Name: 단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 희귀 표적 세포를 항체 기반 와이어 분리법으로 단일 세포 수준에서 분리하여 전체 게놈 증폭 및 분자 유전학적 특성화를 수행하는 방법을. 이 기술은 순환 종양 세포 분석과 암 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF), 프로젝트 아니오 투자 되었다. 난 ERANET 프로젝트에서 변환 암 연구 (TRANSCAN) "으로 전립선 암 (CTC-스캔)에 있는 최소 잔여 질병 바이오 마커 순환 종양 세포"의 일환으로 (추 신)을 1220 B19. 박사 학위 후보자 사우스 캐롤라이나 의료 그라츠 대학교의 박사 학위 프로그램 분자 의학의 프레임 내에서 훈련 되었다. 저자는 기꺼이 그들의 전문 기술 지원에 대 한 니 나 Schlögl, 다니엘 Kummer, Gabi Wendt, 클 라우 디 아 Chudak, 줄리아 슐츠, 그리고 요한 나 쉴러 인정합니다. 저자는 게오르그 Peinhaupt 그래픽 디자인 지원 감사.

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저자는 공개 없다.

설명된 프로토콜은 단일 셀 비보 전 게놈 분석을 위한 기능성된 와이어 (장치 라고도 함)에서 셀을 검색 목표로 합니다. 우리 테스트 3 EpCAM 양성 세포 선 (HT-29, LNCaP, 및 VCaP), 하지만 원칙적으로이 방법은 EpCAM 표현 모든 셀 라인에 적용할 수 있습니다. EpCAM 긍정적인 대상 셀 순수 셀 서 스 펜 션 장치를 발표 될 수 있다 (2.1 참조) 또는 배경 셀의 흑자에 혼합 (예. 주변 혈액, 2.2 참조.). 특히 후자의 격리 용량 드문 셀 조건에서 테스트를 사용할 수 있습니다, 반면 와이어에 연결 된 셀의 수의 미세 조정 할 수 있습니다 설명된 낮은 볼륨을 사용 하 여 접근 (2.3 참조.). 로 셀 라인 간의 차이 예상 될 것 이다, 와이어, 회전을 충전을 위한 적당 한 셀 밀도 속도 뿐만 아니라 보육 시간 면역 형광 현미경을 사용 하 여 연결 된 셀의 수를 계산 하 여 경험을 테스트 될 필요가.
단일 셀 수준 WGA에서 게놈 다운스트림 응용 프로그램에 대 한이 필요 합니다. WGA 방법의 선택 실험실 사이 다를 수 있습니다 그리고, 원칙적으로, 우리의 메서드는 micromanipulation 또는 레이저 기정에서 얻은 샘플을 처리할 수 있는 보다 모든 방법에 열려. 이 프로토콜 열-조각화 기반 WGA7에 비해 더 나은 성능으로 인해 효소 조각난된 DNA 기반 방법을 사용 하 여. 옵션, 단일 셀 수 있도록 후속 DNA 프로 파일링20,21등온선 WGA에 전달할 수 있습니다.
설명된 프로토콜 게놈 단일 세포 분석을 위한 기능성된 와이어의 새로운 세대에 연결 되 고 후 그대로 세포 회복을 목표로 합니다. 또한 지금까지 시장에서 vivo에서 만 CE 승인 농축 장치, 대표 기능성된 와이어의 첫 번째 세대 열거 하는 CTCs 전이 암 환자에서 사용 되었다. 이전 게시 하 고 우리 자신의 데이터 현재 골드 표준 기술2에 비해 더 민감한 vivo에서 의 절연 기술을 제안 합니다. 따라서, 장치에서 실현이 비보에 격리 기술을 복구 기능을 갖춘 단일 세포 수준에서 묘사와 높은 CTC 복구를 결합 수 있습니다.
그러나, 장치에 환자에 사용에 대 한 지워지지 않습니다, 그리고 따라서, 임상 데이터는 사용할 수 없습니다. Ex vivo 응용 프로그램 (즉, 샘플링 후 CTCs 주변 혈액에서 분리) 기술은 이다 cubital 헛된, 예를 들어 낮은 직경 헛된 (증가의 확률의 현재 설정에 적응에 권장 하지 않습니다 CTCs과 잡기 항 체 사이 접촉을 직접) 및 긴 보유 시간 (30 분, 와이어를 통과 하는 혈액의 2-3 L을 허용). 그러나,에 개요 섹션 2.2로. 대상 셀 혼합된 샘플7으로부터 격리 될 수 있습니다.
