Name: 풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 학습하세요 shRNA와 차세대 시퀀싱을 이용해 비활성 X 염색체의 조절 인자를 식별하는 방법을. 마우스 힘줄 섬유아세포를 사용하여 MeCP2 유전자 재활성화를 연구하는 이 프로토콜은 유전학 및 신경과학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리는 기꺼이 shRNA 라이브러리 화면에서 사용을 제공 하기 위한 멜버른의 대학 로스 Dickins 감사 합니다. 이 작품으로는 레트 증후군 연구 신뢰 (A.B.) 투자 되었다.

동물을 포함 하는 모든 단계는 프레드 허 친 슨 암 연구 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 실행 되었다. 여기 사용 아니 시 약 5-azacytidine (5-아 자)를 제외 하 고 중요 한 인간의 건강 위험 포즈를 알려져 있습니다.
1. 생성 하는 사이에 MeCP2뤽 HR transgene 기자 셀 라인
<ol><li>
MeCP2 뤽 시간 /X X 여성에서 마우스 힘 줄 섬유 아 세포를 준비MeCP2 마우스
	<ol>
<li>하루에 10-12를 안락사-MeCP2 뤽 시간/X X 오래 된 여성MeCP2 마우스.</li>
		<li>바로 해 부가 위를 사용 하 여 인접 꼬리 부분의 피부를 통해 완곡 한 절 개를 확인 합니다.</li>
		<li>꼬리의 기지 근처에 시체를 들고, 꼬리 fibrocartilaginous 부분을 노출 하는 마우스에서 피부를 당겨. 제거 하 고 잘라 터미널 노출 조직의 10 m m 1 m m 수술 메스를 사용 하 여 긴 조각.</li>
		<li>전송 조각난된 조직 15 ml 원뿔 튜브 포함 5 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 1 U/mL 페니실린, 1 µ g/mL 스, 그리고 콜라 1.5 mg/mL, 보충 사전 0.45 μ m 및 다음 0.2 µ m 메쉬 필터를 통해 필터링. 3-4 시간 연속 회전 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>원심 분리기 샘플 500 x g 에 실 온에서 10 분에 대 한 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 U/mL 페니실린, 1 µ g/mL 스 (DMEM-10)과 6 잘 조직 문화 접시에 접시와 보충 DMEM의 10 mL에 펠 릿을 Resuspend. 셀을 한 번 통과 하 고 단계로 진행 하기 전에 10 cm 접시에 확장.</li>
		<li>앞에서 설명한7HPV 16 바이러스 성 oncogenes (E6/E7)를 들고 식 벡터와는 변환을 수행 하 여 세포를 불멸.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단일 세포 클론 선택 및 MeCP2 기자 식
	<ol>
<li>10 cm 접시에서 세포를 수확. 첫째, 미디어 발음, 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM-10의 9 mL와 quench 고 15 mL 원뿔 튜브에 resuspended 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>셀을 희석 DMEM-1 셀/100의 최종 농도에 10 µ L. 전송 96 잘 접시를 정지 pipetting 100 µ L에 의해 각 우물에.</li>
		<li>우물은 최대 2-3 주를 걸릴 수 있습니다 합칠 때까지 37 ° C에서 품 어. 3-5 일 마다 신선한 DMEM-10 미디어를 교체 합니다. Confluent, 잘 당 0.05% 트립 신-EDTA의 20 µ L로 세포를 동원 하 고 96 잘 접시의 두 가지 중복 집합으로 그들을 분할.</li>
		<li>격판덮개의 1 세트를 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 분석 결과. 미디어 제거를 요구 하지 않는 균질 반딧불 luciferase 분석 결과 키트를 사용 합니다. 키트에 포함 된 프로토콜을 따릅니다.</li>
		<li>1.2.4 단계에서 결과 사용 하 여 격판덮개의 나머지 세트에서 감지 luciferase 활동 없이 클론을 선택. 이러한 24-잘, 다음 6-잘 접시를 확장 합니다.</li>
		<li>가장 높은 luciferase 활동; 클론 동일을 수행합니다 이 유효성 검사를 위해서 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
		<li>서쪽 오 점을 위해 6 잘 플레이트에 각의 약 수를 수확. 0.05% 트립 신-EDTA의 200 µ L로 세포를 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM-10, 2 mL와 quench 그리고 1.5 ml 원심 분리기 튜브에 세포의 절반을 전송. 서쪽 오 점을 위해 lysing 하기 전에 한 번 PBS와 셀을 세척. 또는, 다른 6 잘 플레이트 세포의 절반을 전송 합니다. 셀 접시의 바닥에 연결, PBS와 린스 그리고 서쪽 오 점을 위해 lyse.</li>
		<li>수행 하는 서쪽 오 점 안티 MeCP2 항 체는 luciferase 부정적인 세포 표현, luciferase 긍정적인 세포 활성 X 염색체;에서 야생-타입 MeCP2 표현 하지 않는 하는 동안 확인 된 앞에서 설명한 프로토콜8을 따릅니다. 뇌 조직에서 어떤 야생 타입 마우스 lysate를 사용 하 여 긍정적인 통제로.</li>
		<li>2 x 105 셀/잘 6 잘 플레이트에에서 여러 가지 부정적인 클론 접시 10 µ M 5-아 자 한 번 치료 하 고, 72 h에 대 한 미디어, 변경 하지 않고 품 어 1.2.3 단계에서 설명한 대로 luciferase 활동에 대 한 분석 결과.</li>
