Name: Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 학습하세요 Dictyostelium discoideum의 급성 기계적 자극에 대한 세포 반응 평가 방법을. 형광 바이오센서 국소화 관찰과 전단류에 의한 단백질 활성화 테스트를 통해 세포 기계수용 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 부여 R35 GM118177 PND의 국가 학회에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24535823">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
<li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381519/">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2%2F3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
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저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 방법 인구와 개별 셀 동작 응답에서 전단 흐름을 평가 하는 편리한 방법을 제공 합니다. 중요 한 것은, 이전의 연구 선도 및 마이그레이션하는 동안 가장자리 마커를 후행의 지역화 분석 하는 동안 현재 접근 심하게 전단 흐름을 적용 하 여 즉각적인 효과의 조사를 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 우리는, 사실, 전단 흐름을 셀의 초기 응답 하지 않아도 셀 마이그레이션 시연 했다. 대신, 초기 전단 흐름 자극에 신속 하 고 과도 응답 전단 흐름, 유사 하 게 chemoattractant 그라데이션으로 본 초기 글로벌 응답에 장기간된 노출으로 본 방향 마이그레이션 보다 우선 합니다.
생화학 및 미세한 접근도 불구 하 고 각 방법에는 고유한 장점과 단점 보완 데이터 양보. 세포 세포의 용 해 및 PKBs, KrsB, 및 ERK, immunoblotting 자극은 예를 들어 셀의 전체 인구를 분석 하 고 따라서 개별 셀 동작 검사 분석 결과는 달리 셀 유사 평균. 그러나,...

진 핵 세포의 용 해 또는 기판 chemoattractants의 그라데이션, 기판, 전기 분야, 또는 전단 흐름의 가변 강성을 포함 한 환경에서 다양 한 화학 및 물리적 신호에 의해 바이어스 이다. 적은 감독된 마이그레이션 및 통합 된 생산 세포 수준에서 이러한 다양 한 신호는 통합 하는 방법의 다른 종류에 대해 알고 있다 비록 많은 발전 chemotaxis를 운전 하는 분자 메커니즘에 대 한 우리의 이해에 왔다, 철새 응답입니다.
지시는 chemoattractant의 증가 농도 쪽으로 이동 세 가지 행동 구성 요소를 포함: 운동 성, 방향 감지 및 극성1. 운동 성 세포 pseudopod 돌출에 의해 달성의 임의의 움직임을 말합니다. 방향 감지는 chemoattractant의 소스를 감지 하는 세포의 능력은에 발생할 수 있는 움직일 수 셀. 극성의 선도 운동에 증가 지 속성에 이르게 셀의 후행 가장자리 사이의 세포내 구성 요소 보다 안정적인 비대칭 분포를 나타냅니다.
chemoattractant에 세포질 응답 4 개념적 정의 규제 네트워크의 활동에 따라 달라 집니다: 수용 체 / G 단백질 신호 변환, 말라 골격, 극성1. Chemoattractant G 단백질 결합 된 수용 체에 바인딩 heterotrimeric G 단백질 α와 방향 신호를 증폭 하류 신호 전달 네트워크에 βγ를 통해 신호를 전송 합니다. 신호 전달 네트워크 내의 여러 경로 동시에 행동 하 고 바이어스 말라 합 하는 기온 변화도의 방향에 따른 pseudopod 돌출 말라 골격 네트워크에 피드. Chemotaxis의 중요 한 레 귤 레이 터 중 고 Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-키 (PI3K), 인산 가수분해 효소 그리고 tensin 동족 체 (PTEN) guanylyl 있고. 피드백 메커니즘 네트워크 내에서 신호 변환 및 신호 변환와 말라 골격 네트워크 추가 응답을 증폭. 마지막으로, 가난 하 게 정의 된 극성 네트워크 말라 골격에서 입력을 받습니다 그리고 더 그라데이션의 방향에 영구 이주를 촉진 하는 신호 변환 네트워크 편견.
