Name: Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 배우세요 인간 제대혈에서 CD34+ 세포를 분리하여 거대핵구 분화와 혈소판 형성을 연구하는 방법을. 이 기술은 혈액학 및 줄기세포 연구에 활용됩니다.

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저자 (그랜트 1012409 제너 시스에 링크 된 프로젝트) 호주 보건 및 의료 연구 위원회의 지원을 인정 한다.

이 프로토콜 남쪽 동부 쪽 시드니 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 대학의 뉴 사우스 웨일즈의 인간 연구 윤리 위원회에 의해 비준 되었다. 탯 줄 혈액 건강 한 기증자 로부터 얻은 의해 시드니 코드 혈액 은행 (시드니, NSW, 호주)를 제공 했다. 볼륨 약 100 mL의이 절차를 위해 사용 되었다.
참고: 클래스 II biosafety 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 코드 혈액 주머니의 외부 오염을 (가 위, 핀셋) 불 임 악기를 사용 하 여이 절차에 대 한.
1. 탯 줄 혈액 세포 준비 및 절연 CD34의+ 세포
<ol>
	<li>살 균 분리 버퍼 (SB) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.2, 그리고 포함 된 0.5% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA를 준비 합니다.</li>
	<li>(혈액 10 mL 당 1 개의 관은 필요) 50 mL 원뿔 관으로 SB의 10 mL를 분배. 10 mL 주사기에 장착 G18 무딘 바늘을 사용 하 여, 혈액 10 mL 가방에서 그리고 포함 하는 SB의 10 mL 50 mL 튜브로 분배.</li>
	<li>두 개의 레이어를 만드는 희석된 혈액을 포함 하는 관의 바닥에 림프 구 분리 미디어 ( 재료의 표참조)의 15 mL를 추가 합니다. 참고: 다른 레이어를 혼합 하지 마십시오 튜브의 하단에 천천히 미디어 분배.</li>
	<li>휴식 및 가속 없이 실 온 (RT)에서 30 분 동안 1200 × g에서 튜브를 원심.</li>
	<li>단 세포 (각 관에서 약 5-10 mL) 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 새로운 50 mL 튜브에 들어 있는 튜브의 중앙 레이어를 전송 합니다. SB 각 관 50 mL의 총 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>실시간 삭제에서 10 분 동안 400 × g에서 원심은 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 셀 펠 릿 하고있다 결합의 5-10 mL에 파스퇴르 피 펫으로 신중 하 게 정지 세포와 볼륨 50 mL SB와 함께.</li>
	<li>수 셀 Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를를 사용 하 여 또는 자동 세포 카운터 ( 재료의 표참조). CD34의 비율을 확인 하려면+ 세포 샘플, resuspend 2.5 × 105 셀 SB와 얼룩의 100 µ L에 4 ° c.에 15-30 분에 대 한 안티-CD34-PE 항 체의 10 µ L을 추가 하 여 Cytometry (그림 1A) 분석.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리기 튜브 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 단 세포가이 단계에서 동결 수 있습니다.</li>
	<li>108 셀 당 SB의 300 µ L 셀 resuspend FcR 인간 IgG의 100 µ L를 추가 (차단 시 약, 재료의 표참조) 및 100 µ L 108 셀 당 CD34 자석 구슬의. 부드럽게 혼합 하 고 30-40 분 동안 4 ° C에서 품 어. 참고: 단일 셀 서 스 펜 션은 필수 (필요한 경우 통과 셀 30 µ m 필터 시 약을 추가 하기 전에). 또는 그이 하 108 셀에 대 한 여기에 설명 된 시 볼륨을 사용 합니다. 10 이상8 셀에 대 한 시 약 (SB, 솔루션, 그리고 CD34 자석 구슬 차단)를 따라 확장할.</li>
	<li>LS 분리 열 인큐베이션 기간 동안 준비 하 여 마그네틱 홀더에서 LS 열을 배치 하 고 유출 하고있다 삭제의 3 mL로 세척. 참고: LS 분리 열 최대 2 × 108 총 셀으로 로드할 수 있습니다. 작고 큰 열 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5-10 mL SB의 셀 혼합물에 추가 하 고 400 × g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 1.5 ml SB의 세포 및 세포 현 탁 액 (1.5 mL) LS 열에 로드 합니다. 레이블이 없는 셀 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)에 포함 된을 통해 흐름을 수집 합니다. 액체 드레인과 1.5 mL SB의 열을 씻어 보자.</li>
	<li>(3 mL)를 통해 수집 된 흐름 열에 다시 로드 하 고 동일한 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)을 통해 흐름을 수집. 3 번 3 mL SB와 LS 열 세척. 참고: 필요한 경우 셀 부정적인 분수 (12 mL)에 얼룩이 질 수 있다 안티 CD34 항 체 확인 CD34의 캡처로+ LS 열에 의해 세포.</li>
	<li>마그네틱 구분 기호에서 열을 제거 하 고 2 mL SB의 새로운 15 mL 튜브에 주사기 플런저를 천천히 세포를 플러시.</li>
	<li>다시 열에 자석 분리기 및 로드 셀의 2 mL에 다시 열을 놓습니다. 통해 흐름을 수집 하 고 2 mL SB로 씻어. 이것은 부정적인 분수 #2 (4 mL) 이다.</li>