		<li>Luciferase 활동 5-아 자 고 여러 10 cm 접시에 그것을 확장을 시작 하는 클론 (사이 클론)이 부정적인 하나를 선택 합니다. 백업으로 액체 질소에 나머지 부정적인 클론을 고정 합니다. 긍정적인 복제품 (클론 Xa) 조직 문화에서 유지 하거나 추가 사용까지 냉동 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 심사 hygromycin B 선택을 사용 하 여 다시 활성화에 대 한 라이브러리
<ol><li>
테스트 복제 감염, 선택, 적용 및 시퀀싱에 대 한 DNA를 수확
	<ol>
<li>ShRNA 라이브러리에서 헤어핀을 표현 하는 retroviral 구문의 바이러스 집중 얻거나 집중된 바이러스 상쾌한 원하는 라이브러리에 포함 된 프로토콜을 사용 하 여 생산.</li>
		<li>화면을 계속 하기 전에 적정 라이브러리 (사용 하 여 GFP 마커 사용 가능한 경우). 0.3에서 0.5 사이 감염의 다양성에 대 한 목표. 참고: 거짓 긍정적인 요금을 최소화 하기 위해 적어도 4 개의 독립적인 화면 수행 합니다. 헤어핀의 적절 한 표시를 유지 하 고 임의의 중단9피하십시오 도서관의 100 범위를 화면 당 20 접시를 사용 합니다. 그러나, 그것은 가능성이 낮은 범위 겠지만 긍정적인 선택 화면과 큰 도서관 크기를 감안할 때.</li>
		<li>아침에, 1 x 106 사이 셀 10cm 조직 문화 접시에 접시.</li>
		<li>오후에 신선한 DMEM 10 바이러스 상쾌한과 polybrene의 5-10 µ g/mL를 포함 하는 미디어를 대체 하 여 번호판을 감염. 2.1.2 단계에서 확인 하는 바이러스 성 상쾌한의 금액을 사용 합니다.</li>
		<li>18-24 h 후 미디어 발음 하 고 각 플레이트에 신선한 DMEM-10의 10 mL를 추가 합니다. 또 다른 48 h에 대 한 문화입니다.</li>
		<li>아침에 접시 당 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL를 사용 하 여 셀을 동원 하 고 접시 당 DMEM-10의 9 mL와 끄다. 100 µ m 메쉬 필터를 통해 정지를 실행 합니다. 필터링 된 정지를 함께, 수영장 그리고 1 x 106 셀/접시에 10 cm 격판덮개의 2 세트 씨앗.</li>
		<li>오후에 격판덮개의 1 세트에 미디어를 DMEM 10 15 µ g/mL hygromycin B의 (0 일) 포함 된 바꿉니다. 다른 세트에는 미디어를 신선한 DMEM-10만 바꿉니다.</li>
		<li>48 시간 후 치료 접시 0.05% 트립 신-EDTA의 1 ml를 사용 하 여 집합에서 셀을 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM 10의 9 mL와 끄다. 실 온에서 5 분 동안 15 ml 원뿔 튜브와 500 x g에서 원심 분리기를 셀을 전송. supernatants 발음 하 고 즉시 알 약에서 DNA를 추출 진행. 또는, 원심 분리 단계 전에 큰 튜브로 셀 풀.</li>
		<li>페 놀 및 chroroform의 혼합물을 사용 하 여 DNA를 추출 하 고 앞에서 설명한10으로 나트륨 아세테이트와 냉 에탄올과 DNA를 침전. 개별 사전 선택 DNA 샘플을 보유 하 고 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
		<li>계속 경작 hygromycin B 선택 4 더 많은 일에 대 한 설정. 2 일 후 신선한 DMEM-10 포함 hygromycin B와 선택 미디어를 보충.</li>
		<li>7 일에 신선한 DMEM-10만 선택 미디어를 교체 합니다. 복구에 2 ~ 4 일을 허용 하 고 단계 2.1.8에서에서 설명한 대로 셀을 수확. 2.1.9 단계에서 설명한 대로 DNA 추출 진행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
확인 후 선택 샘플에 농축 헤어핀
	<ol>
<li>사용 5' 컨텍스트 (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') 3 ' 반전 루프 뇌관 (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3')에서 사전 및 사후 선택 DNA 샘플 반-헤어핀을 증폭. 모든 추출 된 DNA를 사용 하 여 별도 PCR 반응에 100-200 ng와 DNA의 반응 당. 참고: 이러한 컨텍스트 뇌관 5'과 3' 반전 루프 뇌관 및 해당 합니다 미르-30 컨텍스트 시퀀스 shRNA 삽입의 상류 shRNA 루프에서 순서 각각. 다른 라이브러리는 다른 oligos를 요구할 것 이다. 정화 단계 분리 필요에 따라 다른 제품의 크기를 조정 합니다.</li>
		<li>뇌관 및 genomic DNA를 제거 하 고 100과 200 bp. 사이 PCR 제품을 복구를 사용 하 여 크기 선택 구슬 구슬에 포함 된 프로토콜을 따릅니다.</li>
		<li>하프-헤어핀을 시퀀싱 하는 시퀀싱 라이브러리를 준비 합니다. 스크린 당 50 백만 이상 읽기를 생성 합니다. 시퀀싱 장비 및 장비에 대 한 적절 한 프로토콜을 따릅니다. 참고: 각 shRNA 라이브러리에서의 1000-fold 표현 및 약 10의 범위 (각 shRNA 100 표현에서 실시) 각 독립적인 감염의 적절 한 표현을 보장 화면 당 50 백만 읽기 제공 합니다. 각 감염 이벤트입니다.</li>
		<li>완벽 한 일치와 시퀀스를 계산 하는 펄 스크립트를 사용 하 여 각 shRNA 열거 합니다. 추가 분석을 위해 미리 선택 수영장에서 적어도 10 읽기를 했다 shRNAs를 선택 했다. Preselection를 후의 비율 계산 하 고 틀린 발견 비율 (FDR) 1000 순열 기준 결정은 풍부를 계산 합니다. 유전자와 shRNAs의 대상 선택 < 5%로 루즈벨트 "조회 수" 추가 테스트를 위해.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 유효성 확인 된 헤어핀 (이 하 "조회 수")