방법의 현재 한계는 전선에서 분리 후 고정 되지 않은 셀의 비효율적인 회복 이다. 그러나 이것,, 분리 처리 이전 셀 고정 단계에 의해 향상 될 수 있습니다.
요약 하자면,이 프로토콜은 유전자 단일 셀을 특성화에 대 한 사용은 vivo에서 격리 기법 셀 복구를 향한 첫 번째 단계입니다. 셀 복구 및 환자1,2에서 응용 프로그램에 대 한 허가의 최적화를 해결 하기 위해 더욱 노력 해야 합니다. 그러나, 치료 모니터링 및 치료 결정에 대 한 맞춤된 의학 CTCs 열거 벗어납니다. 따라서,이 메서드는 단일 세포 수준에서 게놈 CTC 특성화 향한 첫 번째 단계.
단일 셀 transcriptome 분석으로 응용 프로그램 것으로 그대로 세포 수확 가능. 그러나, 그것은 회복 절차 (예: 실시간 정량22뒤 직접 세포에 복구 된 단일 셀을 전달) RNA 무결성에 영향을가지고 있는지 평가 하 남아 있다. 성공 하면, 단일 셀 (예: CTCs)의 특성화 transcriptome 수준, 더 자세한 분석을 허용 하 이동 수 있습니다. 이 점에서 RNA-seq로 양이 많은 PCR에 (RNA-seq 라이브러리 준비 하는 동안 얻은) preamplified cDNA를 대상이 될 수 있는 단일 세포의 RNA 다운스트림 분석을 위한 유용한 도구를 제공 스마트 seq2를 사용 하 여. 이 결합된 대상 및 단일 복구 된 셀22,23의 심사 기반 분석을 허용할 것 이다.
현재 기능성된 와이어 CTCs24의 긍정적인 선택에 대 한 널리 상피 마커는 안티 EpCAM 항 체를 기반으로 합니다. 여러 CTCs 수도 cytokeratins 등 EpCAM25downregulate 상피 마커, HER2/새 등 항 체를 추가 CTC 절연의 기회를 증가할 것입니다. 여러 가지 항 체 농축 전략 개발 되었고 페 레이 외의 검토를 기반으로 합니다. 201626에. 와이어에 움직일 항 체의 혼합물 더 높은 숫자의 격리 및 추가 하위 CTCs의 기술의 미래 향상 될 수 있습니다.
그것은 그것의 기능을 유지 하기 위해 솔루션에 빠져들 와이어의 기능적인 부분을 계속 처리 하는 와이어를 포함 하는 모든 단계에 대 한 필수입니다. 평가 (현미경; 중 1 x PBS에 와이어를 배치 하는 것이 좋습니다. 예. 3.1 단계. -3.3.) 그리고 저장입니다. 부적절 한 얼룩을 피하기 위해 갓을 사용 하 여 단계 1.2.1 얼룩 솔루션을 준비 하는 것이 좋습니다. 1.2.2 하 고입니다. 약하게 스테인드 셀 셀에 계산을 방해 하 고 연결 된 셀의 과소를 이어질 수 있습니다.
그것은 고무 캡으로 파스퇴르 피 펫 파스퇴르 피펫으로 세포 현 탁 액 (단계 2.3.4.)의 후속 로드에 와이어를 삽입할 때 연결 하지 않도록 해야 합니다. 고무 캡 기능 부분 파스퇴르 피 펫의 끝 안에 위치 하 고 자리에는 와이어를 잡고 하는 데 사용 됩니다. 뚜껑 파스퇴르 피 펫의 후면에 너무 단단히 연결, 세포 현 탁 액의 로드 불가능 합니다. 이 경우에 로드 셀 서 스 펜 션에 의해 전치 되는 공기는 피 펫을 남길 수 있습니다 뚜껑을 쉽게.
와이어 벤딩 하는 것은 단계 3.2에서 셀 동안 그것의 방향에 대 한 중요 합니다. 그리고 3.3입니다. 와이어 철사의 비 기능 끝 한쪽에 거짓말을 제공 되도록 접착 테이프를 사용 하 여 탑재 합니다. 스캔 후 기능 부품의 전체 길이, 와이어는 압 연 180 ° 그래서 기능 와이어의 나머지 절반을 검색할 수 있습니다. 이 단계는 초기 실험에는 셀의 수를 평가 하는 것이 중요. 일단 특정 셀 라인 및 절차에 대 한 셀의 수 계산 절차 셀 계산 없이 반복 될 수 있다 (예.만 셀의 존재에 대 한 검사 또는이 단계 생략). 주의 pipetting 손실을 방지 하기 위해 셀 단계 4.8에서에서 상쾌한의 볼륨을 감소 때 결정적 이다. 펠 릿에 소란 없이 원활 하 게 이루어집니다 pipetting 다는 것을 확인 하십시오.