많은 chemotaxis의 우리의 기계 이해 되었습니다 규제 네트워크의 다양 한 구성 요소에 대 한 태그 붙일 바이오 센서의 개발 때문에. 많은 chemotaxis 레 귤 레이 터는 비대칭 분포 규제 분자 자체 또는 그것의 활동 중 하나 있다. 예를 들어 바이오 센서 인식 하는 버전의 작은 GTPases Ras 및 Rap1-Raf1 (라고도 RBD 여기)의 Ras 바인딩 도메인 활성화 하 고 RalGDS, chemotaxing 셀2,3의 앞 가장자리에 각각-지역화. 마찬가지로, PI3K 및 그것의 제품 phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), pleckstrin 호몰로지 (PH) 도메인에서 인식 또한 셀4,5의 앞에 지역화를 표시. 반면, 3 인산 가수분해 효소 PTEN는 변환 PIP3 다시 phosphatidylinositol (4, 5)-bisphosphate, localizes6셀 후행 가장자리에. 중요 한 것은, 이러한 바이오 센서는 chemoattractant와 함께 글로벌 자극에 그들의 지 방화를 변경합니다. Cytosolic 또는 후행 가장자리 마커, 대뇌 피 질의 지역화 있고 결 석 한 반면 휴식 셀에 돌출부의 끝에는 피 질 relocalize 첨단 마커 휴식 셀에서 돌출 끝에서 후 cytosolic 될 자극입니다. 바이오 센서는 chemoattractant와 함께 글로벌 자극에 대 한 응답에서 분포의 분석 운동 성 및 극성, 자주 혼동은 관측의 기여를 최소화 합니다. chemoattractant와 셀 서 스 펜 션의 전역 또는 일정 한 자극은 단백질 활성화, 단백질 인 산화7,,89 자주 감지에 인구 전체의 변화를 평가 하는 도구로 사용 된다 . 이 생 화 확 적인 분석 결과 현미경 검사 법은 규제 네트워크의 다양 한 구성 요소 동작에 대 한 시간적, 공간 정보를 수집 하는 데 사용 됩니다 반면 시간적 정보를 얻기 위해 주로 사용 됩니다.
신호 전달 네트워크는 고르기가 시스템10,11의 기능을 통합합니다. 임계값 위에 혈 자극에 응답 "all-or-none"는 고 내 화물 기간을 표시 합니다. 응답 또한 확률론 촉발 하 고 진동 동작을 표시할 수 있습니다. 신호 변환 이벤트 파도12,13,,1415로 전파 하는 피 질 영역에 지역화 됩니다. 정면, 또는 다시, 마커, 채용 또는 전파 파도의 활성 영역에서 해리. 활성 영역을 후행 하는 내 화 지역 때문에 반대로 감독된 파도 그들은 나로 몰 살. 전파 신호 변환 파도 셀 마이그레이션10중재 셀룰러 돌출 기반이 됩니다.
대부분의 chemotaxis에 상기 정보 온 연구에서 사회적 아메바 Dictyostelium discoideum, 유사한 규제 메커니즘 중 성구 및 다른 포유류 세포 유형16 도 있지만 . Dictyostelium 는 단일 세포의 수천 집계 센터, 결국 포자를 포함 하는 다세포 fruiting 몸 형성으로 마이그레이션할 때 기아, 중 강력한 혈 응답을 가진 기초가 튼튼한 모델 생물. Chemotaxis 또한 세균 음식 소스를 찾기 위해이 유기 체의 단일 셀 성장 단계 필수적 이다. 중요 한 것은, 단일 Dictyostelium 세포의 이동은 현저 하 게 포유류 호 중구 또는 전이성 암 세포, 모두의 매우 빠른 amoeboid 형식 마이그레이션 받아야 마이그레이션 비슷합니다. 사실, 규제 네트워크의 두 전체 토폴로지 뿐만 아니라 개별 신호 변환 통로 chemotaxis에 참여의 많은 Dictyostelium 와 포유류 백혈구17사이 보존 됩니다. 게다가, 다른 세포, 섬유 아 세포 등 GPCRs; 대신 수용 체 티로신 kinases (RTK) 사용 그러나, RTKs는 비슷한 네트워크에 피드 수 있습니다.
