Name: 외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 학습하세요 진균 bovis BCG 백신에 재조합 단백질을 이용한 표면 장식 기법으로 유전자 기반 방법의 대안을 제공합니다. 이 방법은 마이코박테리올로지 및 백신 개발 연구에 활용됩니다.

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우리 기술 지원에 대 한 A. Talal 닥터 R 스톡 BCG 파스퇴르 스트레인에 대 한 감사합니다. 우리는 또한 유전자 합성에 대 한 GenScript을 감사합니다.

모든 동물 동물 관리 및 사용 위원회 브리티시 컬럼비아의 대학에 의해 찬성 하는 프로토콜에 따라 유지 되었다. 실험 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었고 캐나다 위원회 동물 관리 지침에 따라 수행. 동물 보증 복지 수는 A11-0247.
1. 플라스 미드를 표현 하는 단위체 Avidin 융해 단백질의 생성
<ol><li>하위 단위체 avidin 시퀀스12 133에 해당 하는 "CTC"와 "GAA" 사이트 사이 pDEST17 플라스 미드로 복제-134bp. (즉, 6-histag와 pDEST17 Attr1 재결합 사이트 사이) p17-Avi를. 참고: 단위체 avidin DNA 순서는 다음과 같습니다. 단위체 avidin를 야생-타입 Avidin에 도입 된 3 개의 돌연변이 굵게 문자에서 표시 됩니다. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt가</li>
	<li>At & tb 1과 b 2를 at & t사이트에 해당 OVA polypeptide757-1035 하 형벌 뇌관 디자인 (-Ab-와 H-2_Kb-epitopes를 제한) DNA 순서. 뇌관 순서는: Attb1-OVA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT와 at & tb 2-OVA GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC입니다. (At & tb 1과 b2 시퀀스를 at & t는 굵게 표시)입니다.<ol>
<li>PCR 증폭 OVA polypeptide757-1035 DNA 시퀀스를 템플릿으로 pUC57 OVA 플라스 미드를 사용 하 여 뇌관으로.</li>
		<li>사이트별 생체 외에서 재결합 반응 (예를 들어, BP Clonase) pDONR-OVA를 통해 pDONR-221에 PCR 제품을 복제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>P17-Avi p17-Avi-OVA를 LR Clonase 반응 사용에 관심사의 유전자를 전송 합니다. 참고: 혈압 및 LR 재조합 복제의 내용은 제조업체의 설명서 참조.</li>
</ol>2. 단위체 Avidin 퓨전 단백질 표정, 정화, 및 Refolding
<ol><li>P17-Avi-OVA 플라스 미드를 대장균 BL21 변환 및 대장균 BL21 문화 IPTG (0.1 m M)를 37 ° c.에 3 h의 250 mL를 유도</li>
	<li>
포함 시체 가용 화 및 박테리아의 lysis
	<ol>
<li>원심 분리 g x 4000와 4 ° c.의 30 분 유도 BL21 문화의 250 mL 작은</li>
		<li>세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 알 약을 수집 (50 m Tris HCL, 150 m NaCl, m 6 m M Guanidine-HCL, pH 1.5-2.5)와 95 ° c.에 15 분 동안 품 어 회전자에 실 온에서 하룻밤를 품 어.</li>
		<li>30 분 x g와 4 ° C와 수집 상쾌한 15000 원심</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avi-OVA에서 상쾌한 (포함 시체 Solubilized 분수) Ni NTA 열을 사용 하 여 정화.
	<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼 포함 시체 1:2 희석.</li>
		<li>Ni NTA 수 지 문화 파생 포함 시체의 250 mL 당 4 mL를 사용 합니다.</li>
		<li>3 배 (pH 7.0) 세포의 용 해 버퍼의 10 mL와 함께 씻으십시오.</li>
		<li>차입 버퍼 (세포의 용 해 버퍼 pH 7.0 250mm 이미와) 10 mL와 함께 elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>점진적으로 희석 (1:10)에 의해 eluted 단백질 refold Tris 버퍼 (pH 7.5)에 급속 한 vortexing 포함 1mm DTT, 200 m m NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 m 트윈 80 m, 500mm 아르기닌, 그리고 200 m m NaCl 실 온에서 30 분.</li>
	<li>드 소금과 버퍼 교환 제조 업체의 프로토콜에 따라 단백질 집중으로 PBS에 Tris 버퍼에서 단백질을 refolded.</li>
	<li>3500 x g 와 4 ° C에서 30 분 동안 원심 분리 하 여 집계를 제거 하 고-20 ° c.에 녹는 단백질의 aliquots를 저장</li>
</ol>3입니다. BCG 세포 표면 Biotinylation
<ol><li>미들 7 H에에서 BCG 성장 9 국물 10 %OADC (올레산, 알 부 민 및 포도 당 솔루션) 및 0.05% 트윈 80 세까지 50 rpm에서 통 플랫폼에서 37 ° C에서 0.5-1 =. 참고: BCG biosafety 수준 2 병원 체 이며 모든 실험에 관한 BCG biosafety 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛에서 이루어져야 한다.</li>
	<li>500 µ L의 얼음도 무료 PBS 플러스 0.1 %Tween80 (PBST) (pH 8.0)와 109 BCG 3 번 세척. 메 마른 내 무료 PBS에 BCG 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>
즉시 사용 하기 전에 살 균 필터링 된 물에 10 m m Sulfo NHS SS biotin의 1 mL를 준비 합니다.