	<li>자석 분리기에서 LS 열을 제거 하 고는 CD34 수집 주사기 플런저와 꾸준히 고 단단히 하고있다 플러시 세포의 2 개 mL를 추가+ 셀 분수. Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 400 × g에서 긍정적인 분수와 함께 원심 분리기 튜브 폐기는 상쾌한. CD34에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀 resuspend+ 셀 (SFM, 재료의 표참조). 참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 셀 수 있는 동결 액체 질소에이 단계에서.</li>
</ol>
2. 순도 확인 격리 된 CD34의+ 세포
<ol>
	<li>10 µ L 안티-CD34-PE 항 체와 20 µ L 안티-CD45-PerCP 항 체 4 ° C (사용 별도 튜브 isotype 컨트롤)에서 15 분에 대 한 긍정적인 분수에서 2 × 104 셀을 얼룩 (그림 1B).</li>
	<li>씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 SB의 200 µ L 펠 릿 Resuspend.</li>
	<li>흐름 cytometric 분석을 수행 하 고 파편 (그림 1B)을 제외 하도록 라이브 셀 인구 게이트. PE 및 PerCP isotype 컨트롤 (그림 1B)를 사용 하 여 PE 및 PerCP 긍정적인 인구에 대 한 게이트를 설정 하 고 CD34의 비율 결정+/CD45+ 세포.</li>
</ol>
3. megakaryocyte 차별화
<ol>
	<li>씨앗 5 × 105 셀/mL CD34+ 12-잘 접시에 잘 당 50 ng/mL 재조합 인간 thrombopoietin (rhTPO)와 보충 SFM의 2 mL에 세포. 37 ° C, 5% CO2 습도 분위기에서 세포를 품 어. 셀 confluent 경우 분석을 위해 필요한 전에 세포를 수확 하 고 신선한 미디어와 rhTPO 여러 우물으로 분할. 참고: 두 개 또는 3 개의 우물 특별히 다른 시간 지점 (예를 들어, 7, 9, 10 일)에서 차별화를 모니터링 하는 준비 되어야 한다.</li>
	<li>다른 우물에 셀을 방해 하지 않고 차별화를 모니터링을 마련해 우물에서 세포를 수확.</li>
	<li>20 µ L 안티 GPIIb/CD41 FITC 항 체와 얼룩 세포와 10 µ L 안티-GPIX/CD42a-알 렉 사 Fluor 647 항 체 100 µ L. 마지막 볼륨에서 컨트롤 설정 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 튜브. 4 ° c.에 15 30 분 동안 품 어</li>
	<li>씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다.</li></ol>10 분 삭제는 상쾌한 400 × g에서 centrifuge 고 cytometry로 하고있다 분석의 200-300 µ L에 펠 릿을 resuspend.
	<li>각 fluorophore isotype 컨트롤 FITC와 알 렉 사 가루 647 긍정적인 인구 위한 게이팅 설정을 분석 합니다. CD41의 %를 확인 하려면 스테인드 세포 샘플을 분석+/CD42a+ 성숙 MK (그림 1C)을 대표 하는 긍정적인 셀을 두 번.</li>
	<li>세포의 현미경 시각화에 대 한 표면 마커 얼룩 세포 3.3에 설명 된 대로.<ol>
		<li>씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 분리기 Resuspend 100에서 펠 릿 SB 1000 x g 30 s. 공기 건조, 메탄올에 담그고 여 슬라이드에서 5 분 수정 셀에 유리 슬라이드에 스핀의 µ L 추가 20 µ L DAPI 포함 된 미디어를 탑재 ( 재료의 표참조) 는 coverslip로 커버 하 고 형광 현미경 (그림 2A)를 사용 하 여 시각화.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>세포내 항 원의 시각화, PBS에 셀 resuspend 및 paraformaldehyde (1% 최종 농도) 실 온에서 15 분으로 수정. 세포를 permeabilize, 트리톤-X 100 (0.1%)를 추가 하 고 PBS/0.1% 트리톤 X 100 2 mL와 함께 15 분 세척 셀에 품 어. PBS/0.1% 트리톤 X 100의 100 µ L에서 resuspend, vWf 및 안티 CD62p 항 체 (1: 200 희석) 안티 추가 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.<ol>
		<li>2 mL PBS/0.1% 트리톤-x 100 세척 하 고 10 분 동안 400 × g에서 원심, 동일한 버퍼의 100 µ L에서 resuspend 하 고 반대로 마우스 IgG-알 렉 사 594-토끼 IgG-알 렉 사 488 (1: 100)을 추가. 실 온에서 30 분 동안 incubate, 2 mL PBS/0.1% 트리톤-x 100 워시, 동일한 버퍼의 100 µ L에서 resuspend와 CD42b APC 안티의 20 µ L을 추가. 3.6.1 단계에서 설명한 대로 유리 슬라이드에 세포를 스핀 그리고 3.6.1 단계에서 설명한 대로 현미경 시각화에 대 한 샘플을 준비 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ploidy 결정에 대 한 12 또는 차별화의 13 일에 세포를 수확. 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분 및 100 µ L. 마지막 볼륨에서 20 µ L 안티 GPIIb/CD41 FITC 항 체와 얼룩 400 × g에서 원심 분리기 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.<ol>