<ol><li>
화면에서 식별 하는 shRNAs를 포함 하는 포장 하는 lentiviruses
	<ol>
<li>시드 8 × 10 10 cm 접시에 접시 당6 293 피트 셀.</li>
		<li>다음 날, 항생제 무료 DMEM-당 10의 격판덮개; 9 mL 미디어를 바꿉니다 이 분 transfection 전에 마십시오.</li>
		<li>30 분 간격 동안 두 믹스 transfection에 대 한 준비:<ol>
<li>믹스 1 준비 (접시/shRNA; 당 최대 규모 shRNAs의 총 수에 따라): 10 µ L의 최적의 최소 필수 미디어의 0.5 mL에 2 mg/mL polyethylenimine (페이). Pipetting으로 혼합 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
			<li>믹스 2 (shRNA) 당 준비: 패키지 될 shRNA 벡터의 4 µ g, VSV G 봉투 벡터 (pMD2.G)의 1.5 µ g 그리고 2.5 µ g 포장 벡터 (psPAX2)의 최적의 최소 필수 미디어의 0.5 mL에 혼합. 주: 부정적인 컨트롤로 나중 감염에 사용 하 여 포장에 빈 lentiviral 벡터를 포함 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>믹스 2, 각 약 수를 믹스 1의 0.5 mL를 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합. 20 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 품 어.</li>
		<li>단계 3.1.2 dropwise 패션;에서 각 접시에 혼합물을 적용 부드럽게 혼합 하 판을 소용돌이 친다.</li>
		<li>다음 날, 신선한 DMEM-10의 5 mL는 미디어를 바꿉니다.</li>
		<li>48 시간 후에 초기 transfection는 상쾌한을 수집 하 고 0.22 μ m 필터를 통해 그것을 실행. 사전 필터 DMEM-10 복구를 최대화 하기를 젖은.</li>
		<li>6 잘 플레이트를 잘 감염에 대 한 이상적인 금액으로 필터링 된 상쾌한 약 수.</li>
		<li>나중에 사용 하기 위해-80 ° C에서 aliquots 고정 또는 즉시 변환 진행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
변환 및 luciferase 기자 재 활성화 및 야생-타입 MeCP2 유전자는 xi의 재 조직에 대 한 개별 헤어핀의 테스트.
	<ol>
<li>아침에, 1 x 105 사이 6 잘 플레이트에 셀/잘 플레이트.</li>
		<li>오후에 lentiviral 상쾌한 및 polybrene의 5-10 µ g/mL 신선한 DMEM-10의 2 mL와 함께 미디어를 대체 하 여 번호판을 감염. 바이러스 성 상쾌한 빈 lentiviral 벡터에서 생산으로 잘 컨트롤을 감염.</li>
		<li>다음 날, 2 mL DMEM-10 포함 1 mg/mL puromycin의 미디어를 바꿉니다. 4 일에 대 한 문화입니다.</li>
		<li>신선한 DMEM-10의 2 mL와 함께 미디어를 교체 하 고 48-72 h 복구에 대 한 허용.</li>
		<li>0.05% 트립 신-EDTA의 150 µ L로 세포를 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM 10의 1.5 mL와 끄다. 실 온에서 10 분간 15 ml 원뿔 튜브와 500 x g 에서 원심 분리기를 셀을 전송.</li>
		<li>미디어를 제거 하 고 resuspend 100 µ L 세포의 용 해 버퍼 luciferase 분석 결과 키트에 제공 된에 셀. 5 분 동안 실 온에서 품 어. 흰색 96 잘 접시와 키트에 포함 된 프로토콜을 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 분석 결과 lysates 전송. Xa 세포를 사용 하 여 긍정적인 제어 및 부정적인 컨트롤로 빈 lentiviral 벡터와 감염 사이 세포로. 참고: 분석 결과; 전에 형광등에 흰색 번호판을 노출 하지 않도록 이 배경 하는 분석 결과 감도 증가 하십시오. 분석 결과 키트에 제공 된 프로토콜 가능한 어둠 속에서 수행 하는 경우 가장 효과적인 것으로 발견 되었다.</li>
		<li>액티브 x 염색체에는 머리 핀에 MeCP2 식 수준에 영향을 했다 여부를 확인 하려면 tranduced 사이 세포에서 RNA를 분리 하 고 뇌관만 야생 타입 MeCP2 (f:를 증폭 하도록 설계 되었습니다으로 양이 많은 PCR를 사용 하 여 MeCP2 mRNA 수준 측정 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').</li>
		<li>
옵션: 셀 puromycin 선택에서 회복 후 0.2 µ M의 최종 농도에 5-아를 추가 하 여 분석 결과의 감도 증가. 미디어를 교체 하지 않고 72 h에 대 한 셀을 문화 그리고 상업 luciferase 분석 결과 키트를 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 다음 분석 결과.</li>
		<li>입 막 음된 야생-타입 MeCP2의 재 활성화를 측정 합니다. 단계는 프로토콜 3.2.1 개별 헤어핀을 포함 하는 벡터와 xi, 야생 타입 MeCP2 항구 Xa 세포를 감염. -3.2.4. 세포에서 RNA를 분리 하 고 정량 PCR 뇌관만 야생 타입 MeCP2를 증폭 하도록 설계 되었습니다 사용 하는 MeCP2 mRNA 수준 측정 (f: 5 '-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', r: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

