Name: 기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 배우세요 인간 심근의 세포외기질을 이용해 하이드로겔을 제조하고 세포 기반 분석에서 기질 효과를 연구하는 방법을. 이 기술은 심장 재생 연구에 필수적인 생존 신호를 제공합니다.

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연구 프로토콜 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 합니다. 환자는 연구 목적, 조직의 사용에 대 한 동의 제공 하 고 조직의 컬렉션 과정 기관 검토 위원회의 Charité-Universitätsmedizin 베를린 (EA4/028/12)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

연구 프로토콜은 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 하 고 Charité 의과대학의 제도적 검토 보드 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 제공 하는 모든 환자, 실험 연구에 대 한 심 혼 직물의 사용에 대 한 동의 작성.
1입니다. 단면에 대 한 인간의 심근의 준비
<ol><li>왼쪽된 심 실 심근을 얻기 (크기는 수술의 종류에 따라 다릅니다) 수술 실 무 균 용기에 차가운 PBS의 교통에서 직접.</li>
	<li>무 균 조건 하에서 10 번 블레이드와 살 균 메스와 모든 지방 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>약 1 x 1 x 1 cm의 메스를 사용 하 여 큐브에서 심근을 잘라.</li>
	<li>살 균 50 mL 튜브에 큐브를 놓습니다. 참고: 일시 중지, 수행 단계 1.5, 그렇지 않으면 계속 단계 2.2. 단백질 저하와 조직 품질 저하를 방지 하기 위해 반복된 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.</li>
	<li>-80 ° c.에 큐브를 포함 하는 튜브를 저장 조직 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 조각으로 심근 큐브의 단면
<ol><li>냉동 실에서 준비 큐브를 포함 하는 tube(s)를 가져가 라.</li>
	<li>cryostat 얼음에 전송 합니다.</li>
	<li>개체와 챔버 온도-15 ° c.를 설정 참고: 적당 한 온도 완벽 한 단면을 보장 하기 위해 중요 한.</li>
	<li>진정 빈 50 mL 튜브와 우표 챔버 또는 드라이 아이스.</li>
	<li>레이어를 추가 (약 0.5-1.0 mL) 차가운 스탬프 및 하자에 cryosection 매체의 그것 백색 이며 단단한 때까지 동결.</li>
	<li>Cryosection 매체의 두 번째 레이어를 추가 하 고이 계층에 심근 큐브를 놓습니다.</li>
	<li>Cryosection 매체와 심근 계속 하기 전에 완전 하 게 고정 되어 있는지 확인 합니다. 참고: 샘플 및 cryosection 매체 동결 되지는 구분 될 것입니다 장애인. 완전히 언된 cryosection 매체에서으로 바뀝니다 유연 하 고 투명 한 고체, 백색, 그리고 불투명. 심근 큐브 완전히 동결 단계 1.4에서에서 즉시 계속 하는 경우 h 1까지 적어도 30 분 필요 합니다. 조직 고정 면 핀셋으로 감동/처리 하지 변형 한다.</li>
	<li>홀더에 냉동된 심근으로 스탬프를 삽입 하 고 모든 나사를 조입니다.</li>
	<li>심지어 단면 표면 얻을 때까지 조직의 표면 손질.</li>
	<li>300 µ m 두께 단면 설정 합니다.</li>
	<li>자동 구분 된 섹션 냉동된 심근입니다. 이 유니폼 컷된 섹션을 보장합니다. 약 30-40 섹션 한 큐브의 슬라이스 수 있다.</li>
	<li>Precooled 50 mL 튜브에 느슨하게 단면 후 각 슬라이스를 놓습니다. 참고: 누르지 마십시오 조각 또는 팩 단단히. 약 40 조각 1 개의 관에 들어갈 수 있습니다.</li>
