원인 Stephanie Rollero가 절차를 시연할 것입니다. 오토클레이브에서 각 질소원에 대해 준비된 각 합성 매체를 자기 교반 막대가 포함된 1리터 플라스크에 저온 살균합니다.

배지에서 원하는 최종 농도에 도달하기 위해 적절한 양의 라벨링된 분자를 용해합니다. 일회용 진공 여과 시스템을 사용하여 매체를 살균합니다. 멸균 측정 실린더를 사용하여 마그네틱 교반 막대가 포함되어 있고 발효 잠금 장치가 장착된 두 개의 사전 멸균 발효기 사이에서 매체를 나누어 산소의 유입을 피하지만 이산화탄소의 방출을 허용합니다.

YPD 배지에서 세레비시아 균주를 성장시킨 후, 층류 하에서 배양 전 분취액을 수집하고 100마이크로미터 조리개가 장착된 전자 입자 계수기를 사용하여 세포 집단을 정량화합니다. 사전 배양을 원심 분리한 후, 펠릿을 적절한 양의 멸균수에 현탁시켜 2.5 곱하기 10에서 밀리리터당 9번째 세포의 최종 농도를 얻습니다. 그런 다음 각 발효기에 1ml의 세포 현탁액을 접종합니다.

그런 다음 21개 위치 교반 플레이트에 적절하게 배치된 지지 가이드에 발효기를 설치하고 교반 속도를 270RPM으로 설정하여 발효 플랫폼을 준비합니다. 각 발효에 대한 온라인 모니터링을 시작하려면 로봇 제어 응용 프로그램을 시작하고 분석 시작 버튼을 클릭 한 다음 수행 할 발효량을 선택하십시오. 표시된 인터페이스에서 플랫폼에서 발효기의 수와 위치를 표시할 수 있도록 하려면 슬롯 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 비활성화를 선택하여 빈 위치의 모니터링을 비활성화합니다.

계산 소프트웨어를 초기화하려면 이니셜라이저 버튼을 클릭하고 확인을 눌러 검증합니다. 그런 다음 로봇 제어 애플리케이션의 시작 버튼을 클릭하여 중량 수집을 시작합니다. 다음으로, 발효조에서 채취한 6밀리리터 샘플 2개를 섭씨 4도에서 5분 동안 2, 000배 G로 원심분리한다. 완료되면 각 동결 상층액을 두 개의 튜브로 옮기고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

각 펠릿을 5ml의 증류수로 두 번 세척하고 동위원소 농축 측정을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 2.5 밀리몰의 노르루신을 내부 표준물질로 함유한 25% 설포살리실산 용액 200 마이크로리터를 800 마이크로리터의 샘플에 첨가하여 고분자량 분자를 제거합니다. 배양 및 원심분리 후 0.22마이크로미터 공극 크기의 니트로셀룰로오스 멤브레인을 통해 혼합물을 여과하고 샘플을 아미노산 분석 시스템에 넣습니다.

분석 시스템의 프로그램 또는 소프트웨어에서 실행 버튼을 클릭하여 양이온 교환 컬럼이 장착된 분석기로 액체 크로마토그래피 분석을 시작합니다. 다음으로, 이전에 준비된 라벨링된 세포 펠릿을 200마이크로리터의 퍼포믹산에 현탁하여 산화 추출물을 준비합니다. 섭씨 4도에서 4시간 동안 배양한 후 황산나트륨 33.6mg을 첨가하여 반응을 멈춥니다.

산화된 추출물에 6가지 일반 염산 800마이크로리터를 첨가하고 건열 오븐에서 섭씨 110도에서 16시간 동안 밀폐된 유리관에 시료를 배양합니다. 샘플을 실온으로 식힌 후 2.5 밀리몰 뉴로류신 200 마이크로 리터를 첨가하고 질소 흐름으로 염화수소 가스를 제거합니다. 건조된 추출물을 증류수 800마이크로리터로 두 번 세척한 다음 에탄올 800마이크로리터로 세척합니다.

그런 다음 800마이크로리터의 200밀리몰 리튬 아세테이트 완충액을 추출물에 추가합니다. 앞서 설명한 크로마토그래피 방법을 사용하여 샘플의 단백질 내 아미노산의 상대적 농도를 측정합니다. 1.2ml의 6몰 염산을 첨가하고 건열 오븐에서 단단히 닫힌 유리관에서 섭씨 105도에서 16시간 동안 샘플을 배양하여 라벨링된 세포 펠릿을 가수분해합니다.

샘플을 실온으로 식힌 후 증류수 1.2ml를 추가합니다. 세포 파편을 제거하기 위한 원심분리 후, 열린 유리관에 상등액을 6개의 400마이크로리터 분획으로 분배합니다. 섭씨 105도의 건불 오븐에서 시럽의 농도에 도달할 때까지 4-5시간 동안 분획을 건조시킵니다.

바이오매스 가수분해 동안, 작용의 산을 자주 조절하여 시럽의 농도가 될 때까지 분획을 건조시킵니다. ECF 유도체화를 위해 냉각된 건조 가수분해물을 200마이크로리터의 20밀리몰 염산과 133마이크로리터의 피리딘과 에탄올의 1-4 혼합물에 용해시킵니다. 50마이크로리터의 에틸 클로로포르메이트를 첨가하여 아미노산을 유도체화합니다.