Chemotaxis, 달리 감독된 이동의 다양 한 다른 모드 드라이브 신호 메커니즘의 철저 한 이해 부족 이다. 마찬가지로 셀 chemoattractant 그라데이션에 마이그레이션에 여러 연구 보고가 활성화 또는 일반적인 첨단 마커, 말라 합, PIP3 이나 extracellular 신호 통제 키 니 아 제 (ERK) 1/2의 지역화에는 전면의 셀 받고 전단 흐름 또는 전기 분야18,19,,2021에 변화에 대 한 응답에서 마이그레이션 지시. 그러나, 이러한 연구에는 자극에 지속적으로 노출 또한 귀착되 었 다 열어두고 질문, 예를 들어 첨단 마커는 자극에 응답에서 특히 지역화 여부 그들은 단순히 첨단에서 지역화 하는 경우 셀 마이그레이션 마이그레이션 셀의 앞에 pseudopods의 증가 수 때문에
우리는 우리가 심각한 기계적 섭 동 및 개별 셀22인구 수준에서 모두 전단 흐름으로 전달에 대 한 셀의 응답을 관찰할 수 있도록 분석 실험 개발. Chemoattractant, 급성 stimula와 글로벌 자극 비슷합니다기의 전단 흐름 운동 성 또는 극성에서 혼란 기여 없이 기계적 자극에 세포질 응답의 연구를 수 있습니다. 어떻게 기계적 자극에 대 한 인식 됩니다 배울 수 있습니다 이러한 생화학 및 현미경 분석 실험 유전 또는 약리학 섭 결합 및 전송. 또한,이 이렇게 또한 chemoattractant 수용 체는 chemoattractant, 따라서 수용 체/G에서 신호 변환 및 말라 골격 네트워크 격리의 부재에서의 다운스트림 시스템에 도청에 대 한 새로운 방법의 제공 한다 단백질 네트워크입니다.
최근 우리가 아래에 설명 된 기술을 사용 하 여 급성 전단 스트레스는 혈 신호 변환 및 말라 골격 네트워크22의 여러 구성 요소 활성화 리드 설명 했다. 다양 한으로 심각한 기계적인 자극을 적용 하 여 우리는, 유사 하 게 chemoattractants, 기계적 자극에 응답 또한 전시에서 응답의 all-or-none 동작을 포함 하 여 고르기가 시스템의 기능 시연 포화 상태 고 내 화물 기간의 존재. 마지막으로, 기계적, 화학적 자극을 결합 하 여 우리는 두 자극 신호 변환 및 말라 골격 네트워크, 바이어스 셀 마이그레이션 여러 자극의 통합 가능성이 허용 공유 보였다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>HL-5 배지 및 SM 플레이트를 준비하는 데 사용(1.1, 1.2 단계)</td></tr><tr><td>프로테오스 펩톤</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>HL-5 배지를 준비하는 데 사용(1.1단계)</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>HL-5 배지 및 SM 플레이트를 준비하는 데 사용(1.1, 1.2 단계)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>HL-5 매체 및 10X 인산염 완충액 준비에 사용(단계 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>HL-5 매체, SM 플레이트 및 10X 인산염 완충액을 준비하는 데 사용(단계 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>스트렙토마이신(디하이드로스트렙토마이신 설페이트)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>HL-5 매체를 준비하는 데 사용(단계 1.1)</td></tr><tr><td>펩톤(Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>SM 플레이트를 준비하는 데 사용(1.2단계)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>SM 플레이트를 준비하는 데 사용(1.2단계)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>SM 플레이트를 준비하는 데 사용(1.2단계)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>DB 버퍼를 준비하는 데 사용(1.4단계)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>DB 버퍼를 준비하는 데 사용 (1.4단계)</td></tr><tr><td>카페인</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>카페인을 준비하는 데 사용 (1.5단계)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)Fisher</td><td></td> <td>11-680-1100MG</td><td>cAMP를 준비하는 데 사용 (1.6단계)</td></tr><tr><td>엽산</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>엽산을 준비하는 데 사용 산 (단계 1.7)</td></tr><tr><td>트리스 염기</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>3X 샘플 버퍼 준비에 사용 (단계 1.8)</td></tr><tr><td>도데실황산나트륨 (SDS)Fisher</td><td></td> <td>BP166-500</td><td>3X 샘플 버퍼 준비에 사용 (단계 1.8)</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>3X 샘플 버퍼 준비에 사용 (단계 1.8)</td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>바이오 라</td><td>드 1610610</td><td>3X 샘플 버퍼 준비에 사용 (단계 1.8)</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>3X 샘플 버퍼를 