코어-쉘 란타넘족 실수로 업 나노 세포 응용 프로그램의 합성

이 절차의 전반적인 목표는 고온 공동 침전 접근법을 기반으로 코어-쉘 란탄족이 도핑된 상향 변환 나노결정을 합성하고 추가 세포 응용을 가능하게 하는 생체 적합성 표면 변형을 수행하는 것입니다. 지난 몇 년 동안 우리 연구실은 매우 독특한 광학 특성을 나타내는 나노 결정의 매우 독특한 란탄족 도핑 상향 변환을 개발하여 장파장 적외선을 흡수하고 기본적으로 이 빛을 적외선 창에서도 볼 수 있는 UV를 포함하여 단파장 범위에서 다색 방출로 변환할 수 있습니다. 이러한 독특한 나노 결정 구조는 생물 의학 응용 분야에 매우 유망한 특성을 나타냈습니다.

이 방법은 근적외선 조명에서 광 게이트 막 채널 단백질 조절을 위한 코어-쉘 상향 변환 나노 구조 및 생체 적합성 표면 변형 기술을 합성하기 위한 실현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 절차를 시작하려면 메탄올에서 희토류 아세테이트 복합체의 원액을 준비합니다. 메탄올에 수산화나트륨과 불화암모늄의 밀리리터당 20mg을 준비합니다.

원액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 그런 다음 올레산 3ml와 1-옥타데센 7ml를 50ml, 3목, 둥근 바닥 플라스크에 피펫팅합니다. 여기에 이트륨 아세테이트 용액 1.089 밀리리터, 이테르븀 아세테이트 용액 0.608 밀리리터, 툴륨 아세테이트 용액 83.6 마이크로 리터, 네오디뮴 아세테이트 용액 128.5 마이크로 리터를 추가하십시오.

플라스크에 교반 막대와 온도계를 장착하십시오. 메탄올이 증발할 때까지 저어주면서 오일 배스에서 플라스크를 섭씨 100도까지 가열합니다. 그런 다음 플라스크를 Schlenk 라인에 연결하고 플라스크를 2-3분 동안 펌핑하여 잔류 메탄올을 제거합니다.

다음으로 플라스크를 질소 분위기 아래에 놓습니다. 반응 혼합물을 700rpm으로 교반하면서 섭씨 150도에서 1시간 동안 가열합니다. 그런 다음 혼합물을 실온으로 식히십시오.

다음으로, 15ml 원심분리기 튜브에 수산화나트륨 원액 2ml와 불화암모늄 원액 2.965ml를 넣습니다. 튜브를 단단히 덮고 수산화나트륨과 불화암모늄 혼합물을 5초 동안 와류로 섞습니다. 5분 동안 유리 피펫을 사용하여 저으면서 수산화나트륨-불화암모늄 혼합물을 반응 플라스크에 천천히 첨가합니다.

그런 다음 반응 혼합물을 섭씨 50도 이하로 가열합니다. 혼합물을 그 온도에서 30분 동안 유지합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 100도로 가열하여 메탄올을 증발시킵니다.

플라스크를 Schlenk 라인에 연결하고 진공 상태에서 2-3분 동안 잔류 메탄올을 제거합니다. 플라스크에 질소 가스를 채우고 반응 혼합물을 분당 5°C에서 290°C까지 가열합니다. 혼합물을 섭씨 290도 또는 그 이상에서 1.5시간 동안 유지합니다.

그런 다음 저어주면서 혼합물을 실온으로 식히십시오. 제품 혼합물을 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 30ml의 에탄올로 잔여물을 튜브에 헹굽니다.

혼합물을 실온에서 8분 동안 4, 000회 g으로 원심분리한다. 상등액을 버리고 2 분 동안 초음파 처리로 10 밀리리터의 헥산에 고체를 분산시킵니다. 분산액에 30ml의 에탄올을 첨가하고 동일한 조건에서 혼합물을 다시 원심분리한 후 상등액을 버립니다.

고체를 5ml의 헥산에 분산시키고 분산액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 어둠 속에서 808나노미터 레이저를 조사할 때 코어-쉘 UCN 용액의 상향 변환된 방출을 확인하십시오. DBCO 변형 UCN 준비를 시작하려면 준비된 코어 쉘 나노결정을 원심분리하여 30ml의 에탄올로 세척합니다.

상등액을 버리고 pH 4 수용액 10 밀리리터의 염산을 첨가한다. 혼합물을 30 분 동안 초음파 처리하여 고형물을 용해시킵니다. 혼합물을 유리병에 옮기고 2시간 동안 격렬하게 저어줍니다.

그런 다음 30 밀리리터 분량의 디 에틸 에테르 4 개로 혼합물을 씻으십시오. 에테르 분획을 결합하고 세척된 수성층을 따로 보관하십시오. 10ml의 탈이온수로 에테르 층에서 미량의 리간드가 없는 UCN을 회수하고 수성층을 결합합니다.

결합 된 수성 층에 20 밀리리터의 아세톤을 첨가하고 혼합물을 5 초 동안 와류로 가열합니다. 혼합물을 35, 000 시간 g 10 분 동안 원심 분리하십시오. 상등액을 버리고 침전물을 2 밀리리터의 탈 이온수에 용해시켜 리간드가없는 UCN 용액을 얻습니다.