닥터의 프레드 허 친 슨 암 연구 센터의 직원으로이 문서에 기여.  표현 그 자신의 고 반드시 건강의 국가 학회 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지는 않습니다.

우리의 최근 연구6, luciferase murine 셀 라인 생성 그리고 hygromycin 저항 유전자는 사이에 MeCP2 융합의 도서관으로 불리고 > 60000 shRNAs 대상 > 25000 유전자. 우리는 발견 30 유전자 hygromycin B 선택, 누구의 노크 다운 수 여 생존 이점을 MeCP2 x 염색체 입을 통제에서 그들의 역할을 제안. 이러한 결과 개별 헤어핀으로 보고 셀 라인을 시험 하 고 침묵 luciferase 기자의 재 활성화를 평가 하 여 확인 했다.
우리의 스크린의 모든 복제에 최고 4 개의 헤어핀 XIST 대상 찾는 XCI11 XIST 의 중추적인 역할을 주어 우리의 방법에 대 한 강한 내부 유효성 검사를 제공 합니다. XCI에 규제 역할 이전 설명 하지 했다 TGFβ superfamily 이외 다른...

한 여성, 레트 증후군, 유전 성 정신 장애의 가장 일반적인 형태는 MeCP2, 정상적인 신경 기능1에 필수적인 단백질을 인코딩하는 x 염색체 유전자 heterozygous 돌연변이 의해 발생 합니다. 이 장애를 치료 하는 잠재적인 접근 방식을 것 사이에 야생-타입 MeCP2 대립 유전자의 재 활성화 MeCP2 식의 유신이 질병1, 의 마우스 모델에서 신경학 상 적자를 표시 했다 2 , 그러나 4., 단단히는 유기 체3,4의 수명에 걸쳐 유지 한 개의 암 세포에서 염색체 X의 epigenetic 입을 하 고 사이 유전자의 강력한 재 활성화 가능성이 주요 요구 여러 epigenetic 규제 경로의 교란 한다입니다.
MeCP2 침묵의 유지 보수에 필요한 요소를 식별 하려면 우리가 먼저 개발 유전자 변형 마우스 두 X 염색체 중 하나에 MeCP2-luciferase-hygromycin 저항 유전자 융합 (MeCP2-뤽-시간)을 들고 (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. 비록 MeCP2 퓨전 구문에서 표현 된이 불안정 하 고 손실 함수, hemizygous 남성 (MeCP2 뤽 시간/Y) X에 MeCP2 삭제 phenotypically 흉내 낸 리포터 유전자의 표현에에서 결과 판명 내 생 MeCP25의 식과 일치 패턴에서 쉽게 감지 했다. 우리 다음 비활성 또는 액티브 x 염색체에 구조와 불멸 하 게 섬유 아 세포 클론을 생성 하 고 그 전 표현 야생 타입 MeCP2 하지 기자 구문; 확인 역은 후자에 대 한 사실 이다. DNA 유전자 침묵, 파기를 알려진 에이전트 demethylating 5-azacytidine (5-아 자)에 노출 되 면 셀 ("기자 셀") 사이에 기자와 얻은 활동 우리의 구문을 다시 활성화 수 나타내는 생물 발광 분석 결과에 따라서 유전자 검사에 대 한 사용.
우리는 다음 MeCP2 침묵의 레 귤 레이 터에 대 한 높은 처리량 유전 스크린을 개발 했다. 기자 셀 라인 처음 retroviral 라이브러리를 포함 하는 감염 > 60000 다른 shRNAs 대상 > 마우스 게놈5,6, 걸쳐 25000 유전자 다음 hygromycin B 선택 대상. 헤어핀 주파수 사전에 비교 했다 고 후 선택 샘플 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여, 기자로 재 hygromycin B 선택 성장 이점 수 여 책임 헤어핀의 풍부 귀착되 었 다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 MeCP2 , 침묵에 연루 30 유전자를 확인 하 고 이후 개별 헤어핀 기자 셀 시험 그들의 luciferase 활동을 측정 하 여 결과 확인.

<table><tbody><tr><td>293FT 세포주</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>5-Azacytidine</td><td>Sigma</td><td>A2385-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MECP2 항체</td><td>Millipore</td><td>07-013</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해</td>효소 <td>Sigma</td><td>C2674-1G</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Solid White 폴리스티렌 마이크로플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-336</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV)</td><td>Open Biosystems</td><td>EAV4679</td><td></td></tr><tr><td>Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library</td><td>Open Biosystems</td><td>RMM3796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisherbrand</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>일루미나</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Calbiochem</td><td>400051-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>Homogenous Assay for screening colonies</td></tr><tr><td>Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins</td></tr><tr><td>광도계 TopCount NXT</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>또는 유사한 광도계</td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v2</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2001</td><td>장비와 호환되는 키트 사용</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>VSV-G envelope vector</td></tr><tr><td>폴리브레네</td><td>시그마</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸레니민</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td>패키징 벡터</td></tr>: <tr><td>퓨로마이신</td><td>Gibco</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