준비하는 데 사용(단계 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제로 샘플 버퍼를 준비하는 데 사용(단계 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제를 사용하여 샘플 버퍼를 준비하는 데 사용(단계 1.8)</td></tr><tr><td>피로인산나트륨 십수화물</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제로 시료 완충액을 준비하는 데 사용(1.8단계)</td></tr><tr><td>완전한 EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제로 시료 완충액을 준비하는 데 사용(1.8단계)</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Latrunculin A를 준비하는 데 사용(1.9단계)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl 폴리아크릴아미드 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>면역 블로팅에 사용 (3.3단계)</td></tr><tr><td>폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>면역 블로팅에 사용 (3.3 단계)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) 토끼 항체</td><td>Cell Signaling</td><td>2060</td><td>면역 블로팅에 사용하기 위한 1차 항체 (3.3 단계)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) XP 항체</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>면역블로팅에 사용하기 위한 1차 항체(3.3단계)</td></tr><tr><td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab(당나귀에서)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>면역블로팅에 사용하기 위한 2차 항체(3.3단계)</td></tr><tr><td>향상된 화학발광 기질(Clarity Western ECL 기질)</td><td>면역블로팅에 Bio-Rad 1705060 사용(3.3단계)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트리핑 버퍼 (Restore Plus Western blot 스트리핑 버퍼)</td><td>피어싱</td><td>PI46430</td><td>면역 블로팅에 사용 (3.3 단계)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>면역 블로팅에 사용 (3.3 단계)</td></tr> <tr><td>K. aerogenes strain (비 병원성)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Materials and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker (모델 G-33 또는 유사한 대안)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>K. aerogenes를 성장시키고(2.1.1단계), D. discoideum세포를 염분화 및 자극하는 데 사용합니다(3단계). 이 셰이커의 회전 반경은 9.5mm입니다.</td></tr><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>SM 플레이트를 준비하는 데 사용(1.2단계)</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>D. discoideum 세포 계수에 사용(단계 2.1.2)</td></tr><tr><td>35mm 접시(Corning Falcon Easy-Grip 조직 배양 접시)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>기계적 자극을 위한 D. discoideum세포를 도금하는 데 사용한 후 세포 용해(단계 3.1.1)</td></tr><tr><td>폴리스티렌 컵(5mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>화학유인제로 D. discoideum 세포 현탁액을 자극하는 데 사용(3.2.2단계)</td></tr><tr><td>펌프가 있는 유체 장치(ibidi 펌프 시스템)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>채널의 D. discoideum 세포에 기계적 자극을 전달하는 데 사용(단계 4.1, 4.2 및 5)</td></tr><tr><td>채널로 슬라이드(&mu;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>유체 장치가 전달하는 기계적 자극을 위한 D. discoideum 세포를 플레이트하는 데 사용(단계 4.1, 4.2 및 5)</td></tr><tr><td>50 mL reservoirs (Fluidic Unit용 Ibidi Reservoir Holder)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>채널 내 D. discoideum 세포에 기계적 자극을 전달하기 위한 유체 장치를 설정하는 데 사용(단계 4.1, 4.2 및 5)</td></tr><tr><td>유체 장치용 라인(관류 세트 YELLOW-and-GREEN)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>채널의 D. discoideum 세포에 기계적 자극을 전달하기 위한 유체 장치를 설정하는 데 사용합니다(단계 4.1, 4.2 및 5). 