최근, CellCollector DC01, 의료 와이어 기능성된 암 환자의 말 초 혈액에서 CTCs를 격리 하기 위한 안티 EpCAM 항 체와 CTC 열거형1,2,3의 조직적 스펙트럼에 추가 되었습니다. . 비 전이성 전립선 암에는 현재 진행 중인 연구,이 기능성된 와이어 CTC 양성 되도록 거의 두 배나 많은 환자를 보고 하 고 CellSearch, CTC 열거형3 황금 표준에 비해 CTC 양성 환자에서 높은 CTC 계산 . 이 격려 성능으로 인해 단일 세포 분석을 위한 기능성된 의료 와이어에서 셀의 격리, 바람직한 것 하지만 셀 분리 솔루션 (예: trypsin) 효소 치료도 아니다 아니 레이저 기정 그대로 셀 (데이터 표시 되지 않음)의 복구.
허용 하려면 캡처된 세포의 분리, 기능성된 와이어의 새로운 세대는 특정 폴리머로 갖춰 졌다. 이 폴리머는 와이어를 캡처 항 체를 연결 하는 그대로 셀 (CellCollector DC03 라고도 장치)의 분리를 허용 릴리스 버퍼 치료를 받기 쉽습니다. 암 셀 라인 셀 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 아군의 다양 한 농도에서 대상 셀의 격리를 허용 하는 새로운 기능성된 장치 / 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 말 초 혈액, 각각.
편하게 하기 위해 셀의 시각적 탐지 장치 및 복구 후, 대상 암 세포는 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)와 회복 치료 전에 DNA 얼룩 셔 서 (즉. 충전 및 분리). 단일 세포의 DNA 품질에 대 한 치료의 효과는 품질 관리 PCR4,5, 배열 CGH6,7 에 의하여 WGA 후 이전 평가 했다 및 타겟 시퀀싱7 아무 차이 보여주는 셀 정지7에서 치료 비 셀 micromanipulated에 비해. 이 방법의 장점은 단일 셀 다운스트림 분석 (그림 1)에 대 한 세포의 복구와 희귀 대상 셀 사전 농축의 조합에 있다. 수집 장치 vivo에서 CE 표시 현재는 단일 셀 분자 특성2,8보다 CTCs의 열거에 대 한 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, CTCs 가운데이 조사 하기 위해 보다 포괄적인 분석 개별 셀 수준 (즉, 타겟 시퀀싱 단일 셀 수준)에서 분석에 대 한 긴. 다른 셀 기반 방법 EpCAM 긍정적인 CTCs 및 후속 분자 유전 분석9,10dielectrophoresis에 따라 단일 셀 처리의 immunomagnetic 격리를 기반으로 합니다. CTCs의 분자 특성 임상 설정에서 그들의 유용한 구현 위한 중요 한 요구 이며 전이성 캐스케이드의 기초 연구에서 똑같이 중요 하다. 최소한의 기술 격리 절차11,12종양의 DNA 분석 수 CTCs에 평행선, 순환 종양 DNA (ctDNA) 매우 중요 되고있다. 셀 기반 접근 RNA13,14 및 단백질15 식 분석에 대 한 수는 상호 보완적인 기여 역할을 수 있습니다 및 또한 CTC 파생 셀 문화 또는 xenografts16, 17. 비록 낮은 셀 복구 및 환자에 사용에 대 한 허가 등 장애물을 해야, 캐치 및 릴리스 메서드 희귀 대상 셀의 특성으로 중요 한 다음 단계 걸립니다.