	<ol>
<li>30 분 동안 실내 온도에 Sulfo NHS SS biotin의 0.5 m m의 1 mL와 함께 박테리아를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 번 비 반응 biotinylation 시 약을 제거 하 아이스 콜드 PBST의 500 µ L로 레이블이 지정 된 박테리아를 씻으십시오.
	<ol>
<li>다시 PBST의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biotinylation 효율성 평가, 20 분 동안 실 온에서 108 biotinylated Streptavidin FITC (1: 100, 25 µ L)으로 BCG를 얼룩.
	<ol>
<li>2%의 1 mL에 얼룩진된 박테리아를 품 어 실 온에서 20 분 동안 PFA와 교류 cytometry 분석에 의해 biotinylation의 레벨을 검사 하 여 다음.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Biotinylated Mycobacteria의 표현 형: 성장 및 생존
<ol><li>
미들 7 H에에서 BCG 긴장 성장 9 국물 10 %OADC (올레산, 알 부 민 및 포도 당 솔루션) 및 0.05% 트윈 80 50 rpm에서 통 플랫폼에서 37 ° C에서.
	<ol>
<li>8 일 동안 세균성 문화의 광학 밀도 (OD600)를 기록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
대 식 세포에 박테리아의 생존을 감지 하 BCG-뤽 (앞에서 설명한9)를 사용 합니다.
	<ol>
<li>Biotinylated BCG-루크 (나 10:1)와 RAW264.7 세포를 감염 또는 BCG-뤽 (제어) 치료 및 48 h 동안 37 ° C에서 incubated 기간.</li>
		<li>셀 monolayers 세척 하 고 0.025 %SDS 섭취 박테리아를 출시와 함께 다음 lyse.</li>
		<li>생물 발광 Luciferase 분석 결과 시스템 루미 노 생산을 측정 합니다. 참고: 발광 신호는 세균 생존 능력의 지표 이다. Luciferase 분석 결과의 내용은 제조업체의 설명서를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Biotinylated BCG 표면에 단위체 Avidin-퓨전 단백질 바인딩
<ol><li>Avi-단백질 (PBS-T의 최종 10 μ g/mL) 5 x 108 biotinylated BCG 통 플랫폼에 실 온에서 1 h에 대 한 믹스.</li>
	<li>아이스 콜드 PBST와 얼룩 토끼 방지 avidin 항 체 (Ab) (1: 100 희석, 앞에서 설명한10) 실 온에서 20 분 및 다음 FITC 500 µ L로 3 번 세척 박테리아 염소-토끼 IgG Ab는 동일한 조건에서 활용.</li>
	<li>3 번과 PBST의 500 µ L 세균을 세척 하 고 cytometry 표면 장식의 정도 평가 하 여 분석.</li>
</ol>6입니다. Mycobacteria의 동결
<ol><li>Biotinylate 박테리아 단계 3.1-3.4와 코트 biotinylated 박테리아에 따라 Avi OVA와 단계 5.1에 따라.</li>
	<li>Aliquot biotinylated 및 코팅된 박테리아 (108), PBS로 세척 하 고 다시 0.5 mL 동결은 미디어에서 일시 중지 (25 %Sauton 매체, 75% H2O, 그리고 1.5% 나 조미료).</li>
	<li>유리 튜브에 박테리아를 전송 하 고 하룻밤-80 ° C 냉동 고에서 얼어.</li>
	<li>동결 건조 기를 사용 하 여 24 시간 냉동된 채워진된 유리 튜브 lyophilize</li>
	<li>실 온에서 말린된 견본을 저장 하 고 필요할 때 PBS에서 다시 구성.</li>
	<li>3.5 biotinylation 및 표면 코팅 안정성 평가를 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>7. 먹어서 분석 결과
<ol><li>70-80 %confluency 10 cm 직경 문화 요리 DMEM 매체 포함 5 %FCS, 1%의 L-글루타민, HEPES, 비필수 아미노산, 그리고 페니실린과 스에에서 RAW 264.7 대 식 세포 세포를 성장 한다.</li>
	<li>6 잘 플레이트에서 2 x 106 RAW 264.7 대 식 세포 세포 씨앗 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 준수를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>DsRed BCG 생성 단계 3.1-3.4 및 5.1 Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) 장식 (앞에서 설명한9).</li>