참고: 1.6mm 튜빙(카탈로그 번호 10842)에서 두 라인을 절단할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>드레인 라인(1.6mm ID 튜빙)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>채널의 D. discoideum 세포에 기계적 자극을 전달하기 위한 유체 장치를 설정하는 데 사용합니다(단계 4.1, 4.2 및 5).</td></tr><tr><td>Zeiss Observer.Z1 도립 현미경은 40X/1.3 오일 대물렌즈와 20X/0.3 공기 대물렌즈 (또는 유사한 대안)가 장착되어 있습니다.</td> <td>Zeiss</td><td></td>는 <td>위상차 또는 형광 조명으로 D. discoideum 세포를 이미지화하는 데 사용됩니다(단계 4 및 5)</td></tr><tr><td>UltraView 회전 디스크 컨포칼 현미경은 40&times;/1.25&ndash; 0.75 oil objective (또는 유사한 대안)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>D. discoideum 세포를 이미지화하는 데 사용되는 대안 (step 4.1.4)</td></tr><tr>Eppendorf InjectMan <td>Eppendorf</td><td>5252000021D 및 5192000027</td><td>를 사용한 FemtoJet Microinjector (Eppendorf; 모델 5247 또는 유사한 대안)</td><td>마이크로피펫을 통해 D. discoideum 세포에 기계적 자극을 전달하는 데 사용합니다(단계 4.3). 참고: 카탈로그 번호는 최신 버전의 장비(4i)용입니다.</td></tr><tr><td>마이크로피펫(Femtotip; 1 &mu; m 외경, 0.5 &mu; m 내경 )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>마이크로피펫으로 D. discoideum 세포에 기계적 자극을 전달하는 데 사용 (step 4.3)</td></tr><tr><td>Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Use to fill micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)</td></tr><tr><td>1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)Fisher</td><td></td><td>12-565-472</td><td>마이크로피펫에 의해 전달되는 기계적 자극을 위해 D. discoideum 세포를 플레이팅하는 데 사용(단계 4.3.2)</td></tr><tr><td>8웰 챔버(Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>벌크 버퍼 추가에 의해 전달되는 기계적 자극을 위해 D. discoideum 세포를 플레이팅하는 데 사용(단계 4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Use to physical stimulation to mechanical stimulation response to mechanical stimulation (step 4.5)</td></tr><tr><td>Migration analysis software (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>세포 속도 및 지속성을 정량화하는 데 사용(5.4단계)</td></tr></tbody></table>

dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, 또는 chemoattractant의 그라디언트를 마이그레이션 마이그레이션 감독된의 최고의 이해 모드입니다. 연구 사회 아메바를 사용 하 여 Dictyostelium discoideum 공개 병렬 통로의 복잡 한 신호 전달 네트워크 chemoattractants에 대 한 응답을 증폭 하 고 한쪽으로 치우친된 걸 중 합 및에 pseudopod의 돌출은 기온 변화도의 방향입니다. 반면에, 전단 흐름 또는 전기 분야에 노출으로 인해 감독된 이동의 다른 종류를 운전 하는 분자 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. Chemotaxis의 많은 레 귤 레이 터에 선행 또는 후행 가장자리 마이그레이션 셀의 지역화 전시 뿐 아니라 지역화 또는 활성화는 chemoattractant와 함께 글로벌 자극 다음에 과도 변화를 보여. 감독된 이동의 다른 종류의 분자 메커니즘을 이해 하기 우리는 전단 흐름에 간단한 (2-5 s) 노출에 따라 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답의 시험을 허용 하는 방법 개발 했다. 이 자극 검사 개별 셀 동작을 붙일 표시 된 바이오 센서를 표현 하는 세포 이미징 하는 동안 채널에 전달할 수 있습니다. 또한, 세포 인구 lysed, 격판덮개 및 관심사의 단백질의 활성 버전을 인식 하는 항 체를 사용 하 여 immunoblotted에 자극 될 수 있습니다. 결합 하 여 두 분석 실험, 하나 변화 subcellular 지 방화 및 인 산화에 의해 활성화 하는 분자의 광범위를 검사할 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 우리가 심각한 기계적인 자극 혈 신호 변환 및 말라 골격 네트워크의 활성화를 유발 결정. 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답을 검사 하는 시작 이벤트 전단 흐름 유도 운동에 필요한 이해 중요 합니다. 이 접근은 또한 chemoattractant 수용 체의 혼동 영향 없이 혈 신호 전달 네트워크 연구는 도구를 제공 합니다.

