기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

이 절차의 전반적인 목표는 심장 세포외 기질을 하이드로겔로 처리하여 다양한 세포 기반 분석에서 기질의 효과를 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 세포외 기질이 세포 행동에 미치는 영향과 같은 심장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외 또는 생체 내에서 대규모 실험을 수행하기 위해 세포 외 기질의 사용을 용이하게 한다는 것입니다.

이 기술의 적용은 매트릭스가 필수적인 생존 신호를 제공할 수 있기 때문에 심근 경색 치료법으로 확장될 수 있습니다. 실험을 시작하려면 숫자 10 날이 있는 멸균 메스를 사용하여 이전에 얻은 좌심실 심근에서 지방 조직을 제거합니다. 메스를 사용하여 심근을 약 1 x 1 x 1cm 입방체로 자릅니다.

다음으로, 큐브를 멸균된 50mL 튜브에 넣습니다. 큐브가 들어 있는 튜브를 섭씨 80도에서 보관하십시오. 준비된 큐브가 들어 있는 튜브를 냉동실에서 꺼내 얼음에 담아 저온 유지 장치로 운반합니다.

저온 유지 장치의 물체와 챔버 온도를 섭씨 15도로 설정합니다. 챔버의 빈 50mL 튜브와 스탬프를 식힙니다. 콜드 스탬프에 극저온 절편 매체 층을 추가하고 하얗고 단단해질 때까지 얼립니다.

두 번째 층의 극저온 절편 매체를 추가하고 두 번째 층에 심근 튜브를 놓습니다. 극저온 절편 매체와 심근이 완전히 얼었는지 확인하십시오. 그런 다음 얼어붙은 심근이 있는 스탬프를 홀더에 삽입하고 모든 나사를 조입니다.

균일한 단면 표면이 얻어질 때까지 조직 표면을 다듬습니다. 균일한 절단 단면을 보장하기 위해 자동 절단으로 동결된 심근을 절단합니다. 하나의 큐브에서 약 30-40개의 섹션을 슬라이스할 수 있습니다.

절편 후 각 슬라이스를 예냉각된 50mL 튜브에 느슨하게 놓습니다. 채워진 튜브를 닫고 얼음 위에 놓습니다. 모든 50 mL 튜브의 동결 섹션을 하나의 멸균 비커로 옮깁니다.

심근 절편을 포함하는 50mL 튜브당 50mL의 용해 용액을 추가합니다. 다음으로, 멸균 비커에서 심근 조각을 흔듭니다. 거친 체를 통해 조직 조각으로 액체를 걸러냅니다.

그런 다음 뭉툭한 핀셋으로 조직 조각을 새 멸균 비커로 옮깁니다. 심근 절편의 초기 50mL 튜브당 PBS에 0.5%SDS 50mL를 추가합니다. 실온에서 100-150rpm으로 6시간 동안 비커를 계속 흔듭니다.

흔든 후 거친 체를 통해 조직 조각으로 액체를 걸러냅니다. 뭉툭한 핀셋을 사용하여 티슈 조각을 새 멸균 비커로 옮기고 50mL의 PBS로 조각을 세 번 씻습니다. 다음으로, 1%의 페니실린 스트렙토마이신과 1%의 니스타틴을 함유한 PBS에서 밤새 조각을 씻습니다.

다음날, 세척액을 제거하고 1% 페니실린 스트렙토마이신과 1% 니스타틴으로 섭씨 37도로 예열된 FBS 25mL를 심근 슬라이스의 초기 50mL 튜브당 탈세포화된 슬라이스에 추가합니다. 기질에서 남아있는 DNA를 제거하기 위해 섭씨 37도에서 3시간 동안 절편을 배양합니다. 그런 다음 슬라이스를 새 멸균 비커로 옮기고 50mL의 PBS로 세 번 세척합니다.

ECM 슬라이스를 새로운 멸균 6웰 플레이트에 느슨하게 놓습니다. ECM을 섭씨 80도에서 동결하고 동결 건조에서 2일 동안 동결 건조합니다. ECM 슬라이스를 분쇄하려면 1.4mm 세라믹 비드가 들어있는 밀링 튜브를 사용하십시오.

멸균되고 뭉툭한 핀셋을 사용하여 동결건조된 ECM으로 튜브를 느슨하게 채웁니다. 튜브를 액체 질소로 스냅 동결합니다. 얼어붙은 튜브를 밀링 머신에 삽입하고 ECM을 분쇄합니다.

지속 시간을 30초로 설정하고 최대 속도를 조정한 다음 장치를 시작합니다. 분쇄 후 튜브를 꺼내 액체 질소로 다시 동결합니다. 튜브당 ddH20 1mL를 첨가하여 튜브에서 미립자를 세척하고 흔들어 완전한 가용화를 위해 만듭니다.

그런 다음 200마이크로미터 메쉬를 통해 이종 용액을 50mL 튜브에 여과합니다. 튜브를 액체 질소로 얼립니다. 튜브의 표준 뚜껑을 0.22마이크로미터 필터로 교체하여 분말이 튜브 밖으로 흘러나오는 것을 방지합니다.

동결 건조기에 튜브를 삽입하고 다시 동결 건조하여 세척 단계에서 물을 제거합니다. 이전에 제조된 동결건조된 인간 ECM 분말을 펩신 용액에 용해시켜 최종 농도 10mg/mL로 만듭니다. 용액을 튜브당 1mL 용량의 2mL 튜브로 옮깁니다.

용액을 피펫으로 넣어 완전히 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 셰이커에 넣고 섭씨 27도에서 48시간 동안 1200rpm으로 흔듭니다. 셰이커에서 튜브를 꺼내 얼음이나 미리 냉각된 튜브 홀더에 놓습니다.

예냉된 튜브에 차가운 10X PBS의 ECM 용액 부피의 1/9과 차가운 0.1몰 수산화나트륨의 ECM 용액 1/10을 혼합하고 얼음에 올려 소화된 ECM 용액을 중화하고 펩신을 비활성화합니다. 마지막으로, ECM 용액을 중화 혼합물에 첨가하고 피펫팅 또는 볼텍싱을 통해 철저히 혼합합니다. 개별 ECM 성분에 대한 정량적 분석은 SDS 단독에 의한 탈세포화에 비해 총 콜라겐, 엘라스틴 및 글리코소미노글리칸의 더 완전한 DNA 제거와 더 나은 보존을 보여주었습니다.

RT-PCR은 자발적 분화를 겪는 Murine ESC에서 구조적 심근세포 단백질, 초기 및 후기 심근생성 전사 인자 및 내피 세포 표면 마커 유전자의 발현을 정량화하는 데 사용되었습니다. cECM과의 접촉은 만능 줄기세포를 유도하며, 가급적이면 표현형과 같은 심근세포로 유도합니다. 위상차 광학 현미경 검사는 48시간 동안 cECM의 효소 분해가 보다 균질화된 ECM 용액을 생성한다는 것을 보여줍니다.

cECM 하이드로겔에서 인간 심장 섬유아세포의 살아있는/죽은 염색은 생존력이 증가된 것을 보여줍니다. cECM 미세입자와 cECM 하이드로겔은 모두 표준 배양의 세포와 비교하여 허혈성 상태에서 수축성 HL-1 세포의 대사 활성을 향상시킵니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 조직에서 하이드로겔까지 일주일 이내에 완료할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 심장 재생 분야의 연구자들이 체외 및 생체 내 모델 시스템에서 심장 세포 외 기질의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.