	<li>DsRed BCG-Avi-OVA 또는 치료 DsRed BCG 나 37 ° c.에 24 h에 대 한 20: 1에서 원시 세포를 감염</li>
	<li>셀 세 번 세척 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 부분적으로 분리 된 박테리아를 제거 하 0.25 %trypsin 1 mL를 사용 하 여 trypsinize.</li>
	<li>2.5%에서 수정 PFA 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에.</li>
	<li>PBS로 3 회 세척 하 고 cytometry 분석.</li>
</ol>8. 대 식 세포에 BCG Biotinylated 장식의 OVA 세포내 매매
<ol><li>
형광 현미경 검사 법
	<ol>
<li>Coverslips 24-잘 접시에서에 3 x 105 RAW 264.7 대 식 세포 세포 씨앗 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 준수를 셀 수 있습니다.</li>
		<li>유지 보수 미디어에서 37 ° C, 5% CO2 4 ~ 24 h에 대 한 항생제 없이 mycobacteria (나 10:1)와 대 식 세포 세포를 감염.</li>
		<li>세포를 세척 하 고 단계 7.5로 표면 부착, 비 섭취 박테리아를 제거 하는 trypsinize.</li>
		<li>2.5%에서 감염 수정 셀 PFA 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에 PBS 가진 3 세척 옵니다.</li>
		<li>차단/permeabilization 버퍼에 세포를 permeabilize (0.1% 트라이 톤 X-100, PBS에 3 %BSA) 실 온에서 20 분.<ol>
<li>관심의 사용 하 여 특정 항 체 (예, 안티 avidin Ab 토끼) permeabilization에서 10 μ g/mL에서 실 온에서 20 분에 대 한 버퍼 다음 이차 항 체 (예를 들어, FITC 염소-토끼 IgG) 20 분.</li>
		</ol>
</li>
		<li>워시 번와 물, 형광 photobleaching를 최소화 하기 위해 수성 장착 매체의 10 μ에 슬라이드에 PBS 가진 3 배 세포.</li>
		<li>슬라이드 63 x를 갖춘 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 디지털 confocal 현미경 검사 법으로 검사 / 1.4 계획 Apochromat 목표. 디지털 카메라를 사용 하 여 이미지를 기록 현미경 소프트웨어를 결합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunogold 얼룩 및 전자 현미경 검사 법
	<ol>
<li>6 잘 플레이트에서 2 x 106 RAW 264.7 대 식 세포 세포 씨앗</li>
		<li>4%로 BCG 감염 세포 수정 PFA 실 온에서 4 시간.</li>
		<li>PBS와 두 번 씻는 다.</li>
		<li>4% 낮은 융 점 agarose에서 샘플을 포함 하 고 70% 에탄올에서 탈수.</li>
		<li>아크릴 수 지에 샘플을 전송 하 고 50 ° c.에 유해</li>
		<li>톰으로 60 nm 섹션을 잘라내어 니켈 격자에 섹션을 수집.</li>
		<li>1 시간 실 온에서 또는 부 화 솔루션 (PBS와 0.1 %BSA) 4 ° C 하룻밤에 10 μ g/mL avidin 항 체와 고 부 화 솔루션 금 활용 된 F(ab')2 매우 작은 염소-안티-토끼의 다음 세척 실에서 1 시간 (1/20) IgG 부 화 솔루션에 온도입니다.</li>
		<li>섹션 증류수에 세척, 2%도 얼룩, 다시, 건조, 공기 세척 및 전자 현미경으로 검사.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 동물 면역 및 장기 처리
참고: 모든 단계는 biosafety 내각에서 행해져야 한다.
<ol><li>패스 biotinylated 및 단백질 코팅 박테리아 271/2G 바늘을 통해 10 번 단일 세포 현 탁 액을 만들기 위해.</li>
	<li>
1 x 106 박테리아도 무료 PBS의 100 μ에 고는 여성 C57BL/6 쥐 (-Ab, H-2 Kb, 5-6 주 이전) 목에의 아저씨 피하에 면역.
	<ol>
<li>혼자 PBS의 100 μ와 통제 쥐를 주사.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입에 의해 면역된 쥐 20 일 사후 예방 접종을 안락사.
	<ol>
<li>비장을 분리 하 고 RPMI 미디어로 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
5 mL 주사기 플런저와 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 비장을 매쉬.