	<li>채워진된 튜브를 닫고 얼음에. 참고: 단계에 서 일시 중지 단계 3.2 계속 2.14, 그렇지 않으면.</li>
	<li>-80 ° c.에 게 심근 조각 슬라이스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 인간의 심근 조각 decellularization
<ol><li>-80 ° C 냉장고와 얼음에 전송 심근 섹션을 포함 하는 50 mL 튜브의 필요한 수를 가져가 라.</li>
	<li>한 메 마른 비 커에 단계 3.1에서에서 모든 50 mL 튜브의 냉동된 섹션을 전송. 약 40 조각은 비 커 50ml 튜브 당에 추가 됩니다. 비 커 세 번 50 mL 튜브;의 볼륨 해야 합니다. 예를 들어, decellularization 한 50 mL 튜브에 대 한 150 mL 비 커를 사용 합니다.</li>
	<li>50 mL 50 mL 튜브 심근 조각 당 세포 솔루션 (10 mM Tris, 0.1 w/v %EDTA, pH 7.4 H2O)를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 2 h에 대 한 지속적으로 100-150 rpm에서 메 마른 비 커에 흔들어 심근 조각.</li>
	<li>거친 스 트레이너를 통해 조직의 조각으로 액체를 스트레인. 새로운 살 균 비 커에 무딘 족집게와 조직 조각을 전송 합니다. PBS에서 심근 조각 (예를 들어, 사용 100 mL SDS 솔루션 두 50 mL 튜브 심근 섹션의 decellularized 되는 때)의 초기 50 mL 튜브 당 0.5 %SDS 50 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 100-150 rpm에서 6 h에 대 한 지속적으로 흔들.</li>
	<li>거친 스 트레이너를 통해 조직의 조각으로 액체를 스트레인. 새로운 살 균 비 커에 무딘 족집게와 조직 조각을 전송 하 고 150 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 각 50 mL PBS로 3 회 세척. 다음, 1% 페니실린/스와 1 %PBS 하룻밤 씻어 Nystatin (PBS-P/S-N) 100-150 rpm, 4 ° C 동요 하는 동안에. 참고: 철저 한 세척은 완전히 제거 하는 어떤 잔여 SDS 중요 합니다. SDS의 남은 흔적 ECM 셀과 함께에서 사용 될 때 독성이 있다.</li>
	<li>세척 솔루션 제거 및 추가 25 mL 1% 페니실린/스와 1 %FBS (37 ° C)를 미리 데워 Nystatin 심근 조각의 초기 50 mL 튜브 당 decellularized 조각에.</li>
	<li>37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어 이 단계에서는 모든 나머지 DNA는 FBS의 본질적인 DNase 활동으로 인해 매트릭스에서 제거 됩니다.</li>
	<li>새로운 살 균 비 커에 슬라이스를 전송 하 고 150 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 각 50 mL PBS로 3 회 세척. 참고: ECM 조각은 저장할 수 있습니다 PBS-P/S-n에서 4 ° C에서 몇 일 동안. 그러나, 즉시 진행 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 처리 한 분말 Decellularized cECM
<ol><li>새로운 살 균 6 잘 플레이트에 느슨하게 ECM 슬라이스를 놓습니다. -80 ° C에 ECM을 고정 하 고는 lyophilizer에서 2 일 동안 lyophilize. 참고: 둘 이상의 슬라이스는 잘 당 놓일 수 있다. 우물의 표면 표지에 분할 영역을 정렬 합니다. 겹치는 슬라이스 후속 분쇄 성공에는 영향이 없습니다.</li>
	<li>ECM 조각 분쇄에 대 한 사용 하 여 특정 밀링 ( 재료의 표참조) 포함 1.4 m m 세라믹 구슬 튜브합니다. 무딘 멸 균 핀셋을 사용 하 여 동결 건조 된 ECM으로 느슨하게 튜브를 채우십시오. 최적의 결과 대 한 10-20 밀리 그램 사이 ECM의 총 무게는 것이 좋습니다. 참고: ECM 밀링 튜브에 너무 밀접 하 게 포장 하는 경우 분쇄 과정은 부정적인 영향을.</li>