<table><tbody><tr><td>Gilupi 방출 완충액</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td> 와이어<td>에서 세포를 분리하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>McCoy의 5A 배지 (1x) 보충 L-글루타민</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>HT-29 세포에 사용되는 배양 배지는 실험에 사용되는 세포주에 배양 배지를 적응</td></tr>시킵니다 <tr><td>HEPES 버퍼 용액 (1M)</td> <td>McCoy의 5A 배지</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>용 PAA S11-001 보충제</td><td>McCoy's 5a 변형 배지</td>페니실린-스트렙토마이신(100x)용 Foetal Bovine Serum Gold <td>PAA</td><td>A15-151</td></tr><tr><td>보충제McCoy's 5a 변형 배지</td><td></td> 인산염 완충 식염수(1x PBS)용 <td>Biowest</td><td>L0018-100</td> 보충제</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>세포 분리 용액(세포 배양)</td></tr><tr><td>수조</td><td>GFL</td><td>Type 1003</td><td>예열 용액에 사용</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>세포 배양에 사용(세포 배양)50</td></tr> <tr><td>mL 반응 튜브</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>롤러 믹서</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>세포가 침전되는 것을 방지하면서 세포를 와이어에 부착하는 데 사용</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 세포 증식 Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>살아있는 세포(세포질 라벨)를 라벨링하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>DNA(핵 카운터스테인) 염색에 사용됨</td></tr><tr><td>원심분리기(15 mL 및 50 mL 반응 튜브 고정용 장착)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>세포 펠릿화에 사용됨</td></tr><tr><td>Observer Z1 (형광/레이저 현미해부 현미경)</td> 레이저 현미해부가 가능한 <td>Carl Zeiss Microimaging</td><td></td><td>Inverted(면역형광) 현미경; 형광 현미경은 Hoechst 33342(DAPI 필터) 및 CFSE(FITC 필터)를 감지할 수 있어야 합니다.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>유리/플라스틱 표면 코팅에 사용</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer EDTA(또는 Na-heparin) 튜브</td> 소용돌이에 사용 <td>BD</td><td>366450(또는 366480)</td><td>표적 세포의 생체 외 캡처를 위한 반응 튜브로 사용</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>EpCAM 양성 세포를 분리 및 분리할 수 있는 기능화된 와이어(catch& 릴리스, C& R)</td></tr> <tr><td>주사기 바늘 (G20)</td> <td>VWR</td><td>613-0554</td><td>C & 의 작동하지 않는 부분을 허용하기 위해 고무 캡에 구멍을 뚫는 데 사용됩니다. 그것을 통해 리드하는 R</td></tr><tr><td>Neubauer 챔버</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>세포를 계수하는 데 사용</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>C&에 세포의 저용량 적용에 사용됩니다. R</td></tr><tr><td>그리스 펜</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>세포 현탁액을 제자리에 고정하기 위해 유리 슬라이드에 사용</td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터 (0.2 &micro; m)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>갓 준비된 Gilupi Release Buffer</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>세포 분리 중 교반에 사용</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA Kit</td><td>Silicon Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator MMJ가 장착된 Silicon Biosystems Axiovert M200을 통해 주문 CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>micromanipulation 사용</td></tr><tr><td>Microcapillaries(25 &micro; m 직경), CustomTip Type I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>세포 미세 조작에 사용</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 튜브</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>세포 원심분리기 및 장비</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>세포 원심분리기 사용</td></tr><tr><td>Thermo cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>가열식 뚜껑이 있는 모든 열 순환기는</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Roth를 사용할 수 있습니다.</td><td>CX73.1</td><td>탁상용 원심분리기를 즉시 사용</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>레이저 미세 해부에 사용되는 멤브레인 코팅 유리 슬라이드</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800 Stratagene</td><td></td><td>400072</td><td>DNA 크로스 링커를 즉시 사용</td></tr><tr><td>표준 PCR 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6x DNA 로딩</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>젤 사용 손에 염료 로딩</td></tr><tr><td>DNA 사다리</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>100bp 사다리를 사용</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>젤 일렉터포레시스 스테이션</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>전기영동 시스템을 사용</td></tr> 젤 <tr><td>레드 핵산 염색</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA 시각화를 위한 삽입 염료 아가로스 겔</td></tr></tbody></table>

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

드문 대상 셀 대상 세포의 표면 단백질에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 비 대상 셀의 높은 배경 으로부터 격리 될 수 있습니다. 최근에 개발 된 방법 안티 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 순환 종양 세포 (CTCs)1의 비보에 격리에 대 한 항 체와 기능성된 의료 와이어를 사용 합니다. 비 전이성 전립선 암에 일치 하는 환자 코 호트 vivo에서 절연 기술 CTCs CTC 열거형의 현재 황금 표준에 비해 높은 CTC 카운트에 대 긍정적인 환자의 높은 백분율에서 결과 나타났다. 으로 셀은 현재 의료 기기에서 복구할 수 없습니다, (장치 라고도 함)는 새로운 기능성된 와이어 제조 되었다 캡처 및 셀의 후속 분리 효소 처리에 의해. 셀 장치, 현미경에 시각 및 효소 처리를 사용 하 여 분리를 첨부할 수 있습니다. 복구 된 세포 막 코팅 슬라이드에 cytocentrifuged 이며 레이저 서 또는 micromanipulation 개별적으로 수확. 단일 셀 샘플 검사 및 대상별 접근을 포함 하 여 여러 다운스트림 분석을 허용 하는 단일 셀 전체 게놈 증폭 다음 대상이 됩니다. 격리 및 복구의 절차 고품질 DNA 단일 세포에서 생성 하 고 후속 전체 게놈 증폭 (WGA)을 손상 하지 않습니다. 단일 셀의 증폭 된 DNA 검사에 전달 될 수 있습니다 또는 배열 비교 게놈 교 잡 (배열 CGH) 또는 시퀀싱 등 분석 대상. 장치 인공 드문 셀 샘플 (즉 500 아군 주변 혈액 5 mL에는 대상 셀)에서 ex vivo 격리를 수 있습니다. 슬라이드에 분리 된 세포의 복구 속도 광범위 사용 셀 라인에 걸쳐 세포의 분리 요금은 허용 (50-90%), 반면 (< 10-> 50%)와 몇 가지 더 주의가 필요 하다. 이 장치는 환자에 사용에 대 한 지워지지 않습니다.

