마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

이 실험의 전반적인 목표는 시상하부 뉴런의 GLUT4와 같은 1차 뉴런 세포에서 최소한의 손상으로 실시간 단백질 이동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 제2형 당뇨병의 경우와 같이 인슐린 신호 전달 및 대사의 신경 조절과 관련된 주요 질문을 설명할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자들이 일차 세포 배양을 분리하고 약물 유도 효과를 실시간으로 관찰할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 제2형 당뇨병 또는 뇌 관련 인슐린 저항성의 치료법을 선택하는 것인데, 이는 이제 이 인슐린 신호가 시상하부 뉴런의 케모카인 CCL5에 의해 어떻게 변경되는지 알고 있기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 배양 하루 전에 배양 접시에 poly-D lysine을 코팅하십시오. 6웰 접시의 경우 각 웰에 0.05mg/mL의 폴리-D 라이신 1.5mL를 추가합니다.

다음날 poly-D lysine을 제거하고 ddH2O 2mL로 접시를 두 번 씻습니다. 그런 다음 10cm 페트리 접시에 20mL의 세척 매체를 채우고 얼음 위에 보관합니다. 15mL 튜브에 세척 매체를 채우고 얼음 위에 보관합니다.

뇌 조직 격리를 위해 플랫폼, 해부 현미경 및 수술 도구를 75% 에탄올로 소독하여 오염을 방지합니다. 그런 다음 탯줄 주변을 잘라 새끼를 손상시키지 않고 격리시킵니다. 그런 다음 각 강아지의 머리를 제거하고 끝이 가는 직선 집게를 사용하여 제자리에 고정합니다.

끝이 가는 또 다른 구부러진 집게를 사용하여 양쪽의 바깥쪽 피부와 두개골을 제거하고 앞쪽에서 등쪽 방향으로 떼어냅니다. 그런 다음 고립된 뇌를 얼음처럼 차가운 세척 매체가 있는 깨끗한 페트리 접시에 보관하십시오. 뇌를 뒤집고 복부 쪽을 위로 유지하십시오.

그 후, 끝이 가는 곡선 겸자로 시상하부 조직을 분리합니다. 날카로운 겸자로 후각엽을 잡고 구부러진 겸자로 뇌 전체를 둘러싼 얇은 수막을 벗겨냅니다. 피질의 아래쪽으로 뒤집고 옆으로 당겨 피질에서 해마를 분리합니다.

뇌의 모든 영역이 분리되면 얼음 찬 세척 매체가 들어 있는 15ml 튜브에서 이 조직을 자릅니다. 이 절차에서는 조직 함유 튜브를 2-3회 거꾸로 하여 조직을 헹굽니다. 그런 다음 조직이 안정될 수 있도록 튜브를 똑바로 유지하십시오.

진공 시스템에 부착된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상부 매체를 제거합니다. 티슈를 씻으려면 15mL의 얼음 차가운 세척 매체를 넣고 튜브를 2-3회 뒤집습니다. 최종 세척 후 1mL 피펫을 사용하여 세척 매체를 제거합니다.

파파인-트립신 소화 완충액이 함유된 조직을 섭씨 37도의 수조에서 7-14분 동안 배양합니다. 그 후, 소 태아 혈청 1 부피를 첨가하여 효소 활성을 중화시킵니다. 튜브를 랙에 보관하고 조직이 안정될 때까지 1-2분 동안 기다립니다.

그 후, 1mL 피펫으로 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 6mL의 도금 매체를 시험관에 넣고 5mL 피펫으로 조직을 위아래로 부드럽게 50회 피펫팅합니다. 튜브를 랙에 보관하고 두툼하고 해리되지 않은 조직이 가라앉을 때까지 1-2분 동안 기다립니다.

다음으로, 해리된 세포를 포함하는 상상을 새 튜브로 옮기고 도금 매체로 희석합니다. 그런 다음 6웰 접시의 각 웰에 2mL의 완전한 배양 배지를 추가합니다. 라이브 이미징을 위해 세포를 준비하려면 집게를 사용하여 뉴런이 있는 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 유리 슬라이드에 조심스럽게 올려 놓습니다.