	<li>스냅-동결 튜브에 액체 질소. 주의:: 액체 질소는 매우 낮은 온도, 적절 한 개인 보호를 착용.</li>
	<li>
밀링 기계에 냉동된 튜브를 삽입 하 고 ECM을 격파.
	<ol>
<li>30의 기간 설정 s와 최대 속도 장치 시작.</li>
		<li>마친 후, 튜브를 꺼내와 스냅-동결 다시 액체 질소.</li>
		<li>5 회 반복 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL ddH2O 당 관 및 쉐이크 또는 완전 한 solubilizing 대 한 소용돌이 추가 하 여 튜브에서 미를 씻어. 50 mL 튜브에 200 µ m 메쉬를 통해 이기종 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>-80 ° C 또는 액체 질소에 튜브를 고정 합니다.</li>
	<li>튜브의 표준 뚜껑을 0.22 μ m 필터 바꿉니다. 이 필터 뚜껑 튜브에서 흐르는 분말을 방지 하지만 물 증발에 대 한 공기 순환을 허용 한다.</li>
	<li>lyophilizer에 튜브를 삽입 하 고 다시 단계 (단계 4.5)에서 물을 제거 하 lyophilize 참고:이 단계에서 동결은 최대 3 일 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>추가 처리까지-80 ° C에서 분말을 저장 하거나 단계 5.1 계속.</li>
</ol>5. 효소 기반 Homogenizing cECM 마이크로 입자의
<ol><li>1 mg/mL의 농도를 0.01 M HCl (pH 2.0)에 돼지 펩 신을 디졸브. 완전히 용 해 될 때까지 실 온에서 회전 통에 놓습니다.</li>
	<li>10 mg/mL의 최종 농도에 펩 신 솔루션에서 동결 건조 된 인간의 ECM 분말 (단계 4.8)을 분해. Pipetting 통해 철저 하 게 혼합. 총 볼륨 필요한 ECM 솔루션의 금액에 따라 달라 집니다. 예를 들어 10mg 1 mL 펩 신 솔루션에서 ECM 분말의 분해. 참고: 입자를 녹이는 부드러운 vortexing (1000-1500 RPM)를 통해 지원 수 있습니다. 미의 덩어리를 나머지 소화에 부정적인 영향을 줍니다.</li>
	<li>솔루션 2 mL 튜브 튜브 당 1 mL의 볼륨을 전송.</li>
	<li>48 h 27 ° C에서와 1200 rpm에 대 한 튜브 통에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>뿌리에서 튜브를가지고 고 얼음 또는 사전 냉각된 튜브 홀더에 놓습니다.</li>
	<li>믹스 1/9 ECM 솔루션의 볼륨의 콜드 10 x PBS (pH 7.4) 감기 0.1 m M의 ECM 솔루션의 볼륨의 1/10의 NaOH는 precooled와 얼음에 장소. 이 혼합 소화 ECM 솔루션을 무력화 하 고 irreversibly는 펩 신을 비활성화 합니다.</li>
	<li>중립화 혼합물 및 pipetting 또는 vortexing를 통해 철저 하 게 혼합에 ECM 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>1 x PBS (pH 7.4)와 원하는 농도에 ECM을 설정 합니다. 솔루션의 산도 pH 종이 함께 확인할 수 있습니다. 참고: 10 mL에 대 한 예제 계산 소화 ECM 솔루션: 10 ml HCl (pH 2.0) 10mg 돼지 펩 신을 추가 합니다. 펩 신 솔루션 100 mg ECM 파우더를 추가 합니다. 참고: 10 mL를 중화에 대 한 예제 계산 소화 ECM 솔루션 및 8 mg/ml 농도 설정: 집최종 c시작 x Vol시작 = / c최종 10 mg/mL x 10 mL/8 mg/mL = = 12.5 mL 권10xPBS 권시작 = / 9 = 1/9 10 mL = 1.11 10 x PBS에서 집NaOH = 집시작 / 10 = 1/10 10 mL = 1 mL에서 권1xPBS 권최종 -집시작 -집10xPBS -집NaOH = = 12.5 mL-10 mL-.11 1 mL = 0.39 mL</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