CFSE와 핵 얼룩 후 셀 DAPI FITC에 대 한 필터를 장착 하는 면역 형광 현미경을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 반면 셀의 세포질 이기종 간 세포 농도 (그림 2A 및 2E) CFSE와 균일 한 라벨 핵 DAPI 채널에 밝은 counterstain 제시. 비슷한 모양 및 강렬을 얼룩이 지 와이어 (그림 2B 와 2 층)에 연결 된 셀에서 예상으로 전선에서 분리 있으며 슬라이드 (그림 2D 및 2 H)에 복구.
높은 세포 밀도 (예 &gt; 1000000 셀/mL) 전선을 충전 셀 와이어의 전체 범위에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 낮은 세포 밀도, 인큐베이션, 동안 회전 속도 변화 및 다른 세포를 사용 하 여 분리 효율에 영향을 별도로 테스트 하는 데 필요한. 때 전선을 했다 인 큐베이 팅 100 000에 HT-29 셀의 5 mL와 셀 / mL으로 섹션 2.1에서에서 설명., 254 ± 103 셀의 평균 (n = 5) 철사에 체포 되었다. 같은 실험 LNCaP 셀, 440 ± 319 셀의 평균을 사용 하 여 (n = 5) 와이어 당 획득 했다.
75 ± 18, 25 ± 9 셀 전지와 47 ± 57 셀의 캡처 귀착되 었 다 (에 따르면 프로토콜 섹션 2.2.) 전선 주변 혈액 5 mL의 배경에서 500, 5 000, 50 000 HT-29 세포 (n = 3, 각각), 각각. 와이어 15 µ L 섹션 2.3에서에서 프로토콜에 따라 세포 현 탁 액 (1000000 셀/mL)의 비용이 청구 됩니다 경우., 1 000 (HT-29)까지 셀 철사에 첨부할 수 있습니다.
HT-29 셀에 81%에서 배열 했다 분리 효율성 셀 (범위 54.9%-93.2%, 및 n = 5) 81% (범위 63.51-92.87%, n = 6) 91% (범위 84.7%-95.3%, n = 6) LNCaP 시내 VCaP 세포, 각각. 마찬가지로, 분리 된 세포의 복구 셀 라인 다릅니다: 분리 된 HT-29 셀의 28%의 평균 cytocentrifugation에 의해 재기 되었다. LNCaP에 대 한 회복 율 10% 미만인 반면, VCaP 셀에 대 한 평균 복구 율은 55%.
단일 셀의 약 75%에 WGA 수확량 고품질 WGA 제품 복종: 이것이 1) &gt; 1 kb (그림 4, 맨 위 패널)와 2) 3 0.1에서 배열 하는 WGA 제품의 얼룩 또는 4 밴드 4plex 품질에서 제어 PCR (그림 4, 하단 패널) . WGA 제품에 대 한 1) 배열-CGH 다시 증폭 WGA 7후 단일 셀 배열 CGH 프로필 6,7 과 2) 타겟된 NGS에 대 한 품질 기준에 부합 하는 프로 파일링을 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> 그림 1: 분리 하 고 복구 하는 단일 세포 분석에 대 한 대상 셀에 대 한 워크플로. (A) 세포 90 %confluency 교양 하 고 (B) 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 수확. 기능성된 와이어 CFSE와 핵 얼룩, (C) 얼룩 후를 incubated 5 mL 반응 관을 사용 하 여 볼륨 또는 낮은 볼륨 파스퇴르 피 펫 팁을 사용 하 여 셀의 존재. 후자의 수 있습니다 셀 서 스 펜 션의 응용 프로그램에 대 한 낮은로 15 µ L. (D) 셀 충전 후 4 시간 이내 분리할 필요가. 따라서, 와이어 릴리스 버퍼 가득 1.5 mL 반응 관에 배치 됩니다. 15 분 보육 로커에 10 분 원심, 후 철사를 제거 하 고 세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 centrifuged. (E) 복구 세포는 중 단일 셀 micromanipulation (맨 위) 또는 막 코팅 슬라이드에 cytocentrifuged 유리 슬라이드에 전송 하 고 서 (아래)를 레이저로 전달. (F) 마지막으로, 수확된 단일 셀은 전체 게놈 증폭 (WGA)에 의해 증폭 됩니다. WGA 제품 배열 CGH 및 타겟된 NGS 다운스트림 분석과 호환 됩니다. EpCAM epitope: 세포 표면에 녹색 원. 