풀링된 shrna mecp2 재 활성화 비활성화 x 염색체에 대 한 화면

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

리포터 유전자는 섬으로에 삽입을 사용 하 여 앞으로 유전 스크린 모델 생물에서 후 컨트롤의 메커니즘을 조사를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 짧은 머리 핀 RNAs (shRNAs) 및 클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)를 포함 하 여 기술 2 중 포유류 세포에서 이러한 화면을 활성화 했습니다. 여기 우리 x 염색체 비활성화 (XCI)의 레 귤 레이 터에 대 한 대규모 shRNA 스크린 반딧불 luciferase murine 셀 라인을 사용 하 여 설명과 hygromycin 저항 유전자에서 절 메 틸 CpG 의무적인 단백질의 C-말단에 2 (MeCP2) 유전자 에 비활성 x 염색체 (Xi). 기자 셀 라인 구축의 재 활성화 hygromycin B 선택, 큰 shRNA 라이브러리 및 그들의 포스트 선택 농축을 사용 하 여 측정 하 여 기자를 다시 활성화 하는 헤어핀을 식별를 생존 우위를 수 여 다음-세대 시퀀싱입니다. 풍부한 헤어핀은 개별적으로 xi luciferase 기자를 활성화 하는 능력을 테스트 하 여 확인 됩니다.

마우스 힘 줄 fibroblasts 수확 했다MeCP2 뤽 시간/X X 이전 설명에서 HPV 16 virus7에서 e 6와 E7 oncogenes의 retroviral 변환에 의해 불후MeCP2 여성 마우스 제한 희석을 사용 하 여 복제 및 테스트 luciferase 활동과 표현 야생-타입 MeCP2 단백질 (그림 1A 및 1B). Luciferase 활동은 기자, Xa에 있었다면 강력 하 고 탐지 사이; 하는 경우에 네이티브 MeCP2 식 전시 상호 패턴. 우리 선택 luciferase 활동 (Xi-8) 없이 복제 및 복제 추가 실험에 대 한 강력한 활동 (Xa-3). Xi-8 세포 5-아 자로 치료 했다 때 luciferase 활동에 복용량 의존 유도 (그림 1C) 관찰 되었다.
Xi-8 및 Xa-3 ...

우리 보고 작은 헤어핀 RNA (shRNA) 반딧불 luciferase murine 셀 라인에서 x 염색체 비활성화의 레 귤 레이 터를 식별 하기 위한 다음 세대 시퀀싱 기반 프로토콜 및 hygromycin 저항 유전자는 메 틸 CpG 바인딩 단백질 2 (융합 MeCP2) 비활동 성 X 염색체에 유전자입니다.

풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 힘줄 섬유아세포를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 먼저 배지를 흡인하여 10cm 플레이트에서 세포를 수확합니다. 그런 다음 0.05%트립신 EDTA 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다.배양 후 9ml의 DMEM-10으로 트립신을 급냉하고 15ml 원뿔형 튜브에 재현탁 세포를 수집합니다. DMEM-10으로 세포를 100마이크로리터당 1개의 세포라는 최종 농도로 희석합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 현탁액을 각 웰에 피펫팅하여 세포를 96개의 웰 플레이트로 옮깁니다.웰이 합류할 때까지 섭씨 37도에서 세포를 배양하며, 이는 최대 2-3주가 소요될 수 있습니다. 3-5일마다 미디어를 새 DMEM-10으로 교체합니다. 융합되면 웰당 20마이크로리터 0.05%트립신 EDTA로 세포를 동원하고 96웰 플레이트의 두 중복 세트로 분할합니다.한 세트의 플레이트에서 루시퍼라제 활성을 분석합니다. luciferase assay kit에 포함된 프로토콜에 따라 배지 제거가 필요하지 않은 균일한 Firefly luciferase assay를 사용합니다. 분석 결과를 사용하여 나머지 플레이트 세트에서 검출 가능한 루시퍼라제 활성이 없는 클론을 선택합니다.이러한 클론을 먼저 24웰 플레이트로 확장한 다음 6웰 플레이트로 확장합니다. 루시퍼라아제 활성이 가장 높은 클론에 대해 동일한 작업을 수행합니다. 이는 유효성 검사를 위해 양성 컨트롤로 사용됩니다.6개의 웰 플레이트에서 팽창한 후, 웨스턴 블롯을 위해 각 웰의 분취량을 수확합니다. 200마이크로리터의 0.05%트립신 EDTA로 세포를 동원합니다. 세포를 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다.2ml의 DMEM-10으로 세포를 담금질하고 세포의 절반을 다른 6웰 플레이트로 옮깁니다. 세포가 플레이트 바닥에 부착될 때까지 기다립니다. 그런 다음 웨스턴 블롯에 대한 용해 전에 PBS로 세포를 한 번 씻습니다.6개의 웰 플레이트에서 웰당 20만 개의 세포로 여러 개의 음성 클론을 플레이트화합니다. 10 마이크로 몰 5- 아자시티 딘으로 세포를 한 번 치료하십시오. 그런 다음 이전과 같이 루시페라제 활성을 분석하기 전에 배지를 변경하지 않고 72시간 동안 배양합니다.다음으로, 스크리닝에 대해 5-아자시티딘으로 루시페라제 활성을 얻은 하나의 음성 클론을 선택하고 여러 개의 10cm 플레이트로 확장하기 시작합니다. 백업으로 액체 질소에 남아 있는 음성 클론을 동결합니다. 양성 클론은 조직 배양액에서 유지되거나 추가 사용까지 동결될 수 있습니다.아침에 100만 개의 비활성 X 세포를 10cm 조직 배양 플레이트에 플레이트합니다. 오후에는 미리 결정된 양의 바이러스 상층액과 밀리리터당 5-10마이크로그램의 폴리브레인이 함유된 새로운 DMEM-10으로 배지를 교체하여 플레이트를 감염시킵니다. 18-24시간 후 배지를 흡입하고 각 플레이트에 10ml의 새로운 DMEM-10을 추가합니다.배양 플레이트를 48시간 더 보관합니다. 아침에는 플레이트당 1ml의 0.05%트립신 EDTA를 사용하여 세포를 동원하고 플레이트당 9ml의 DMEM-10을 사용하여 세포를 담금질합니다. 100미크론 메쉬 필터를 통해 서스펜션을 실행합니다.여과된 현탁액을 함께 당기고 플레이트당 100만 개의 세포에 10cm 플레이트 2세트를 시딩합니다. 오후에는 한 세트의 플레이트에 있는 미디어를 밀리리터당 15마이크로그램의 하이그로마이신이 포함된 DMEM-10으로 교체 B.In 다른 세트는 새 DMEM-10으로만 교체합니다. 48시간 후, 1ml의 0.05%트립신 EDTA를 사용하여 Hygromycin B 미처리 플레이트에서 세포를 동원합니다.섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다. 다음으로, 9ml의 DMEM-10으로 세포를 담금질합니다. 개별 샘플을 채취하고 즉시 DNA 추출을 진행합니다.Hygromycin B selection set을 6일 더 배양하고 격일로 Hygromycin B를 포함하는 새로운 DMEM-10으로 selection media를 보충합니다. 