심각한 기계적인 자극 chemotaxis 레 귤 레이 터의 시간 응답
D. discoideum 세포의 기계적 자극에 응답을 평가 하기 위해 부착 집계 유능한 세포 전단 흐름의 짧은 펄스에 노출 되었다. 집계 유능한 D. discoideum 세포 분 비 캠프, 이웃 세포에 의해 감지 될 수 있습니다. 극복 하기 위해-셀 신호의 기여, 셀 디 discoideum 에서 adenylyl 있고 억제을 따라서 캠프 분 비28방지 카페인 치료 했다. 실제로, 셀으로 미리 치료 카페인 ERK2, PKBR1의 매우 낮은 기저 활동 했 고 이러한 kinases 5 s 자극 전단 흐름 (그림 1A)와 다음의 주요 잔류물의 인 산화에 강력한 증가 ...

여기는 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답을 평가 하기 위한 방법에 설명 합니다. 현미경 기반 분석 결과에서 우리 전단 흐름 간략 한 자극에 따라 붙일 표시 된 바이오 센서의 지역화를 검사 합니다. 우리는 또한 화학적 심각한 기계적인 자극에 응답에 대 한 관심의 다양 한 단백질의 활성화를 테스트합니다.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

이 절차의 전반적인 목표는 간단한 기계적 섭동 후 세포 내 신호 전달 네트워크의 다양한 구성 요소의 활동을 검사하는 것입니다. 이 방법은 세포가 기계적 자극을 포함한 다양한 환경적 단서를 감지하고 방향성으로 이동하는 방법과 같은 세포 이동 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 반응에 대한 운동성이나 극성의 혼란스러운 기여 없이 기계적 자극에 대한 초기 반응을 검사할 수 있다는 것입니다.우리는 약간의 교반과 함께 전달된 화학유인제에 대한 부착 세포의 반응을 테스트했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었고 차량 제어로 자극된 세포의 강력한 반응을 발견했습니다. 먼저 항생제 없이 냉동 스톡에서 소량의 세포를 HL5 배지에 접종하여 Klebsiella aerogenes를 준비하고 하룻밤 동안 배양합니다. 클렙시엘라 에어로제네스(Klebsiella aerogenes) 박테리아가 있는 상태에서 딕티오스텔리움(Dictyostelium)이 성장하면 마크로피노솜(macropinosome)의 수가 감소하여 외부 자극에 대한 세포 반응성이 향상됩니다.박테리아가 준비되었을 때 딕티오스텔리움이 기하급수적으로 자라도록 실험 시간을 정합니다. 이러한 딕티오스텔륨 세포를 수집하고 혈구계를 사용하여 계수합니다. 그런 다음 100, 000 Dictyostelium 세포를 포함하는 260 마이크로 리터의 박테리아 현탁액을 SM 플레이트에 펴 바릅니다.또한 보험을 위해 Dictyostelium 세포가 두 배, 절반인 플레이트를 준비하십시오. 실온에서 하루 동안 자란 후 플레이트를 뒤집고 딕티오스텔리움 세포가 박테리아 잔디를 청소하기 시작할 때까지 플레이트를 계속 배양하지만 아직 응집은 시작되지 않았습니다. 그런 다음 플레이트에 5ml의 DB 버퍼를 추가하고 유리 스프레더를 사용하여 Dictyostelium을 긁어냅니다.셀과 용액을 50 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 옮긴 다음 5 밀리리터의 DB로 플레이트를 헹구고 50 밀리리터 튜브에 추가합니다. 필요한 경우 반복합니다. 딕티오스텔리움을 세척하려면 튜브에 DB를 최대 50ml까지 얹고 세포를 펠릿화한 다음 상층액을 흡인하여 버립니다.상등액이 투명해질 때까지 세포를 반복적으로 세척합니다. 마지막으로, DB 버퍼의 Dictyostelium을 밀리리터당 약 500만 개의 셀로 재현탁합니다. 먼저 200만 개의 응집 가능한 딕티오스텔륨을 2밀리리터의 DB가 있는 35mm 접시에 플레이트합니다. 