와이어 기능성: 장치, 회색 트리플-나선형 와이어. 폴리머: 보라색 라인입니다. 안티-EpCAM 항 체: 오렌지. 버퍼 활동 발표: 빨간 화살표. 장소에 세포 현 탁 액을 그리스 마커: 다크 블루 타원. 세포 현 탁 액을 복구: 밝은 파란색. Micromanipulation에 대 한 모 세관: 블랙 라인. 확대: 복구 된 셀 micromanipulation에 의해 수확에 막 덮여 cytospin 슬라이드 포함 복구 세포 (회색 채워진된 타원). 확대: microdissected 레이저 복구 된 셀 되 (원형 선 회색: 막 슬라이드 레이저 서 위한 등뼈로 봉사에서 막), 레이저 빔 (파란색 선 막 슬라이드를 아래에서 접근)으로. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> 그림 2: 시각화 이라는 셀. (A, E) 충전 하기 전에 셀: 셀 CFSE와 표시 및 dna 염료 CFSE의 범위 (녹색) 신호 강도 보여주는 intercalating counterstained. (B,F) 통신 중에 캡처한 이라는 셀. (C,G) 휴대-분리 절차 후 와이어. (D,H) 셀은 와이어에서 분리 하 고 슬라이드에 cytocentrifugation에 의해 발견. CFSE: FITC 채널 (녹색)입니다. DNA 얼룩: DAPI 채널 (파란색). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> 그림 3: 와이어 및 스토리지 구획. 와이어의 (A) 구획. (B) 기능성된 부품의 세부 사항. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> 그림 4: 단일 micromanipulated 세포에서 얻은 WGA 제품의 품질 관리. 상단 패널: 단일 세포에서 얻은 WGA 제품 일반적으로 DNA에 결과 얼룩 피크 강도 약 0.5 k b에 0.2 kb에서 &gt; 1.0 kb에 이르기까지. 샘플 번호 1, 7, 13 차선 표시 (별표 표시) 또는 아무 DNA 얼룩. 하단 패널: WGA 제품은 충분 한 품질의 4plex PCR 수익률 3 또는 4 4 PCR 제품의 경우 (100, 200, 300, 그리고 400에 bp). 예제 1, 7, 10, 및 13 3 밴드를 표시 하 고 추가 분석에서 제외 될 것 이다. 레인 M 100 bp 사다리를 포함 하 고 별표 부족 WGA 제품 품질의 샘플을 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>뇌관 순서</td>
			<td>참고</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gtt cca ata tga ttc cac cc-3</td>
			<td>100 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3</td>
			<td>100 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tgg agc gct agc-3 ' 개 그</td>
			<td>200 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3</td>
			<td>200 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tga gac att ctt gct gg-3</td>
			<td>300 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' tcc 법 aac cag tca gcg tc-3</td>
			<td>300 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc 고양이 gcc atc 법 gc-3</td>
			<td>400 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gct tga caa agt ggt cgt 안내-3</td>
			<td>400 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 4plex 품질 관리 PCR 뇌관 순서