다음을 달성 하는 목표는 인간의 심근 ECM를 준비할 때: 관련 된 면역성 세포 소재, ECM 무결성 및 bioactivity, 불 임, GMP 공정 호환성, 최종 제품의 비 독성의 보존의 제거 및 처리 측면에서 특정된 응용 프로그램에 대 한 제품의 적합성. 미 또는 자가 조립 히드로 처리 된 우리의 3 단계 decellularization 프로토콜을 결합 하 여 인간의 심장 ECM 소재 얻은 특정 생물 학적 활동을 보유 하 고, 처리 하 고, 쉽게에 대 한 가능성이 있다 여러 응용 프로그램에서 체 외에서 고 vivo에서, 무슨 보였다 ECM 제품에 대 한 여러 동물 종11,13,,2021에서 비슷합니다.
심근 직물의 초...

세포 외 기질 (ECM) 뿐만 아니라 구조 지원 하지만 생물 학적 세포에 대 한 중요 및 조직 기능1을 제공 합니다. 에, ECM 등 섬유 증, 염증, 신생, cardiomyocyte 수축 기능 및 생존 능력, 주민 조상 세포 운명 pathophysiologic 응답의 규칙에 참여합니다. 그것의 기본 구성 요소-섬유 glycoproteins, 있다, proteoglycans-분 비 성장 인자, cytokines, 및 포함 하는 핵 산 및 단백질2,3막 소포를 포함 합니다.
그것은 최근에 분명 acellular ECM 준비 하지만 공부 뿐만 아니라 잠재적인 치료 셀 기반 응용 프로그램에 대 한 세포-매트릭스 상호 작용에 대 한 귀중 한 되고있다. 치료 셀 제품 또는 설계 조직에 적절 한 환경을 제공의 중요성은 이제 널리 인정 했다. 정의 된 biopolymeric hydrogels4,,56 또는 단백질 칵테일 murine 육 종 세포 (즉, Matrigel, Geltrex)에 의해 분 비 세포 현 탁 액 또는 활성 화합물을 결합 하려는 시도가 되었습니다. 그러나 7., 전 bioactivity 제한, 후자는 GMP 급 프로세스에 문제가 및 둘 다 부족 심장 ECM (cECM)8,,910, 의 조직-특정 bioactivity 11,,1213.
심근의 decellularization 이전 관상 맥 관 구조14,15통해 전체 심장의 관류에 의해 수행 되었습니다. 그러나이 동물 마음에 가능한, 그대로 인간 심 혼 거의 사용할 수 있습니다. 따라서, 수술 실에서 얻은 조직 샘플 처리에 대 한 허용 하는 집중 과정 선호 했다. 우리의 "3 단계" 프로토콜 포함 되어 있습니다 3 별도 인큐베이션 단계 즉 세포, 가용 화, 및 DNA 제거. 그것은 크게 보존된 단백질과 glycosaminoglycan 구성16,17와 인간 심근 ECM을 생성합니다. 이러한 cECM 슬라이스 체 외에서 세포-매트릭스 상호 작용의 연구에 대 한 허용 하지만 제대로 잠재적인 인간 규모 치료 응용 프로그램에 적합. 제조 프로세스는 동결 건조 된 cECM 미 또는 cECM 하이드로 겔18다음 확장 되었다.
이 프로토콜은 심근 세포 외 기질 (ECM) 및 그들의 생물 학적 활동의 주요 구성 요소를 보존 하는 수술 샘플에서 얻은 인간 심근의 decellularization에 대 한 수 있습니다. 보존된 조직-특정 bioactivity와 인간의 심장 ECM는 세포-매트릭스 상호 작용의 실험 연구에 필요한 또는 심근 재생 세포 기반 접근 방법에 대 한 적합 한 환경이 필요한 경우,이 프로토콜에 것이 좋습니다. 원칙적으로, 그것은 또한이 프로토콜 GMP 급 조건에 적응할 수 있도록 처리 된 cECM의 사용 가능한 미래에 치료 응용 해야.

<table><tbody><tr><td>Balance</td><td>DR Precisa, Dietikon, Switzerland</td><td>Precisa XR 205SM</td><td></td></tr><tr><td>Blades Nr.10 Skalpell Nr.3</td><td>InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany</td><td>SK-10-004</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates (6-well)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>8043.3</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td><td>616201, 623201</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15ml, 50ml</td><td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td><td>188271, 227270</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biochrome, Berlin, Germany</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Dry System</td><td>Labconco, 캔자스시티, 미국</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>냉동고 (-80&deg; C)</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Forma 900 Series</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>281.1</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Blades Type 819</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Minilys Homogeniser</td><td>PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany</td><td>91-PCSM</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>K021.1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td><td>P06-07800</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>P6887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Precellys Keramik-Kit 1.4 mm</td><td>Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, 독일</td><td>91-PCS-CK14</td><td></td></tr><tr><td>Rotamax 120 플레이트 셰이커</td><td>Heidolph, Schwabach, Germany</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22 &micro; m</td><td>Merck Millipore, 다름슈타트, 독일</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>스튜어트 아날로그 로커 및 롤러 믹서</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>Z675113-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T compound</td><td>Hartenstein, Wurzburg, Germany</td><td>TTEK</td><td></td></tr><tr><td>Transfusion set 200&micro; m</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Germany</td><td>798.200.500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>5429.3</td><td></td></tr><tr><td>vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm</td><td>Medical Highlights, Rohrdorf, Germany</td><td>CV102-003</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie2</td><td>Scientific Industry, New York, Germany</td><td>SI-0256</td><td></td></tr></tbody></table>