각 시점에 대해 하나의 플레이트와 자극되지 않은 대조군을 준비합니다.실온에서 세포가 플레이트에 부착되도록 10분 동안 기다립니다. 그런 다음 1ml의 DB로 두 번 헹구어 플레이트에서 분리되지 않은 세포를 씻어냅니다. 플레이트에서 부착되지 않은 Dictyostelium이 제거되면 플레이트를 방해하지 않고 부착된 세포를 basolation buffer에서 30분 동안 배양합니다. 세포의 조기 자극을 방지하기 위해 30분 배양 동안 플레이트의 움직임을 피하는 것이 매우 중요합니다.이제 제어된 양의 기계적 자극을 가하려면 플레이트를 오비탈 셰이커로 개별적으로 옮기고 셰이커를 150rpm으로 5초 동안 실행합니다. 그런 다음 원하는 시간이 지나면 버퍼를 흡입하고 즉시 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 즉시 100마이크로리터의 샘플 버퍼에 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제를 추가하고 세포를 긁어냅니다.용해물을 1.5ml 튜브에 모으고 즉시 섭씨 95도에서 10분 동안 가열합니다. 용해물 분석을 진행하거나 저장을 위해 섭씨 영하 20도까지 옮깁니다. 식물 또는 응집 가능한 세포를 현탁시킨 후 약 600마이크로리터를 미세유체 챔버 슬라이드에 로드합니다.입구는 완전히 채워야 하므로 필요한 경우 버퍼로 마무리합니다. 세포가 10분 동안 부착되도록 합니다. 장치의 입력 라인을 15ml 저장소가 있는 전자 펌프에 연결합니다.펌프에 대한 소프트웨어 제어를 사용하여 밸브를 닫은 다음 저장소를 DB로 채웁니다. 이제 압력을 50mbar로 설정하고 펌프를 켭니다. 밸브를 클릭하여 열어 DB로 라인을 채우고 헹굽니다. 약 30초 동안 헹군 후 압력을 다시 0으로 돌린 다음 밸브를 닫습니다.그런 다음 슬라이드의 한쪽에 있는 세 개의 입구 중 하나에 라인을 연결합니다. 기포가 갇히지 않도록 하고 연결이 완료되면 슬라이드 쪽에 있는 다른 두 개의 흡입구를 덮습니다. 이제 배수구의 라인을 슬라이드 반대쪽의 단일 배출구까지 연결하여 설정을 완료합니다.그런 다음 형광 현미경의 명시야 또는 위상 조명 아래에서 20X 공기 대물렌즈로 채널을 보고 채널을 헹굽니다. 그런 다음 압력을 약 50mbar로 설정하고 밸브를 엽니다. 액체가 배수구에서 나오면 외부 압력을 0으로 낮추고 30초 정도 기다렸다가 밸브를 닫습니다.다음으로, 40X 오일 대물렌즈로 전환하고, 채널의 가장 넓은 부분에 초점을 맞추고, RFP 또는 GFP 조명으로 3초마다 이미지를 수집하도록 소프트웨어를 준비합니다. 밸브를 닫은 상태에서 압력을 원하는 값으로 설정합니다. 그런 다음 3초 간격으로 5개의 사전 자극 이미지를 획득합니다.다음으로, 밸브를 짧게 열어 자극을 전달합니다. 이제 45초 동안 최소 15개의 데이터 프레임을 더 수집합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 응답을 정량화합니다.먼저, 이전 섹션에서 설명한 대로 Dictyostelium으로 미세유체 슬라이드를 로드합니다. 이 실험에서는 두 개의 입력 라인을 준비합니다. 라인을 닫으려면 처리 용액을 운반하는 라인과 소프트웨어 제어 밸브를 운반하는 라인의 물리적 클램프를 사용하여 차량과 함께 DB 용액을 운반하는 라인을 닫으십시오.이제 두 줄을 적절한 용액으로 채우고, 완충제와 비히클만 단독으로 채우거나 억제제와 같은 치료제로 완충하십시오. 라인을 헹군 후 채널이 있는 슬라이드 측면에 있는 두 개의 입구에 연결하고 사용하지 않는 입구를 닫습니다. 그런 다음 배수관을 반대쪽 콘센트에 연결합니다.이제 앞에서 설명한 대로 버퍼 플러스 차량을 사용하여 슬라이드를 세척합니다. 그런 다음 채널을 트리트먼트로 채웁니다. 먼저 유량을 0밀리바로 줄입니다.다음으로, 밸브를 전환하고 약 15초 동안 처리제를 흐르게 한 다음 배양 타이밍을 시작합니다. 