		<li>SB의 1 mL와 함께 한 번 세척 하 고 당뇨 시트르산 버퍼 (1.25 m m 나트륨 구 연산 염, 염화 나트륨 2.5 m m, 3.5 m m 포도 당) 포함 20 µ g/ml propidium 요오드 화물 및 0.05%의 300 µ L에서 펠 릿 resuspend 트리톤 X 100. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>RNase 20 µ g/mL의 최종 농도에 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 30 분 동안 품 어. 30000 50000 CD41 FITC+ 인구 (그림 2C)의 이벤트를 수집 하 여 cytometry 여 propidium 요오드 화물의 강도 결정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet 계산, 혈소판 열거, 및 혈소판 활성화
<ol>
	<li>8 또는 감 별 법 및 종자의 9 일에 1 × 104 셀/잘 50 ng/mL rhTPO와 보충 하는 신선한 SFM의 200 µ L에 48-잘 접시에서 (3.1 단계)에서 세포를 수확. 37 ° C, 5%에서 5 일 동안 문화 공동2. 참고: 정량 목적 3 중 웰 스 씨. 이 낮은 밀도 시각화를 위한 필요 하며 문화의 2 일 후 나타나는 시작 proplatelet-베어링의 mk. Proplatelets 일반적으로 계산 합니다. 피크 일 4와 5 사이입니다.</li>
	<li>10 배 또는 20 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 가벼운 현미경에 전체 잘에서 proplatelet 베어링 MK의 수를 계산 합니다. 참고: 온수 (37 ° C) 현미경 단계가 바람직합니다, 이후 proplatelet 확장의 수축 하면 오랜된 시간 동안 실내 온도에 세포를 유지. Proplatelets MK 시체에서 긴 확장으로 관찰 된다. 각 MK 여러 proplatelet 돌출 할 수 있습니다. Proplatelets 개발는 MK의 몸 크기가 감소 합니다.</li>
	<li>세포를 수확 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g에서 원심. 3.3 및 3.4 단계에 설명 된 대로 20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체, 세포를 얼룩. Proplatelet 베어링 MK (pbMK)의 비율을 계산: pbMK (%) = [(Proplatelet 베어링 MKs/잘) / (총 CD41+ 세포 / 잘)] x 100</li>
	<li>문화 매체에 발표 하는 혈소판을 계산, 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다.<ol>
		<li>20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체 4 ° c.에 20-30 분으로 얼룩 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 컨트롤 튜브를 설정 합니다.</li>
		<li>SB의 150 µ L 구슬 세 50 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>흐름 cytometric 분석을 위해 로그 스케일 FSC 그리고 SSC를 설정 합니다. 4.4.1 게이팅 혈소판 (그림 3A)에 대 한 설정 섹션에 설명 된 대로 사용 하 여 정상적인 인간의 혈액 혈소판 혈소판이 풍부한 혈장에서 CD41 FITC와 스테인드.</li>
		<li>구슬 cytometry에 의해 계산 스테인드 혈소판 분석. 구슬 SSC 점도 (그림 3A) 대 FSC를 사용 하 여 계산의 1000 이벤트를 수집 합니다. CD41 FITC 긍정적인 이벤트 (그림 3B) 수식을 사용 하 여에 따라 혈소판의 수를 계산. µ L 당 혈소판 = [(CD41 FITC 긍정적인 이벤트의 번호)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/볼륨 샘플)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>혈소판 활성화를 분석 하려면 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다. 작은 셀을 5 분 동안 200 x g에서 Tyrode의 버퍼 (137 mM NaCl, 2.7 m KCl m, 1 mM MgCl2, 1.8 m CaCl2, 0.2 m m 나2HPO4m, 12 mM NaHCO3, 5.5 m m D-포도 당, pH 6.5) 및 원심 분리기의 1 mL를 추가 합니다.<ol>
		<li>상쾌한 그리고 혈소판 크기의 입자를 작은 10 분 800 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 Tyrode의 버퍼의 100 µ L에서 resuspend. 20 µ M. 최종 농도 20 µ L PAC1 FITC 항 체와 아데노신 diphosphate (ADP)의 추가 FITC 긍정적인 이벤트의 비율을 확인 하려면 cytometry로 20 분 분석에 대 한 실 온에서 품 어. 사용 신선한 인간 혈소판 긍정적인 컨트롤 (그림 3C)와 같은 방식으로 처리.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜은 MK와 문화 탯 줄 혈액에서 혈소판의 일관 생산에 적합 합니다. 이러한 세포 MK 확산, 감 별 법, proplatelet 형성 및 혈소판 생산에 마약 또는 생물 학적 활동의 효과 같은 다양 한 프로세스를 연구에 사용할 수 있습니다.
다양 한 문화 미디어와 cytokine 조합 문학에서 제시 되었다. + 줄기 세포 요소, Flt 3 ligand, 일리노이-3, 일리노이-6 지원 CD34 등 cytokines의 추가 확산 세포. 그러나,이 확장 문화14감소 MK 순수성에서 발생합니다. 혈 청 무료 미디어와 혼자, rhTPO를 사용 하 여, 여기에 제시 된 방법은 조상 세포의 중요 한 확장을 허용 하지 않습니다 하지만 unilineage megakaryocytic 확산 및 감 별 법 및 MK의 일관 된 생산 (90-99 %CD41+ CD42a+ 두 배 긍정...