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular 기질 준비 세포-매트릭스 상호 작용을 공부 하는 데 유용 하 고 재생 세포 치료 응용 프로그램을 용이 하 게. 여러 상업 기질 제품 hydrogels 또는 막, 사용할 수 있지만 이러한 조직 관련 생물 활성을가지고 있지 않습니다. 불가능 하기 때문에 관류 decellularization 일반적으로 인간의 심장 조직으로, 우리는 3 단계 집중 decellularization 프로세스를 개발 했다. 인간의 심근 조각 수술 중 조달 먼저 세제 무료 hyperosmolar 세포의 용 해 버퍼, 이온 세제, 나트륨 라우릴 황산 염와 부 화 다음으로 취급 되 고 과정의 본질적인 DNase 활동을 이용 하 여 완료 되 면 태아 둔감 한 혈 청입니다. 이 기술은 결과 심장 세포 외 매트릭스의 셀 무료 시트에 주로 섬유 조직 아키텍처 biopolymer 구성 유지는 심장 세포 인구를 pluripotent 줄기 특정 환경 단서를 제공 하기 위해 표시 했다 셀입니다. 심장 세포 외 기질 시트 다음 추가 추가 화학 수정 없이 microparticle 분말으로 처리 하거나 수, 단기 펩 신 소화를 통해와 자가 조립 심장 세포 외 기질 히드로로 보존 bioactivity입니다.

인간의 심근의 decellularization에 대 한 3 단계 프로토콜 여기 키 ECM 구성 요소와 ECM의 원 구조를 유지 하면서 세포 소재의 가까운 완전 한 제거 결과 제시. Decellularization, 후 조직에서 세포의 총 제거 색깔 (그림 1A)에 있는 변화에 의해 분명 하다. H &amp; E와 Masson Trichrome 얼룩으로 조직학 분석 잔여 그대로 셀 (그림 1B)의 완전 한 부재를 공개 했다. ECM의 개별 구성 요소에 대 한 양적 분석 SDS 혼자 (그림 2A)에 의해 decellularization에 비해 서 더 완전 한 DNA 제거 및 총 콜라겐, 엘라 스 틴, 및 있다의 더 나은 보존을 공개 했다. CECM의 생물 학적 활동의 기능 증거는 <strong class="xfig"...