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포 현탁액에서 세포를 분리하여 단일 세포 다운스트림 분석에 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 액체 생검 및 세포 이질성의 맥락에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포의 항체 기반 분리와 단일 세포 수준에서 후속 분자 유전 분석을 위한 복구가 가능하다는 것입니다.환자에게 사용할 수 있도록 허가되면 이 기술은 암 환자의 순환 종양 세포의 특성을 분석할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세포 간의 이질성에 대한 통찰력을 제공할 수 있으므로 혈액 샘플, 세포 배양 샘플 또는 분리된 조직 및 장기와 같은 하위 집단을 포함하는 모든 종류의 세포 현탁액에 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 다운스트림 분석을 위해 세포를 방출할 수 없는 생체 내 농축 장치를 사용했을 때 처음 떠올랐습니다.레이저 현미해부 또는 미세 조작을 사용하여 단일 세포를 채취하는 단계는 세포 손실이 발생하기 쉽고 높은 수준의 전문 지식이 필요하기 때문에 성공적으로 수행하기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 예열된 세포 배양 배지 1ml에서 HT-29 CFSE 표지 세포를 재현탁하고 섭씨 37도에서 30분 동안 재생시킵니다. 세포를 채취하려면 300g에서 3분 동안 원심분리합니다.그런 다음 바로 사용할 수 있는 Hoechst 33342 DNA 염색 용액 1ml에 세포 펠릿을 섭씨 37도에서 10분 동안 재현탁합니다. 다음으로, 300g에서 3분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버리고 세포 펠릿을 1X 인산염 완충 식염수 4ml에 재현탁합니다.그런 다음 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 형광 현미경으로 형광 표지를 확인합니다. 다음으로, 300g에서 3분 동안 세포를 원심분리하고, 상등액을 버리고, 펠릿을 밀리리터당 약 500, 000 세포로 재현탁하고 세포를 얼음에 놓습니다. 5ml의 말초 혈액에 약 500-500, 000 개의 세포를 첨가 한 다음 튜브를 거꾸로 혼합합니다.보관함에서 와이어를 제거한 후 와이어를 고정하는 고무 캡을 제거하고 와이어를 1X 인산염 완충 식염수로 세척하고 튜브 캡에 장착합니다. 그런 다음 기울어진 롤러 믹서에서 실온에서 30분 동안 분당 5회 회전하면서 튜브를 배양합니다. 배양 후, 1X 인산염 완충 식염수로 와이어를 세 번 헹굽니다.그런 다음 어둠 속에서 1X 인산염 완충 식염수가 들어 있는 15ml 튜브에 와이어를 보관하십시오. 그리스 펜을 사용하여 유리 슬라이드에 직사각형 영역을 그린 다음 500마이크로리터의 1X 인산염 완충 식염수를 추가합니다. 와이어의 기능적인 부분을 1X 인산염 완충 식염수에 담그려면 와이어의 작동하지 않는 부분을 구부려 유리 슬라이드에 놓습니다.캡처된 셀의 수를 계산하려면 와이어의 양쪽을 육안으로 검사합니다. 검사 후 1X 인산염 완충 식염수가 함유된 15ml 튜브에 와이어를 다시 옮기고 어두운 곳에 보관합니다. 1X 인산염 완충 식염수 1밀리리터에 방출 완충액 성분 4mg을 용해한 다음 0.2마이크로미터 멸균 필터를 통해 용액을 여과하여 즉시 사용할 수 있는 완충액을 얻습니다.그런 다음 릴리스 버퍼를 섭씨 37도에서 5분 동안 예열합니다. 예열되면 1.6ml의 방출 버퍼를 옮겨 1.5ml 반응 튜브를 완전히 채웁니다. 다음으로, 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 방출 버퍼에 있는 와이어의 기능 부분을 배양합니다.배양 후 15분 동안 분당 500회 회전하면서 셰이커에 와이어를 놓습니다. 그런 다음 300g에서 10분 동안 와이어를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브에서 와이어를 제거하고 캡을 닫은 다음 300g에서 10분 동안 튜브를 다시 원심분리합니다.세포 현탁액의 부피를 줄이려면 미세 조작을 위해 100마이크로리터의 상층액을 모두 버리거나 후속 세포 원심분리 및 레이저 현미해부를 위해 300마이크로리터를 제외한 모든 것을 폐기하십시오. 그런 다음 단일 세포 샘플링을 빠르게 진행합니다. 미세 조작의 경우 100마이크로리터의 세포 현탁액 전체를 유리 슬라이드로 옮깁니다.그런 다음 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 현미경에 유리 슬라이드를 놓고 세포가 5분 동안 안정되도록 합니다. 그런 다음 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 2 마이크로 리터의 세포 용해 마스터 믹스를 피펫팅하여 얼음 위에 옮깁니다. micromanipulator를 사용하여 1마이크로리터의 1X 인산염 완충 식염수에 있는 단일 세포를 수집합니다.그런 다음 세포를 2마이크로리터의 세포 용해 마스터 믹스로 직접 옮깁니다. 