그런 다음 섬세한 작업용 물티슈로 여분의 매체를 두 번 접고 움직이지 않고 커버 슬립에 조심스럽게 올려 놓아 제거합니다. 커버 슬립에서 불필요한 움직임을 방지하기 위해 과도한 양의 매체를 제거하는 것이 필수적입니다. 다음으로, 선택한 세포 샘플을 10ng/mL의 CCL5 또는 10units/mL의 인슐린으로 1분 동안 처리합니다.

그런 다음 커버 슬립 가장자리에 희석된 인슐린 1.5mcL를 추가합니다. 그런 다음 60배 배율 1.52 NA 대물 렌즈에 이멀젼 오일을 추가합니다. 그런 다음 커버 슬립을 디콘볼루션 현미경 스테이지에 놓고 커버 슬립이 아래를 향하도록 하고 적절하게 고정합니다.

명시야 또는 형광 조명을 사용하여 표적 세포를 식별합니다. 그런 다음 대상 세포를 명확하게 관찰할 수 있을 때까지 초점을 조정합니다. 불필요한 긁힌 자국을 방지하기 위해 대물렌즈를 커버 슬립 영역 밖으로 이동하지 마십시오.

다음으로, GFP 신호로 GFP-GLUT4를 식별합니다. 그런 다음 이미지 획득을 위해 원하는 표적 세포를 식별합니다. 그런 다음 픽셀 수, 여기 파장, 투과 비율, 노출 시간, 스택 두께, 시간 간격 및 총 이미징 시간을 포함하여 각 타겟 셀에 적절한 실험 매개변수를 설정합니다.

최대 픽셀 강도를 얻기 위해 노출 매개변수를 약 2000에서 3000 카운트로 조정합니다. 형광 광표백을 최소화하려면 노출 시간을 1초 미만으로 유지하면서 여기광 투과율을 최대한 줄이십시오. 표적 세포의 상단과 하단이 모두 약간 초점에서 벗어날 때까지 현미경 스테이지를 이동하여 각 표적 세포에서 Z 스택의 상한 및 하한을 설정합니다.

빛 이미지에 따른 뉴런 사멸에서 형광 광 표백을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 이 그림은 1차 배양된 시상하부 뉴런이 뉴런 마커 MAP2로 표지되었음을 보여줍니다. 시상하부 뉴런 마커 POMC와 CCR5의 동시 발현.

공동 국소화된 이미지는 CCL5가 POMC 양성 시상하부 뉴런에서 발현됨을 보여줍니다. 이 이미지는 야생형 시상하부 뉴런과 CCR5 이중 음성 시상하부 뉴런에서 GFP-GLUT4 단백질의 발현을 보여줍니다. 뉴런은 인슐린 또는 CCL5로 자극되었습니다.

화살표는 인슐린 또는 CCL5 자극 전후 신경염의 GFP-GLUT4 반점을 가리키고, 별표는 CCL5 자극 전후 표면 GLUT4-GFP를 나타냅니다. 일단 마스터되면, 일차 세포 기술에 대한 이 실험실 기록은 실험 요구 사항 및 적절하게 수행되었는지 여부에 따라 1시간에서 4시간 사이에 수행할 수 있습니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 1차 세포 배양에서 즉각적인 약물 유도 효과를 특성화할 수 있는 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 1차 시상하부 뉴런, 해마 뉴런 및 피질 뉴런을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 실험실 외에도 다양한 자극에 따라 연속 분자의 실시간 녹음을 수행하는 방법도 알 수 있습니다. 실험복과 장갑을 착용하고 에탄올을 자주 사용하여 동물의 박테리아와 곰팡이로 인한 오염을 방지하는 것을 잊지 마십시오.

또한 이 절차 전반에 걸쳐 커버 슬립과 뉴런을 다룰 때 매우 주의하십시오.