마우스 뇌에 지속적인 약물 주입 시스템을 사용하여 말초 포도당 불내성에 대한 시상하부 인슐린 신호 연구

이 실험의 전반적인 목표는 대뇌간 심실 전달 시스템인 미삼투압 펌프를 통해 길항제인 Met-C-C-L-5를 투여하여 C-C-L-5 신호를 조작하여 말초계의 인슐린 기능과 포도당 대사에서 시상하부 C-C-L-5 신호의 역할을 조사하는 것입니다. 이 약은 뇌의 체당 대사 및 인슐린 반응성을 조절하는 케모카인 C-C-L-5와 같은 생화학 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 측정의 주요 장점은 실험자가 설치류에서 유전자 조작을 할 때 일반적으로 일어나는 보상 효과나 장애 발생 없이 일정 기간 동안 뇌의 특정 신호를 쉽게 조작할 수 있다는 것입니다.

미삼투압 펌프를 삽입하고 혈중 인슐린과 포도당 수치를 정확하게 측정하려면 기술과 정밀도가 필요하므로 이 절차를 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 수술 하루 전, 1밀리리터 주사기와 뭉툭한 바늘을 사용하여 인공 뇌척수액(A-C-S-F)을 펌프에 채워 뇌 미세삼투압 펌프를 준비합니다. 그런 다음 펌프를 A-C-S-F에 담그고 셰이커에 올려 밤새 부드럽게 흔듭니다.

다음 날, 펌프에서 ACSF를 제거하고 초과분이 누출될 때까지 ACSF에 희석된 미리 준비된 약물 용액을 완전히 채웁니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 카테터 튜브를 원하는 길이로 자릅니다. 끝이 뭉툭한 뇌 주입 바늘을 사용하여 튜브를 뇌 주입 키트에 부착합니다.

그런 다음 주입 키트의 튜브에 약물 용액을 채웁니다. 키트를 조립한 후 미삼투압 펌프에 부착합니다. 마지막으로, 펌프가 마르는 것을 방지하기 위해 멸균된 50ml 튜브에 A-C-S-F의 삼투압 펌프 뇌 주입 설정을 담그십시오.

수술을 시작하려면 마취된 마우스의 머리를 정위 장치에 장착하고 고정합니다. 수술용 가위와 집게를 사용하여 두개골을 덮고 있는 바깥쪽 피부를 잘라냅니다. 그런 다음 요오드를 사용하여 주변 두개골을 청소합니다.

다음으로, 목 부위 근처에 뭉툭한 머리 가위를 사용하여 삼투압 펌프 뇌 융합 세트 이식을 위해 피하 피부에서 가장 바깥쪽 피부층을 분리합니다. 정위 장치를 사용하여 뇌 지도를 참조하여 주입 지점을 표시합니다. 손톱 드릴을 사용하여 두개골에 표시된 부위 주위에 구멍을 뚫고 쥐의 수막과 혈관이 부러지지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 관심 약물이 포함된 미삼투압 펌프 뇌 융합 세트 또는 대조군으로 A-C-S-F를 목 부위 뒤의 피부 아래에 놓습니다. 약물을 뇌에 주입하려면 뚫린 구멍에 뇌 주입 바늘을 삽입하십시오. 표면 탈감작 젤을 사용하여 바늘을 두개골에 고정하고 접착제가 마를 때까지 기다립니다.

바늘 위의 돌출 부분을 잘라냅니다. 포도당 내성 검사를 시작하기 전에 포도당 3.75g과 증류수 15ml를 용해시켜 포도당 용액을 준비합니다. 실험 중 판독 값을 기록하기 위해 각 혈액 검사 사이에 적절한 간격으로 시간표를 설정하십시오.

다음으로, 단식 후 각 마우스의 무게를 측정하여 주사에 적합한 포도당량을 계산합니다. 그런 다음 작업대에서 타이머, 포도당 칩, 혈당계, 인슐린 주사기 및 면도날을 준비합니다. 혈당 수치를 측정하려면 먼저 새 포도당 칩을 혈당계에 삽입하고 시작 버튼을 눌러 0을 설정합니다.

그런 다음 목 뒤에서 마우스를 잡고 꼬리를 쓰다듬어 충분한 혈류를 확보합니다. 새 면도날을 사용하여 꼬리의 작은 조각을 잘라낸 다음 포도당 칩에 혈액 한 방울을 짜냅니다. 위내 세척 기술을 사용하여 마우스에 포도당을 공급하고 즉시 타이머를 시작합니다.

다른 시점에서 포도당을 측정합니다. 인슐린 내성 검사를 시작하려면 인간 인슐린 용액 0.25 단위를 준비하십시오. 그런 다음 금식 후 각 마우스의 무게를 측정하여 주사에 적합한 인슐린 양을 계산합니다.

다음으로, 실험 중 판독값을 기록할 시간표를 설정합니다. 마지막으로, 인슐린 주사 후 이전과 같이 혈당 수치를 측정합니다. 포도당 대사는 생쥐에게 포도당을 경구 투여한 후 수술 후 경구 포도당 내성 검사로 측정했습니다.

A-C-S-F 주입 또는 C-C-L-5 길항제를 주입한 마우스의 혈당 수치 변화가 기록되어 여기에 표시됩니다. 인슐린 감수성 검사도 실시하여 C-C-L-5 길항제를 주입한 마우스의 혈당 수치는 대조군 마우스에 비해 약간 감소했을 뿐이며, 이는 C-C-L-5로 처리한 마우스에서 말초 포도당 대사에 대한 인슐린 기능의 손상을 시사합니다. 인슐린 신호 활성화를 분석하기 위해 인슐린 수용체 기질 단백질 또는 I-R-S-1 인산화를 시상하부에서 평가했습니다.

C-C-L-5 길항제로 처리된 마우스에서 정상적으로 먹이를 먹었을 때 I-R-S-1 인산화는 대조군에 비해 상향 조절되었습니다. 인슐린 신호 활성화를 추가로 분석하기 위해 인슐린 다운스트림 신호 분자인 인산화세린 4-7-3 Akt의 수준도 평가했습니다. 그 후, 인슐린 챌린지 A-K-T 신호는 대조군 A-C-S-F 투여군의 마우스에서는 증가하였으나 C-C-L-5 길항제 투여군의 마우스에서는 증가하지 않았다.

일단 마스터가 미세 삼투압 펌프를 삽입하면 제대로 수행하면 30분 밖에 걸리지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안 마우스 머리가 약간 올라가고 척추가 정위 장치에서 똑바로 서 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 연구자에게 내분비학에서 설치류의 뇌에서 약물, 케모카인 또는 단백질 기능의 효과를 탐구할 수 있는 방법을 제공합니다.

이 절차에 따라 C-C-L-5 및 수용체 C-C-L-5가 음식 소화 및 대사 회로에 어떻게 참여하는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 바이러스의 뇌내 전달 또는 크리스퍼 9로 유전자 발현을 조작하는 것과 같은 추가 측정을 수행할 수 있습니다.