일반 실험실 사용에 대 한 기본 인간의 없으며 (MK)의 충분 한 숫자의 절연은 ~0.01% nucleated 세포1의 담당 그들은 골 수에서 낮은 주파수로 인해 가능 합니다. 편리한 대안 ex vivo 확장 및 조 혈 줄기와 조상 세포 특정 성장 요인의 존재의 차별화 이다. Megakaryocytic 문화에 대 한 가장 효과적인 성장과 차별화 요소는 MKs. Thrombopoietin (TPO) 생산 문화 시스템에서 고용 cytokines 줄기 세포 요소 (SCF; c-kit ligand), IL-11 및 인터 루 킨 (IL)-3 등의 숫자 되었습니다. 혼자 또는 다른 cytokines, SCF 및 IL-32등 효과적 이다. TPO 확산 MKs2의 성숙에 결과 줄기 세포 인구에 작동할 수 있다.
Proplatelets 라는 세포질 돌출부에서 MK 생산 혈소판, vivo에서, 약 1 x 1011 혈소판은 최대 1000는 150-400 x 109/L. 혈소판 생산에서 생체 외에서 혈소판 수를 유지 하기 위해 매일 형성 -배는 vivo에서 견적3, 그리고이 에겐 CD34를 사용 하 여 여러 문화 조건 보다 낮은+ MK와 혈소판 생산에서 체 외에서개선 하기 위해 조 혈 조상 세포. CD34의 초기 소스+ 세포 MK 차별화 사용 했다 인간 주변 혈액4. 다른 셀 소스 등이 골5,6, 배아 줄기 세포/유도 만능 줄기 세포 (ESC/iPSC)7, 탯 줄 혈액 (UCB)8,9,10 . 인간의 골 CD34+ 11 와 마우스 리니지 부정적인 골 수 세포5 생산 MK와 혈소판 시험관; 인간의 골의 가용성의 부족 CD34의 근원으로 그것의 사용을 제한 하는 그럼에도 불구 하 고,+ 세포. 대조적으로, ESC, iPSC 생체 외에서 혈소판 생산을 위한 세포의 무제한 소스를 나타냅니다. 이 세포에서 혈소판 생산 murine OP9 셀 등 오랜 문화 피더 세포를 필요합니다. 급지대 무료 조건에서 파생 된 혈소판 기능 덜12나타납니다. iPSC 파생 혈소판 때문에 그들은 큰 규모로 확장 될 수 있다 임상 설정에 사용 될 가능성이 있다. 이 프로세스에서는 녹음 방송 요인과 장기 세포 문화13lentiviral 중재 변환 합니다.
UCB는 CD34의 액세스할 수 있는 소스+ 세포에 쉽게 사용할 수 있는 설정 연구. TPO 혼자 코드의 차별화를 홍보할 수 있는 혈액 유래 CD34+ 세포와이 생겨나게 혈 청 보충 또는 급지대 셀과 공동 문화에 대 한 필요 없이 매우 순수 하 고, 성숙한 MKs. 다른 cytokines SCF UCB CD34에서 차별화를 저하 될 수 있습니다와 같은+ 세포, Flt 3 ligand 그리고 IL-11 미 숙 없으며14의 생산을 촉진 하는 동안. 이 프로토콜에 설명 합니다 매우 순수한 MK 문화 코드 혈액 CD34에서에서+ 의 생산 세럼 무료 조건에서 세포.