이산화탄소가 방출된 후 혼합물을 500마이크로리터의 디클로로메탄이 포함된 원심분리기 튜브로 옮겨 유도체화된 화합물을 추출합니다. 10초 동안 샘플을 소용돌이칩니다. 10, 000 시간 G에서 4 분 동안 원심 분리 한 후 파스퇴르 피펫으로 각 샘플의 하부 유기상을 수집하고 원추형 유리 인서트가 포함 된 GC 자동 샘플러 바이알로 이동하여 각 샘플을 GCMS 기기에 직접 주입 할 수 있습니다.

HPLC 유도체화 시약은 ECF 절차에 사용됩니다. ECF 시약을 자주 교체하십시오. DMF-DMA 유도체화의 경우 건조된 가수분해물을 50마이크로리터의 메탄올과 200마이크로리터의 아세토니트릴에 용해시킵니다.

300마이크로리터의 DMF-DMA를 넣고 샘플을 와류로 가열합니다. 그런 다음 샘플을 원뿔형 유리 인서트가 들어 있는 GC 자동시료주입기 바이알로 옮깁니다. BSTFA 유도체화를 위해 200마이크로리터의 아세토니트릴에 가수분해물을 현탁시킵니다.

샘플에 200마이크로리터의 BSTFA를 추가하고 유리관을 밀폐합니다. 섭씨 135도에서 4시간 동안 배양한 후, 냉각된 추출물을 원뿔형 유리 인서트가 들어 있는 GC 자동시료주입기 바이알로 직접 옮깁니다. 이제 자동 시료 주입기가 장착되고 질량 분석기에 연결된 기체 크로마토그래프로 시료를 분석합니다.

컴퓨터 소프트웨어의 메뉴에서 Instrument를 클릭합니다. Sequence 탭에서 Edit Sample Log Table을 클릭하여 샘플 목록을 만들고 Run and Run Sequence를 클릭하여 주입을 시작합니다. 분석이 완료된 후, 서로 다른 질량 동위원소체에 해당하는 각 아미노산에 대한 강도 클러스터를 기록합니다.

15ml 유리관에 5ml의 상등액에 10마이크로리터의 적절한 중수소화 내부 표준물질을 추가합니다. 디클로로메탄 1ml를 넣고 튜브를 단단히 닫은 다음 흔들 플랫폼에서 샘플을 20분 동안 흔듭니다. 원심분리 후 15ml 유리관에 하부 유기상을 수집합니다.

디클로로 메탄 추출을 반복 한 후 유기 추출물을 무수 황산나트륨 500mg 이상으로 건조시키고 파스퇴르 피펫으로 액상을 수집합니다. 질소 플럭스 하에서 추출물을 4배로 농축하십시오. 그런 다음 농축된 샘플을 GC 자동시료주입기 바이알로 옮깁니다.

GCMS 정량화를 위해 10:1의 분할 비율로 2마이크로리터의 시료를 주입하고 적절한 오븐 온도 프로파일을 사용하여 추출된 휘발성 분자를 분리합니다. 텍스트 프로토콜의 스프레드시트를 사용하여 세포외 아미노산의 농도, 세포 건조 중량, 세포의 단백질 함량, 휘발성 분자의 농도 및 단백질 생성 아미노산 및 휘발성 분자의 동위원소 농축에 해당하는 원시 데이터 값을 입력합니다. 와인 발효 중에 발견되는 여러 질소 공급원의 효모에 의한 관리를 조사하기 위한 워크플로우의 개략도가 여기에 나와 있습니다.

다양한 샘플링 지점의 경우, 생물학적 매개변수는 fermenations 사이에서 높은 재현성을 보여줍니다. 포도 주스의 공급원에서 모든 단백질 생성 아미노산으로의 질소 재분포에 대한 개요가 여기에 나와 있습니다. 질량 균형의 측정과 함께, 단백질 생성 아미노산의 동위원소 농축 측정은 질소 유래 아르기닌, 글루타민, 암모늄 및 기타 공급원이 이러한 각 화합물의 아민기에 기여하는 정도를 처음으로 정량화할 수 있게 했습니다.

바이오매스로 직접 회수되는 소비된 아미노산의 양을 비교한 내용이 여기에 나와 있습니다. 효모의 대사 네트워크에서 소비된 지방족 아미노산, 류신 및 발린의 분할이 여기에 나와 있습니다. 소비된 발린과 류신의 96% 이상이 전환 제품에서 회수됩니다.

놀랍게도, 발린(valine)과 류신(leucine)의 상당 부분은 배지 내 이러한 화합물의 가용성과 바이오매스(biomass)에서의 함량 사이에 상당한 불균형에도 불구하고 이화됩니다. 이 기술을 숙달하면 5일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 과학적 문제에 따라 기판의 라벨링 부분을 신중하게 선택해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

우수한 생물학적 재현성을 보장하려면 발효 및 크로마토그래피 분석을 중복하여 수행하십시오. 개발 후 이 기술은 미생물학 분야의 연구자들이 환경 조건에 따라 미생물의 신진대사와 생리학이 어떻게 변화하는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 유도체화 시약 및 아르기닌 용매로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑을 착용하고 배기 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.