다음으로, 200 밀리그램의 폴리 아크릴산을 20 밀리리터의 탈 이온수에 20 분 동안 초음파 처리하여 용해시킨다. 여기에 리간드가 없는 UCN 용액을 첨가하면서 격렬하게 저어줍니다. 수산화나트륨의 1몰 용액으로 혼합물 pH를 7.4로 조정합니다.

혼합물을 30 분 동안 초음파 처리하고 실온에서 24 시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 그런 다음, 혼합물을 35, 000 회 g에서 10 분 동안 원심 분리한다. 10ml의 탈이온수로 원심분리하여 고체를 4회 세척합니다.

세척된 고체를 8ml의 탈이온수에 분산시켜 1밀리리터당 10밀리그램의 폴리머 변형 UCN 용액을 얻습니다. 중합체 변경한 UCNs의 1 밀리그램을 35, 10 분 동안 000 시간 g 원심분리기. 나머지 용액은 섭씨 4도에서 보관하십시오.

건조 DMF의 1밀리리터 부분에서 원심분리로 고체를 세 번 세척합니다. 그런 다음 침전물을 200 마이크로 리터의 건조 DMF에 용해시킵니다. 이 용액에 HOBT 12.2mg, EDC 14mg, DBCO-amine 5mg, DIPEA 16마이크로리터를 추가합니다.

혼합물을 실온에서 24시간 동안 저어줍니다. 다음, 35, 000 시간 g.에서 10 분 동안 혼합물을 원심 분리하십시오. DMSO의 1밀리리터 부분에서 원심분리로 고체를 4번 세척합니다.

DBCO 변형 UCN을 0.2 밀리리터의 DMSO에 분산시키고 분산액을 섭씨 4도에서 보관합니다. 먼저 12웰 플레이트에 다섯 번째 HEK293 세포를 10배 파딩하고 세포를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로 원심분리 튜브에서 선택한 플라스미드 1마이크로그램과 100마이크로리터의 MEM에 2마이크로리터의 P3000 트랜스펙션제를 결합합니다.

다른 마이크로 원심분리기 튜브에서 1.5마이크로리터의 트랜스펙션 시약과 100마이크로리터의 MEM을 결합합니다. 두 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 혼합물을 결합하고 400마이크로리터의 저혈청 MEM을 첨가합니다.

다음으로, 무혈청 DMEM의 1ml 부분으로 배양된 세포를 두 번 세척합니다. 600마이크로리터 트랜스펙션 혼합물을 12웰 플레이트의 웰에 분배합니다. 세포를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다.

그런 다음 배지를 제거하고 1 밀리리터의 DMEM으로 세포를 두 번 씻습니다. DMEM에서 1ml의 테트라-아세틸화된 N-아지도아세틸-만노사민 용액을 웰 사이에 분배합니다. 세포를 섭씨 37도에서 이틀 동안 배양합니다.

그런 다음 하룻밤 동안 컨포칼 접시에서 세포를 세척하고 트립신화하고 재배양합니다. 다음으로, 배지를 DBCO-UCN의 밀리리터당 50밀리그램 용액 2마이크로리터를 포함하는 1밀리리터의 새로운 DMEM으로 교체합니다. 세포를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하고 DMEM으로 세포를 두 번 세척합니다.

흄 후드의 조명을 끄고 칼슘 이미징을 위해 세포에 적절한 디엔 완충 용액을 추가하고 어둠 속에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 무혈청 DMEM으로 세포를 세척합니다. 평방 센티미터당 0.8와트를 전달하는 808나노미터의 근적외선을 세포에 조사합니다.

세포가 20분 동안 방사선 조사될 때까지 5분간의 휴식과 5분간의 방사선 조사를 번갈아 가며 실시합니다. 컨포칼 현미경으로 세포를 이미지화합니다. 코어와 코어-쉘 UCN의 투과 전자 현미경은 약 5나노미터의 쉘 두께를 가진 구형 구조를 보여주었습니다.

고분해능 TEM은 고도로 결정화된 나노 구조와 일치하는 d-간격을 보여주었습니다. 표면 개질 후, UCN은 완충 용액으로 쉽게 분산되었습니다. 동적 광 산란은 수용액에서 DBCO-UCN의 유체역학적 직경이 약 96나노미터임을 나타냅니다.

PAA 및 DBCO 변형 UCN의 제타 전위는 음전하를 띤 표면을 나타내며, 이는 수성 완충액의 용해도 및 안정성과 일치합니다. 상향 변환된 방출 테스트에서 PAA 및 DBCO 변형 UCN은 808나노미터 광을 조사했을 때 기본 코어 쉘 UCN과 동일한 방출 패턴을 보였습니다. 광개폐 채널 단백질을 발현하는 아지드 표지 HEK293 세포를 사용하여 DBCO-UCN의 생체 응용을 테스트했습니다.

아지드 태그에서 UCN의 국소화는 DBCO 그룹이 아지드 함유 염료로 염색되었기 때문입니다. 이러한 세포가 근적외선에 노출되었을 때 DBCO-UCN은 형광 칼슘 지시약을 사용한 컨포칼 이미징 및 유세포 분석에서 볼 수 있듯이 세포막을 가로지르는 칼슘 이온의 흐름을 촉진했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 이 절차에 따라 생체 적합성 표면 변형을 통해 코어-쉘 상향 변환 나노결정을 준비하는 방법과 살아있는 세포에서 광의존성 이온 채널을 활성화하기 위한 추가 바이오 응용 분야에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.