<table><tbody><tr><td>세포 배양 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>줄기 세포 기술</td><td>9605</td><td>CD34+ 세포용 무혈청 배지</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CD34 분리 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead 키트 초순수</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>이 키트에는 FcR human IgG 차단 시약과 CD34 마이크로비드가 포함되어 있습니다. 이 비드에는 항-CD34 항체 클론 QBEND/10이 포함되어 있습니다. 순도 검사를 위해 다른 anti-CD34 클론을 사용합니다(예: 클론 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>림프구 분리 매체(밀도 1.077g/mL)</td></tr><tr><td>멸균 분리 완충액(SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>이 완충액에는 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2, 0.5% 소 혈청 알부민 및 2mM EDTA가 포함되어 있습니다. 멸균된 세포 배양 등급 구성 요소를 사용하여 준비할 수 있습니다. 기포가 컬럼을 막을 수 있으므로 사용하기 전에 가스를 제거하십시오.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow Cytometry and Cell Staining Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Clone 8G12. 이는 CD34 순도 검사에 사용할 수 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.</td></tr><tr><td>PerCP 마우스 anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>1:10 희석</td></tr><tr><td>PerCP isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>1:10 희석</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>최종 항체 농도 1:5 희석.</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>이 항체는 성숙한 MK(일반적으로 anti CD42a보다 낮은 양성 세포의 비율)를 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>현재 Bio-Rad에서 유통하고 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 마우스 음성 대조군</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>현재 Bio-Rad에서 유통하고 있습니다. 동형 대조군 항체</td></tr><tr><td>안티 폰 빌레브란트 인자 토끼 다클론</td>성 <td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>V450 마우스 안티-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1:20 희석</td></tr><tr><td>V450 동형 대조군</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>1:20 희석</td></tr><tr><td>PAC1-FITC 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 희석</td></tr><tr><td>Anti CD62p 마우스 단클론</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Isotype control 항체</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright 절대 계수 비드</td><td>분자 프로브, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>계수 비드</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>더 작고 더 큰 칼럼도 상업적으로 이용 가능</td></tr><tr><td>MidiMACS 분리기 자석</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL 둥근 바닥 폴리 프로필렌 FACS 튜브, 스냅 캡 포함, 멸균</td><td>체외 기술</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories</td>를 사용한 <td>마운팅 미디어 H-1200</td><td>안티페이드 마운팅 미디어< DAPIstrong</td></tr><tr><td>>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Leica</td><td>DMIRB 도립 현미경</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 원심 분리기</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 분석기 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>단세포 분석 소프트웨어</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 블루 에디션</td><td></td></tr></tbody></table>

megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 cd34+ 세포

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

혈소판 생산 thrombopoiesis로 알려진 프로세스에서 골 수에서 주로 발생 합니다. Thrombopoiesis, 동안 조 혈 조상 세포 형태 혈소판 선구자 라는 없으며, 말기 출시 되 나 proplatelets 긴 세포질 프로세스에서 혈소판 분화를 구분 합니다. 없으며 희귀 세포 골 수에 국한 되며 따라서 실험실 사용을 위해 충분 한 숫자에 수확 하기가. 인간의 없으며의 효율적인 생산 수 달성 생체 외에서 CD34 경작+ 적당 한 조건 하에서 세포. 여기서 설명 하는 프로토콜 CD34의 격리에 설명 합니다+ 탯 줄 혈액 샘플에서 정렬 하는 자기 셀에 의해 세포. 매우 순수 하 고, 성숙한 없으며 혈 청 무료 조건 하에서 생산 하는 필요한 단계를 설명 합니다. Megakaryocyte 차별화의 phenotypic 분석 및 proplatelet 형성 및 혈소판 생산의 결정도 제공 됩니다. 이펙터 megakaryocyte 차별화 및 항 혈소판 항 체 등 thrombopoietin mimetics proplatelet 형성에 영향을 주는 생물 학적 기능 검사 경작된 한 세포에 추가할 수 있습니다.

이 프로토콜 수 있습니다 매우 순수 MK 문화 코드에서의 준비 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34의 비율+ 세포 탯 줄 혈액은 약 1.315 (그림 1A)와 단 세포 (단계 1.8) 범위 90-300 x 10의 총 수 UCB 단위 당6 . CD34의 순도 + CD45 + 세포 격리 범위 90에서 99% (그림 1B) 후. MK (CD41 정의+ 세포) 혈 청 무료 CD34 초기에 관찰 된다+ 세포 rhTPO의 문화. 7 일에의 비율 MK 성숙 (CD41+ 및 CD42a+ 세포)은 일반적으로 30-40% (그림 1C). CD41 최고 ...