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

이 절차의 전반적인 목표는 심장 세포외 기질을 하이드로겔로 처리하여 다양한 세포 기반 분석에서 기질의 효과를 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 세포외 기질이 세포 행동에 미치는 영향과 같은 심장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외 또는 생체 내에서 대규모 실험을 수행하기 위해 세포 외 기질의 사용을 용이하게 한다는 것입니다.이 기술의 적용은 매트릭스가 필수적인 생존 신호를 제공할 수 있기 때문에 심근 경색 치료법으로 확장될 수 있습니다. 실험을 시작하려면 숫자 10 날이 있는 멸균 메스를 사용하여 이전에 얻은 좌심실 심근에서 지방 조직을 제거합니다. 메스를 사용하여 심근을 약 1 x 1 x 1cm 입방체로 자릅니다.다음으로, 큐브를 멸균된 50mL 튜브에 넣습니다. 큐브가 들어 있는 튜브를 섭씨 80도에서 보관하십시오. 준비된 큐브가 들어 있는 튜브를 냉동실에서 꺼내 얼음에 담아 저온 유지 장치로 운반합니다.저온 유지 장치의 물체와 챔버 온도를 섭씨 15도로 설정합니다. 챔버의 빈 50mL 튜브와 스탬프를 식힙니다. 콜드 스탬프에 극저온 절편 매체 층을 추가하고 하얗고 단단해질 때까지 얼립니다.두 번째 층의 극저온 절편 매체를 추가하고 두 번째 층에 심근 튜브를 놓습니다. 극저온 절편 매체와 심근이 완전히 얼었는지 확인하십시오. 그런 다음 얼어붙은 심근이 있는 스탬프를 홀더에 삽입하고 모든 나사를 조입니다.균일한 단면 표면이 얻어질 때까지 조직 표면을 다듬습니다. 균일한 절단 단면을 보장하기 위해 자동 절단으로 동결된 심근을 절단합니다. 하나의 큐브에서 약 30-40개의 섹션을 슬라이스할 수 있습니다.절편 후 각 슬라이스를 예냉각된 50mL 튜브에 느슨하게 놓습니다. 채워진 튜브를 닫고 얼음 위에 놓습니다. 모든 50 mL 튜브의 동결 섹션을 하나의 멸균 비커로 옮깁니다.심근 절편을 포함하는 50mL 튜브당 50mL의 용해 용액을 추가합니다. 다음으로, 멸균 비커에서 심근 조각을 흔듭니다. 거친 체를 통해 조직 조각으로 액체를 걸러냅니다.그런 다음 뭉툭한 핀셋으로 조직 조각을 새 멸균 비커로 옮깁니다. 심근 절편의 초기 50mL 튜브당 PBS에 0.5%SDS 50mL를 추가합니다. 실온에서 100-150rpm으로 6시간 동안 비커를 계속 흔듭니다.흔든 후 거친 체를 통해 조직 조각으로 액체를 걸러냅니다. 뭉툭한 핀셋을 사용하여 티슈 조각을 새 멸균 비커로 옮기고 50mL의 PBS로 조각을 세 번 씻습니다. 다음으로, 1%의 페니실린 스트렙토마이신과 1%의 니스타틴을 함유한 PBS에서 밤새 조각을 씻습니다.다음날, 세척액을 제거하고 1% 페니실린 스트렙토마이신과 1% 니스타틴으로 섭씨 37도로 예열된 FBS 25mL를 심근 슬라이스의 초기 50mL 튜브당 탈세포화된 슬라이스에 추가합니다. 기질에서 남아있는 DNA를 제거하기 위해 섭씨 37도에서 3시간 동안 절편을 배양합니다. 그런 다음 슬라이스를 새 멸균 비커로 옮기고 50mL의 PBS로 세 번 세척합니다.ECM 슬라이스를 새로운 멸균 6웰 플레이트에 느슨하게 놓습니다. ECM을 섭씨 80도에서 동결하고 동결 건조에서 2일 동안 동결 건조합니다. ECM 슬라이스를 분쇄하려면 1.4mm 세라믹 비드가 들어있는 밀링 튜브를 사용하십시오.멸균되고 뭉툭한 핀셋을 사용하여 동결건조된 ECM으로 튜브를 느슨하게 채웁니다. 튜브를 액체 질소로 스냅 동결합니다. 얼어붙은 튜브를 밀링 머신에 삽입하고 ECM을 분쇄합니다.지속 시간을 30초로 설정하고 최대 속도를 조정한 다음 장치를 시작합니다. 분쇄 후 튜브를 꺼내 액체 질소로 다시 동결합니다. 튜브당 ddH20 1mL를 첨가하여 튜브에서 미립자를 세척하고 흔들어 완전한 가용화를 위해 만듭니다.그런 다음 200마이크로미터 메쉬를 통해 이종 용액을 50mL 튜브에 여과합니다. 튜브를 액체 질소로 얼립니다. 튜브의 표준 뚜껑을 0.22마이크로미터 필터로 교체하여 분말이 튜브 밖으로 흘러나오는 것을 방지합니다.동결 건조기에 튜브를 삽입하고 다시 동결 건조하여 세척 단계에서 물을 제거합니다. 이전에 제조된 동결건조된 인간 ECM 분말을 펩신 용액에 용해시켜 최종 농도 10mg/mL로 만듭니다. 용액을 튜브당 1mL 용량의 2mL 튜브로 옮깁니다.용액을 피펫으로 넣어 완전히 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 셰이커에 넣고 섭씨 27도에서 48시간 동안 1200rpm으로 흔듭니다. 셰이커에서 튜브를 꺼내 얼음이나 미리 냉각된 튜브 홀더에 놓습니다.예냉된 튜브에 차가운 10X PBS의 ECM 용액 부피의 1/9과 차가운 0.1몰 수산화나트륨의 ECM 용액 1/10을 혼합하고 얼음에 올려 소화된 ECM 용액을 중화하고 펩신을 비활성화합니다. 마지막으로, ECM 용액을 중화 혼합물에 첨가하고 피펫팅 또는 볼텍싱을 통해 철저히 혼합합니다. 개별 ECM 성분에 대한 정량적 분석은 SDS 단독에 의한 탈세포화에 비해 총 콜라겐, 엘라스틴 및 글리코소미노글리칸의 더 완전한 DNA 제거와 더 나은 보존을 보여주었습니다.RT-PCR은 자발적 분화를 겪는 Murine ESC에서 구조적 심근세포 단백질, 초기 및 후기 심근생성 전사 인자 및 내피 세포 표면 마커 유전자의 발현을 정량화하는 데 사용되었습니다. cECM과의 접촉은 만능 줄기세포를 유도하며, 가급적이면 표현형과 같은 심근세포로 유도합니다. 위상차 광학 현미경 검사는 48시간 동안 cECM의 효소 분해가 보다 균질화된 ECM 용액을 생성한다는 것을 보여줍니다.cECM 하이드로겔에서 인간 심장 섬유아세포의 살아있는/죽은 염색은 생존력이 증가된 것을 보여줍니다. cECM 미세입자와 cECM 하이드로겔은 모두 표준 배양의 세포와 비교하여 허혈성 상태에서 수축성 HL-1 세포의 대사 활성을 향상시킵니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 조직에서 하이드로겔까지 일주일 이내에 완료할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 심장 재생 분야의 연구자들이 체외 및 생체 내 모델 시스템에서 심장 세포 외 기질의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