약 10분마다 약 15초 동안 세포 위에 신선한 처리 용액을 흘려 챔버의 산소 수준을 보충합니다. 부착 응집 가능 세포는 오비탈 쉐이커를 사용하여 5초의 전단 흐름에 노출되었습니다.딕티오스텔리움(Dictyostelium)은 기초 활동을 줄이기 위해 카페인으로 사전 처리되었습니다. 그 결과, PKBR1 및 ERK2의 기저 활성이 매우 낮았고 자극에 따라 이러한 키나아제의 주요 잔류물의 인산화가 크게 증가했습니다. 다양한 형광 표지된 바이오센서를 발현하는 응집 가능 세포에서 PIP3 또는 새로 중합된 액틴에 의해 모집된 두 개의 선행 에지 마커인 PHcrac 및 LimE는 모두 휴지 세포에서 대부분 세포질 국소화를 보여주었습니다.5초간의 전단 흐름 후, 이러한 바이오센서는 빠르게 피질로 재국소화되어 세포질로 되돌아갔습니다. 액틴 해중합 약물인 라트룬쿨린 A(Latrunculin A)의 효과는 유사한 전단력 실험을 사용하여 테스트되었습니다. 이 경우, 식물 세포는 먼저 제어 조건에 노출된 다음 원하는 테스트 에이전트가 포함된 버퍼로 전환되었습니다.라트룬쿨린(Latrunculin) A 처리는 피질에 대한 선행 가장자리 마커의 재국소화를 차단했습니다. 흥미롭게도, 흐름이 2초 후에 꺼지지 않고 실험 기간 동안 계속 켜져 있는 경우 일시적인 전체 반응이 여전히 관찰되었습니다. 전 세계적인 반응에 따라 식물 세포는 흐름을 거슬러 이동했습니다.세포의 적절한 준비는 이러한 분석의 성공을 위해 매우 중요합니다. 식물 세포는 기계적 자극에 대한 반응을 보장하기 위해 박테리아와 함께 성장해야 합니다. 응집 역량 세포의 경우, 과소 발달 또는 과도하게 발달한 세포는 잘 반응하지 않는 경향이 있습니다.생화학적 접근법과 미시적 접근법은 서로를 보완하며, 이를 통해 기계적 자극에 대한 반응에 대해 많은 수의 신호 전달 중간체를 평가할 수 있었습니다. 유전적 교란뿐만 아니라 약리학적인 교란을 추가함으로써 기계적 자극이 어떻게 인식되고 전달되는지 배울 수 있습니다. 이는 전단 흐름과 같은 물리적 자극에 의해 유도되는 유도된 세포 이동을 이해하는 데 중요합니다.기계적 자극은 화학유인제와 동일한 신호 전달 네트워크의 활성화를 유발하기 때문에 이제 세포에 대한 다양한 자극의 통합을 조사할 수 있습니다. 궁극적으로 이러한 연구는 우리 자신의 면역 세포 및 전이성 암 세포와 같은 이동 세포가 신체를 어떻게 탐색하는지 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

비정상적인 감각 기능 내장 고통 및 다른 증상 기능 및 염증 성 대 장 질환의 기초. 프로토콜에는 비보 전 쥐 colorectum 저 승 구심 성 신경의 electrophysiological 녹음에 대 한 여기에 제공 됩니다.

생체 외에서 쥐에 있는 저 승 구심 성 섬유의 Electrophysiological 속성의 특성

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

이 프로토콜의 목표는 Drosophila 애벌레에서 기계적 고치에 대한 향상된 분석법을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 우리는 기계적 과민성 (알로디니아 및 과민증)이 Drosophila 애벌레에 존재한다는 것을 보여주기 위하여 여기에서 분석기를 이용합니다.

드로소필라 애벌레의 기계적 고치절 측정을 위한 향상된 분석 및 도구

학습하세요 Dictyostelium discoideum의 급성 기계적 자극에 대한 세포 반응 평가 방법을. 형광 바이오센서 국소화 관찰과 전단류에 의한 단백질 활성화 테스트를 통해 세포 기계수용 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

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