매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34 방법+ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 제대혈 샘플을 사용하여 순수 CD34 양성 세포를 분리하여 거핵세포 분화, 프로혈소판 형성 및 혈소판 생성에 대한 특정 관심 약물의 효과를 연구하는 것입니다. 이 방법은 거핵세포 및 혈소판 분야에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 특정 치료법이 거핵세포 분화와 혈소판 생성 및 기능에 미치는 영향은 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 신선한 제대혈에서 생존 가능한 CD34 양성 세포를 일관되게 분리하는 방법을 제공한다는 것입니다.이 방법을 통해 거핵생물증에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 림프구, 적혈구 및 대식세포와 같은 다른 세포 유형도 연구할 수 있습니다. 제대혈 10ml당 150ml 원추형 튜브에 10ml의 분리 완충액을 추가하는 것으로 시작합니다. 10밀리리터 주사기에 장착된 18게이지 뭉툭한 바늘을 사용하여 10밀리리터의 혈액을 각 튜브로 옮긴 다음 각 튜브의 바닥에 15밀리리터의 림프구 분리 배지를 추가합니다.밀도 구배 원심분리로 세포를 분리한 다음 스핀이 끝나면 버피 코트 층을 포함하는 5-10밀리리터의 단핵 세포를 샘플당 하나의 새 튜브에 조심스럽게 수집합니다. 새 분리 버퍼를 사용하여 각 튜브의 총 부피를 최대 50ml까지 가져오고 세포를 다시 원심분리합니다. 펠릿을 5-10 밀리리터의 새로운 분리 완충액에 다시 현탁시키고 세포 샘플을 풀링합니다.계수를 위해 새로운 분리 버퍼를 사용하여 부피를 50ml로 조정하고 100마이크로리터의 세포를 따로 보관하여 유세포 분석으로 CD34 양성 세포의 비율을 측정합니다. 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 300마이크로리터의 분리 완충액, 100마이크로리터의 FC 수용체 인간 IgG 차단 시약, 100마이크로리터의 CD34 마그네틱 비드에 100 x 10에서 8번째 세포에 다시 현탁시킵니다. 30-40분 동안 배양하기 위해 섭씨 4도에 놓기 전에 세포를 부드럽게 혼합합니다.배양 중에 적절한 크기의 마그네틱 비드 분리 컬럼을 해당 마그네틱 홀더에 놓고 3ml의 분리 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 배양이 끝나면 5-10ml의 분리 완충액에서 원심분리로 결합되지 않은 비드를 제거하고 1.5ml의 새로운 분리 완충액에 마그네틱 비드와 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 라벨링된 세포를 컬럼에 로드하고 라벨링되지 않은 흐름을 15ml 수집 튜브에 수집합니다.폐수를 컬럼에 다시 적재하고 두 번째 라운드의 흐름을 동일한 수집 튜브로 수집합니다. 그런 다음 3ml의 분리 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 자석에서 컬럼을 제거합니다. 컬럼 플런저를 사용하여 컬럼을 통해 2ml의 분리 버퍼를 새 15ml 튜브로 서서히 플러시하고 컬럼을 자석으로 되돌립니다.플러시된 셀을 컬럼에 다시 로드합니다. 흐름을 통해 모으고 방금 설명한 것처럼 2ml의 분리 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 자석에서 컬럼을 제거한 후 2ml의 새로운 분리 버퍼로 컬럼을 플러시하여 방금 설명한 대로 CD34 양성 세포 분획을 수집하고 원심분리를 통해 CD34 양성 세포를 수집합니다.그런 다음 CD34 양성 세포에 대해 펠릿을 무혈청 배지에 재현탁합니다. 거핵세포 분화를 위해 2ml의 무혈청 배지에 5 x 10에서 5번째 CD34 양성 세포를 시드하고, 12웰 플레이트에 웰당 재조합 인간 트롬보포이에틴을 보충하여 섭씨 37도에서 배양하고 5%이산화탄소를 가습된 분위기에서 배양합니다. 적절한 분화 모니터링 시점에서, 다른 웰의 세포를 방해하지 않고 시점당 2-3개의 웰에서 세포를 채취하고, 수집된 세포를 항-CD41 및 항-CD42a 항체로 염색하여 배양물 내 성숙한 거핵세포의 비율을 측정합니다.세포 표면 마커에서 현미경 시각화를 위해 수확된 세포를 1ml의 분리 완충액으로 세척하고 100마이크로리터의 새 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 사이토스핀(cytospin)을 사용하여 세포를 유리 슬라이드에 파종하고 메탄올에 30초 동안 담가두면 세포를 슬라이드에 고정합니다. 공기 건조 후, 20마이크로리터의 DAPI 보충 장착 매체로 세포에 라벨을 붙이고, 형광 현미경 검사로 시각화할 수 있도록 커버 슬립으로 세포를 덮습니다.프로혈소판을 계수하려면 분화 8일 또는 9일째에 세포를 수확하고, 수집된 세포를 48웰 플레이트의 웰당 재조합 인간 트롬보포이에틴이 보충된 신선한 무혈청 배지 200마이크로리터당 1 x 10에서 4번째 세포로 파종합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5일 후 10배 또는 20배 대물렌즈를 사용하여 도립광 현미경에서 웰당 프로혈소판 함유 거핵세포의 수를 계산합니다. 혈소판 활성화를 분석하기 위해 배양 14일 또는 15일째에 파스퇴르 피펫으로 세포를 부드럽게 혼합하고 100마이크로리터의 세포를 수집합니다.1ml의 Tyrode 완충액을 세포에 첨가하고 원심분리로 펠릿화합니다. 원심분리를 위해 상층액을 수집하여 혈소판 크기의 입자를 펠릿화하고 100마이크로리터의 새로운 Tyrode 완충액에 입자를 재현탁한 다음 입자에 항-PAK1 항체를 표시하고 실온에서 20분 동안 아데노신 이인산으로 활성화한 다음 유세포 분석을 통해 PAK1 양성 이벤트의 백분율을 분석합니다. 제대혈에서 CD34 양성 세포의 일반적인 비율은 약 1.3%이며, 분리 후 CD34 양성 CD45 양성 세포의 순도는 90 - 99% 사이이며, 혈청이 없는 CD34 양성 세포 배양 초기에 CD41 양성 CD42a 양성 거핵세포의 비율은 30 - 40%에 이르며, 분화 10일과 12일 사이에 관찰된 이중 양성 세포의 가장 높은 수치가 관찰됩니다.배양된 거핵세포는 세포질에서 CD42b Von Willebrand 인자 및 P-selectin을 발현하는 크고 일반적으로 다핵 세포로 나타납니다. 적어도 세 가지 종류의 ploidy도 이러한 세포 배양에서 일반적으로 관찰됩니다. 거핵세포체에서 뻗어 나온 긴 구슬 모양의 섬유인 프로플레이트를 가진 거핵세포의 비율은 일반적으로 약 1.3%입니다.세포 배양 상등액의 대부분의 혈소판은 말초 혈소판의 분석 게이트 내에 속하고, CD41 혈소판 마커에 대해 양성이며, 활성화 특이적 PAK1 단클론 항체의 결합 증가에 의해 입증된 바와 같이 아데노신 이인산과 같은 혈소판 작용제에 의해 활성화될 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 제대혈에서 CD34 양성 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 거핵세포 분화 배양을 설정하고, 프로혈소판을 계수하고, 체외에서 생성된 혈소판 및 거핵세포를 분석할 수 있습니다. 인체 샘플로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 거핵세포의 분화와 혈소판 형성을 위한 기술을 보여줍니다. 인간 탯줄 혈액에서 분리된 조혈 줄기 전구 세포는 트롬보포이에틴이 존재하는 상태에서 성숙한 거핵세포로 분화합니다. 성숙한 거핵세포는 프로혈소판(proplatelet)이라고 하는 세포질 확장을 생성하며, 이는 개별 혈소판을 생성합니다.