6일째에는 선택 매체를 새 DMEM-10으로만 교체합니다. 회복하는 데 4일이 소요된 후 이전과 같이 선택 후 샘플 DNA를 수확합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 post-selection 샘플에서 농축된 헤어핀을 식별합니다. 적중을 검증하기 위해 먼저 10cm 플레이트에 플레이트당 800만 개의 293-FT 셀을 시드합니다. 다음 날, 절제 30분 전에 플레이트당 9ml의 무항생제 DMEM-10으로 배지를 교체합니다.다음으로, 0.5ml의 transfection mix 1을 transfection mix 2의 각 부분 표본에 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 혼합물을 각 플레이트에 드롭 방식으로 바르고 플레이트를 부드럽게 휘젓아 섞습니다.다음 날, 초기 transfection 후 5ml의 새 DMEM-10.48로 배지를 교체하고, 렌티바이러스 상층액을 채취한 다음, DMEM-10으로 사전 적신 0.22미크론 필터에 통과시켜 회수율을 극대화합니다. 다음 날 아침, 웰당 10만 개의 비활성 X 세포를 6개의 웰 플레이트에 플레이트합니다. 오후에는 렌티바이러스 상등액이 함유된 2밀리리터의 새로운 DMEM-10과 폴리브레렌 1밀리리터당 5-10마이크로그램으로 미디어를 교체하여 플레이트를 감염시킵니다.빈 렌티바이러스 벡터에서 생성된 바이러스 상층액으로 대조군 웰을 감염시킵니다. 다음 날, 배지를 1밀리리터당 1밀리그램의 푸로마이신이 함유된 2밀리리터의 DMEM-10으로 교체합니다. 4일 동안 선택을 사용합니다.4일 후 배지를 2ml의 새 DMEM-10으로 교체하고 회복하는 데 48-72시간이 소요됩니다. 150마이크로리터의 0.05%트립신 EDTA로 세포를 동원한 후 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다. 1.5ml의 DMEM-10으로 세포를 담금질한 후 원추형 튜브로 옮기고 실온에서 500배 G로 10분 동안 세포를 원심분리합니다.배지를 제거하고 Lucifererase 분석 키트에 제공된 100마이크로리터의 용해 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 현탁액을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후 서스펜션을 흰색 96웰 플레이트로 옮깁니다.키트에 포함된 프로토콜에 따라 암실에서 분석을 수행합니다. 활성 X 세포를 positive control로 사용하고 empty lentiviral vector에 감염된 negative X cell을 negative control로 사용합니다. 불멸화된 마우스 힘줄 섬유아세포 클론은 활성 또는 비활성 X 염색체에 대한 리포터의 배치와 각각 일치하는 양성 또는 음성 Firefly 루시퍼라제 활성을 보여줍니다.웨스턴 블롯에 의해 결정되는 MeCP2 발현은 상호 패턴을 나타냅니다. Firefly 루시퍼라제 활성은 5-azacitidine을 투여하여 음성 클론에서 유도될 수 있습니다. 활성 X 염색체에 존재하는 경우, Hygromycin resistance 유전자는 비활성 X 염색체에 유전자가 있는 세포와 비교할 때 Hygromycin 선택에서 생존 이점을 제공합니다.이 비디오를 시청한 후에는 비활성 X 염색체에 선택적으로 삽입된 리포터를 사용하여 X염색체 불활성화 조절자에 대한 스크리닝을 설계하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 제 실험실에서는 이전에 효모의 염색질 조절자에 대한 기본 스크리닝을 보고한 적이 있으며, 이 접근법의 성공으로 인해 포유류 세포의 X-염색체 불활성화 조절자를 위해 이 스크리닝을 설계하게 되었습니다. 이 절차에 따라 포유류 세포의 X-염색체 불활성화에 관한 추가 질문에 답하는 데 도움이 되는 작은 간섭 RNA, CRISPR, 작은 분자를 사용하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기 우리는 세포 생존을 촉진 유전자 표적을 식별하는 방법을 순서 인간 LentiPlex 풀링 라이브러리 전통을 사용합니다. 우리는 설정하고 deconvolute LentiPlex 화면을하고 결과를 확인하는 방법을 보여줍니다.

