풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 힘줄 섬유아세포를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 먼저 배지를 흡인하여 10cm 플레이트에서 세포를 수확합니다. 그런 다음 0.05%트립신 EDTA 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다.

배양 후 9ml의 DMEM-10으로 트립신을 급냉하고 15ml 원뿔형 튜브에 재현탁 세포를 수집합니다. DMEM-10으로 세포를 100마이크로리터당 1개의 세포라는 최종 농도로 희석합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 현탁액을 각 웰에 피펫팅하여 세포를 96개의 웰 플레이트로 옮깁니다.

웰이 합류할 때까지 섭씨 37도에서 세포를 배양하며, 이는 최대 2-3주가 소요될 수 있습니다. 3-5일마다 미디어를 새 DMEM-10으로 교체합니다. 융합되면 웰당 20마이크로리터 0.05%트립신 EDTA로 세포를 동원하고 96웰 플레이트의 두 중복 세트로 분할합니다.

한 세트의 플레이트에서 루시퍼라제 활성을 분석합니다. luciferase assay kit에 포함된 프로토콜에 따라 배지 제거가 필요하지 않은 균일한 Firefly luciferase assay를 사용합니다. 분석 결과를 사용하여 나머지 플레이트 세트에서 검출 가능한 루시퍼라제 활성이 없는 클론을 선택합니다.

이러한 클론을 먼저 24웰 플레이트로 확장한 다음 6웰 플레이트로 확장합니다. 루시퍼라아제 활성이 가장 높은 클론에 대해 동일한 작업을 수행합니다. 이는 유효성 검사를 위해 양성 컨트롤로 사용됩니다.

6개의 웰 플레이트에서 팽창한 후, 웨스턴 블롯을 위해 각 웰의 분취량을 수확합니다. 200마이크로리터의 0.05%트립신 EDTA로 세포를 동원합니다. 세포를 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다.

2ml의 DMEM-10으로 세포를 담금질하고 세포의 절반을 다른 6웰 플레이트로 옮깁니다. 세포가 플레이트 바닥에 부착될 때까지 기다립니다. 그런 다음 웨스턴 블롯에 대한 용해 전에 PBS로 세포를 한 번 씻습니다.

6개의 웰 플레이트에서 웰당 20만 개의 세포로 여러 개의 음성 클론을 플레이트화합니다. 10 마이크로 몰 5- 아자시티 딘으로 세포를 한 번 치료하십시오. 그런 다음 이전과 같이 루시페라제 활성을 분석하기 전에 배지를 변경하지 않고 72시간 동안 배양합니다.

다음으로, 스크리닝에 대해 5-아자시티딘으로 루시페라제 활성을 얻은 하나의 음성 클론을 선택하고 여러 개의 10cm 플레이트로 확장하기 시작합니다. 백업으로 액체 질소에 남아 있는 음성 클론을 동결합니다. 양성 클론은 조직 배양액에서 유지되거나 추가 사용까지 동결될 수 있습니다.

아침에 100만 개의 비활성 X 세포를 10cm 조직 배양 플레이트에 플레이트합니다. 오후에는 미리 결정된 양의 바이러스 상층액과 밀리리터당 5-10마이크로그램의 폴리브레인이 함유된 새로운 DMEM-10으로 배지를 교체하여 플레이트를 감염시킵니다. 18-24시간 후 배지를 흡입하고 각 플레이트에 10ml의 새로운 DMEM-10을 추가합니다.

배양 플레이트를 48시간 더 보관합니다. 아침에는 플레이트당 1ml의 0.05%트립신 EDTA를 사용하여 세포를 동원하고 플레이트당 9ml의 DMEM-10을 사용하여 세포를 담금질합니다. 100미크론 메쉬 필터를 통해 서스펜션을 실행합니다.

여과된 현탁액을 함께 당기고 플레이트당 100만 개의 세포에 10cm 플레이트 2세트를 시딩합니다. 오후에는 한 세트의 플레이트에 있는 미디어를 밀리리터당 15마이크로그램의 하이그로마이신이 포함된 DMEM-10으로 교체 B.In 다른 세트는 새 DMEM-10으로만 교체합니다. 48시간 후, 1ml의 0.05%트립신 EDTA를 사용하여 Hygromycin B 미처리 플레이트에서 세포를 동원합니다.

섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다. 다음으로, 9ml의 DMEM-10으로 세포를 담금질합니다. 개별 샘플을 채취하고 즉시 DNA 추출을 진행합니다.

Hygromycin B selection set을 6일 더 배양하고 격일로 Hygromycin B를 포함하는 새로운 DMEM-10으로 selection media를 보충합니다. 6일째에는 선택 매체를 새 DMEM-10으로만 교체합니다. 회복하는 데 4일이 소요된 후 이전과 같이 선택 후 샘플 DNA를 수확합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 post-selection 샘플에서 농축된 헤어핀을 식별합니다. 적중을 검증하기 위해 먼저 10cm 플레이트에 플레이트당 800만 개의 293-FT 셀을 시드합니다. 다음 날, 절제 30분 전에 플레이트당 9ml의 무항생제 DMEM-10으로 배지를 교체합니다.

다음으로, 0.5ml의 transfection mix 1을 transfection mix 2의 각 부분 표본에 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 혼합물을 각 플레이트에 드롭 방식으로 바르고 플레이트를 부드럽게 휘젓아 섞습니다.

다음 날, 초기 transfection 후 5ml의 새 DMEM-10.48로 배지를 교체하고, 렌티바이러스 상층액을 채취한 다음, DMEM-10으로 사전 적신 0.22미크론 필터에 통과시켜 회수율을 극대화합니다. 다음 날 아침, 웰당 10만 개의 비활성 X 세포를 6개의 웰 플레이트에 플레이트합니다. 오후에는 렌티바이러스 상등액이 함유된 2밀리리터의 새로운 DMEM-10과 폴리브레렌 1밀리리터당 5-10마이크로그램으로 미디어를 교체하여 플레이트를 감염시킵니다.

빈 렌티바이러스 벡터에서 생성된 바이러스 상층액으로 대조군 웰을 감염시킵니다. 다음 날, 배지를 1밀리리터당 1밀리그램의 푸로마이신이 함유된 2밀리리터의 DMEM-10으로 교체합니다. 4일 동안 선택을 사용합니다.

4일 후 배지를 2ml의 새 DMEM-10으로 교체하고 회복하는 데 48-72시간이 소요됩니다. 150마이크로리터의 0.05%트립신 EDTA로 세포를 동원한 후 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다. 1.5ml의 DMEM-10으로 세포를 담금질한 후 원추형 튜브로 옮기고 실온에서 500배 G로 10분 동안 세포를 원심분리합니다.

배지를 제거하고 Lucifererase 분석 키트에 제공된 100마이크로리터의 용해 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 현탁액을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후 서스펜션을 흰색 96웰 플레이트로 옮깁니다.

키트에 포함된 프로토콜에 따라 암실에서 분석을 수행합니다. 활성 X 세포를 positive control로 사용하고 empty lentiviral vector에 감염된 negative X cell을 negative control로 사용합니다. 불멸화된 마우스 힘줄 섬유아세포 클론은 활성 또는 비활성 X 염색체에 대한 리포터의 배치와 각각 일치하는 양성 또는 음성 Firefly 루시퍼라제 활성을 보여줍니다.

웨스턴 블롯에 의해 결정되는 MeCP2 발현은 상호 패턴을 나타냅니다. Firefly 루시퍼라제 활성은 5-azacitidine을 투여하여 음성 클론에서 유도될 수 있습니다. 활성 X 염색체에 존재하는 경우, Hygromycin resistance 유전자는 비활성 X 염색체에 유전자가 있는 세포와 비교할 때 Hygromycin 선택에서 생존 이점을 제공합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 비활성 X 염색체에 선택적으로 삽입된 리포터를 사용하여 X염색체 불활성화 조절자에 대한 스크리닝을 설계하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 제 실험실에서는 이전에 효모의 염색질 조절자에 대한 기본 스크리닝을 보고한 적이 있으며, 이 접근법의 성공으로 인해 포유류 세포의 X-염색체 불활성화 조절자를 위해 이 스크리닝을 설계하게 되었습니다. 이 절차에 따라 포유류 세포의 X-염색체 불활성화에 관한 추가 질문에 답하는 데 도움이 되는 작은 간섭 RNA, CRISPR, 작은 분자를 사용하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.