거핵세포와 혈소판 형성의 분화를 위한 체외(In vitro) 방법

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.

인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

이 프로토콜은 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 배혈구를 방출할 수 있는 배혈구를 생성할 수 있는 배혈구-발광식 CD34+ 조혈선 및 체외 분화 및 성숙을 얻는 데 관련된 모든 단계를 자세히 설명합니다. 이 절차는 거대 karyopoiesis를 통제하는 세포 및 분자 기계장치의 심층 분석에 유용합니다.

류코데플션 필터-유래 CD34+ 세포가 메가카요시테 분화 및 혈소판 형성을 연구하는 세포 공급원으로

여기서는 메가카요세포 분화의 특성화를 위한 면역페노티핑 전략을 제시하고, 이 전략이 형광 활성화 세포 선별기로 다른 단계에서 메가카요사이클을 분류하는 방법을 보여준다. 방법론은 인체 에 있는 문화에서 생성된 거대 karyocytes뿐만 아니라 인간 1차 조직에적용될 수 있다.

인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화

적혈구 모델링은 이 과정에서 행위자의 생물학적 중요성을 이해하고 분화 결함을 완화할 수 있는 새로운 치료 접근법을 평가할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 여기에서는 CD34+ 조혈모세포와 전구세포를 체외에서 효율적으로 구별할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을...

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

배우세요 인간 제대혈에서 CD34+ 세포를 분리하여 거대핵구 분화와 혈소판 형성을 연구하는 방법을. 이 기술은 혈액학 및 줄기세포 연구에 활용됩니다.

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34⁺ 세포

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