임무 LentiPlex는 포유 동물 세포에서 shRNA 도서관 검사를 풀링

여기, 우리 남부 럽 그리고/또한 PCR를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 발생 하는 동종 재결합 이벤트를 식별 하는 데 자세한 프로토콜 제시. 이 메서드는 nonmuscle myosin II 유전자 대체 마우스 모델 기술을 사용 하 여 전통적인 배아 줄기 세포 기반 동종 재결합 중재 대상의 세대에 의해 exemplified입니다.

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계

여기서, 우리는 비-랜덤 X 염색체 불 활성화와 함께 실행 가능한 여성 뮤 린 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 하 고, 즉 임산부-상속 된 X 염색체는 세포의 100%에서 불활성 이다. 우리는 또한 생체 내에서 비활성 X 염색체의 약리학 적 재 활성화의 타당성, 내성 및 안전성을 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)은 내인성 및 외인성 적용 MeCP2 단백질 변이체의 정량적 검출을위한 새로운 접근법으로, 광범위한 작업 범위에 걸쳐 낮은 인트라 및 분석 오류로 높은 정량적, 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 여기서, MeCP2-ECLIA에 대한 프로토콜을 96웰 형식으로 설명한다.

MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

MRGPRX2 수용체를 통해 비만 세포를 활성화할 수 있는 짧은 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 기술이 기재되어 있다. 관련 기술은 쉽고 저렴하며 다른 세포 수용체로 확장 될 수 있습니다.

엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝

렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.

약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

학습하세요 shRNA와 차세대 시퀀싱을 이용해 비활성 X 염색체의 조절 인자를 식별하는 방법을. 마우스 힘줄 섬유아세포를 사용하여 MeCP2 유전자 재활성화를 연구하는 이 프로토콜은 유전학 및 신경과학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

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