processing-human-cardiac-tissue-toward-extracellular-matrix-self

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

decellularized 조직에서 주사용 매트릭스 젤을 준비하고 밀고 myocardium에 주입을위한...

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

우리는 신생아 cardiomyocytes 및 조직 공학을위한 섬유소의 히드로겔 구조의 캡슐에 대한 세포의 준비의 절연을 설명합니다. 우리는 전기 자극 및 세포 생존과 immunohistological 얼룩에 따라 생성되는 활성 강제를 포함하여 문화 시대 이후 조직 공학 m​​yocardium을 분석하는 방법을 설명합니다.

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)이 심근를 - 유래에서 여기, 우리는 인간의 조작 된 심장 조직의 생성을 보여줍니다. 우리는 HERG 채널 저해제 인 E-4031에 의해 수축력과 수축 패턴의 예시적인 변화를 분석하는 방법을 제시한다. 이 방법은 심장 약물 스크리닝 견고성과 높은 수준의 적합성을 나타낸다.

심장 약물 안전 검사를위한 인간 공학 심장 조직의 자동 수축 분석

이 메서드는 decellularization의 삼투성 충격 및 최소한의 기관 매트릭스 중단 이온 세제의 관류에 따라 간단한 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 단단한 기관 수 있습니다. 그것은 흐름 역학 및 세포질 파편 유출의 실시간 모니터링으로 가압된 주머니 안에 인간의 마음에 대 한 소설 decellularization 기법으로를 구성 됩니다.

거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.

생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

줄기 세포 기지를 둔 치료는 심근 경색 후에 부상당한 심장 조직을 복구하는 능률적인 전략으로 부상했습니다. 우리는 효소적으로 교차 연결 될 수있는 젤라틴 하이드로 겔을 사용하여 줄기 세포 이식에 대한 최적의 생체 내 응용 프로그램을 제공합니다.

Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

여기에 제시된 것은 고처리량, 다차원 형식으로 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 스페로이드(CS)의 생성 및 냉동 보존을 위한 일련의 프로토콜입니다. 이 3차원 모델은 질병 모델링, 고처리량 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼 역할을 하며 냉동 보존 후에도 기능을 유지합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

성인 인간의 심장에서 분리된 섬유아세포를 배양하여 젤라틴 코팅된 접시에 합류시켜 심근 특이적 세포외 기질을 생성했습니다. 탈세포화 후, 이 기질은 다른 심장 세포 및 세포-기질 상호 작용의 배양 및 연구에 사용할 수 있습니다.

Culture Dish Coating을 위한 성인 인간 섬유아세포의 심장 세포외 기질 생산

용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.

폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

배우세요 인간 심근의 세포외기질을 이용해 하이드로겔을 제조하고 세포 기반 분석에서 기질 효과를 연구하는 방법을. 이 기술은 심장 재생 연구에 필수적인 생존 신호를 제공합니다.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

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