탁상용 microfuge를 사용하여 2, 000g에서 샘플을 3초 동안 빠르게 회전시켜 튜브 바닥에 액체를 수집합니다. 그런 다음 샘플을 얼음에 옮겨 넣고 어댑터-링커 기반 전체 게놈 증폭을 진행합니다.최대 1마이크로리터의 완충액을 사용하여 하나의 세포만 흡인합니다. 세포를 용해 용액으로 옮길 때 용액에서 거품이 발생하여 모든 흡입 부피가 전달되었음을 나타내는지 확인하십시오. 레이저 현미해부의 경우, 300마이크로리터의 세포 현탁액 전체를 300g의 멤브레인 코팅 슬라이드에 5분 동안 세포원심분리합니다.그런 다음 멤브레인 코팅된 슬라이드를 레이저 현미해부가 가능한 현미경에 놓습니다. 다음으로, 4.5마이크로리터의 세포 용해 마스터 믹스를 0.2ml PCR 튜브의 캡에 피펫으로 넣습니다. 캡을 샘플 위에 놓고 레이저 현미해부로 단일 세포를 채취합니다.그 직후, PCR 캡에 고립된 세포가 있는지 확인하고 레이저 현미해부 현미경에서 PCR 튜브를 제거하고 튜브를 닫습니다. 짧은 회전으로 튜브 바닥에 있는 모든 액체를 모으십시오. 검체를 얼음에 이식하고 어댑터-링커(adapter-linker) 기반 전체 게놈 증폭을 진행합니다.레이저 현미절부된 세포를 복구해야 합니다. 따라서 전체 튜브 캡을 용해 용액으로 덮는 것이 중요합니다. 현미해부 후 튜브 캡에 세포가 있는지 확인하십시오.CFSE 및 Hoechst 33342로 염색된 세포를 보여주기 위해 면역형광 이미징은 와이어를 충전하기 전, 세포가 와이어에 부착되는 동안, 와이어에서 분리되는 동안, 마지막으로 슬라이드에서 수행되었습니다. 충전 전 세포의 면역형광 이미지는 밝은 핵 염색을 파란색으로 보여주는 반면, 세포의 세포질은 이질적인 세포 간 강도를 가진 녹색 CFSE 염색을 보여줍니다. 와이어에 부착되었다가 나중에 분리된 세포에서도 유사한 염색 패턴이 관찰됩니다.전체 게놈 증폭 산물의 품질을 확인하기 위해 1% 아가로스 겔을 실행했습니다. 아가로스 겔은 전체 게놈 증폭의 PCR 산물에 대해 0.2에서 1킬로베이스 이상의 DNA 도말 범위를 보여줍니다. 단일 세포에서 얻은 4plex 품질 관리 PCR 산물은 100, 200, 300 및 400 염기쌍의 산물을 산출합니다.밴드가 3개 미만인 제품은 추가 분석에서 제외됩니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 4시간 내에 세포 현탁액에서 단일 세포를 분리할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 특히 세포가 와이어에 부착되어 있는 동안 세포에 해를 끼치지 않도록 세포를 버퍼에 담근 상태로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 복제 수 변이 및 돌연변이를 기반으로 단일 세포를 특성화하기 위해 영역 비교 게놈 혼성화, 차세대 염기서열분석 및 표적 특이적 PCR과 같은 분석 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 기능화된 와이어를 사용하여 세포 현탁액에서 세포를 분리 및 복구하는 방법과 다중 다운스트림 분자 유전자 분석을 위해 단일 세포를 샘플링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 사람의 혈액을 다루는 작업은 감염 가능성이 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 실험복을 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

target-cell-pre-enrichment-whole-genome-amplification-for-single-cell

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

이 동영상은 다운스트림 분석을 수행하기 위해 표적 세포 풀에서 단일 세포를 분리하는 기술을 설명합니다. 이 방법에서는 현미경에 장착된 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 단일 표적 세포를 고정밀 분리합니다.

Micromanipulation을 사용한 단일 세포 샘플링: 암세포 현탁액에서 단일 세포를 분리하는 기술

이 비디오는 레이저 캡처 현미해부를 사용하여 이질적인 세포 집단에서 단일 세포를 얻는 기술을 설명합니다. 단일 분리 세포는 추가 게놈 연구 또는 암 연구에 사용할 수 있습니다.

레이저 캡처 미세해부를 사용한 단일 세포 샘플링: 이질적인 세포 집단에서 표적 세포를 수확하는 기술

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미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

학습하세요 희귀 표적 세포를 항체 기반 와이어 분리법으로 단일 세포 수준에서 분리하여 전체 게놈 증폭 및 분자 유전학적 특성화를 수행하는 방법을. 이 기술은 순환 종양 세포 분석과 암 연구에 활용됩니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

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