	<ol>
<li>RPMI의 5 mL로 씻으십시오. 원심 분리기 (800 x g, 3 분) 단일 세포 현 탁 액을</li>
		<li>Biotin-Ter119/Erythroid 셀 Ab 마우스 biotin 긍정적인 선택 장비로 RBC 고갈 합니다.</li>
		<li>완전 한 RPMI (FCS가 10%, 1 %L-글루타민, 1% 페니실린, 1% 스, 및 50 μ M 2-ME) 10 mL에 원심 분리기와 다시 중단 셀.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. 난-Ab tetramer 항 원 특정 CD4 주파수+ T 세포 및 결정 주파수의 항 원 특정 T 세포 방출 Cytokines 예방 접종 동물에서을 얼룩이 지는 세포내 Cytokine 확인 얼룩
<ol><li>
Tetramer 얼룩
	<ol>
<li>제어 및 PE 활용-Ab면역된 생쥐 (~ 20 x 106 셀)에서 splenocytes 얼룩-OVA323-339 tetramers (1/12.5 희석) 바인딩 버퍼 (PBS FCS 2%와 0.1% 할머니3)에서 37 ° C에서 1 시간.</li>
		<li>실 온에서 20 분 동안 splenocytes를 AF647 CD4 Ab (1:25)와 7-AAD (죽은 세포를 감지)를 추가 합니다.</li>
		<li>Cytometry에 의해 샘플을 분석 합니다.</li>
		<li>500000 이벤트 tetramer 포지티브 이벤트의 빈도 결정 하는 CD4 긍정적인 지역에서 획득. 참고: 총 splenocytes로 정의 됩니다 SSC/FSC 점 오에 의해 7 AAD 긍정적인 이벤트의 배제에 의해 라이브 세포와 CD4 하위 집합 게이팅 AF647 긍정적인 이벤트.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
발표 T 세포는 항 원 특정 세포내 Cytokine의 주파수
	<ol>
<li>6 잘 플레이트 또는 재조합 OVA 없이 완전 한 RPMI 매체의 4 mL로 나누며 약 1 × 107 splenocytes (10 µ g/mL)와 16 h에 대 한 품 어.</li>
		<li>Brefeldin A (1:1, 000)는 추가 5 h에 대 한 셀을 취급 합니다.</li>
		<li>다음과 같이 얼룩이 지는 세포내 cytokine 및 PBS로 세척:<ol>
<li>30 분 동안 실내 온도에 PE CD8 또는 PE-Cy7-CD4 Ab (바인딩 버퍼에 1:50) 셀 샘플을 얼룩.</li>
			<li>4%에서 수정 PFA 20 분 동안 실내 온도에.</li>
			<li>Permeabilize permeabilization 솔루션을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라.</li>
			<li>실 온에서 AF647 활용 IFN-γ Ab (1:50) 20 분에 대 한 레이블을 셀 씻으십시오.</li>
			<li>세포를 세척 하 고 위에서 설명한 대로 흐름 cytometry 분석 대상.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리 보고이 연구에서 외 인 단백질의 신속 하 고 효과적인 디스플레이 위한 비 유전 접근 특정 항 원 또는 효율적으로 박테리아의 immunogenicity를 향상 시킬 것으로 예상 하는 특정 기능 속성을 추가 하려면 BCG 표면에. 우리는 BCG 세포 표면 수 쉽게 avidin 퓨전 단백질 즉각적인 표면 장식 biotinylated 시연. 유전자 변환 및 긍정적인 클론의 선택 필요 시간 지연의 2 ~ 3 개월 동안 2 h 이내 총 절차를 수행할 수 있습니다. 표면 수정 세균성 성장 및 생존에 영향을 미치지 않습니다. 박테리아는 대리 항 OVA 항 원 발표 통로에 항 원을 제공할 수 있었고, 특정 면역 응답 vivo에서 MHC tetramer 얼룩 등-cytometry 분석 실험에 의해 평가 되었다 유도로 장식 하 고 세포내 cytokine (ICS) 얼룩입니다. 더 중요 한 것은, vivo에서 학문은 명확 하 게 표면 장식 박테리아 BCG 익스프레스 유사한 항 원에 유전자 조작에 비해 면역 반응의...

대체 현재 결핵 백신 BCG, 유전자 소개 하도 단백질 보조 시스템, 바이러스 벡터화 기술, 감쇠 라이브 M.tb 긴장, 및 유전자 변형된 BCG 긴장을 포함 한 다양 한 전략 제안 -감염1 또는 Mtb동안 충분히 표현 되지 않는다 BCG 항 원 표현-특정 항 BCG2에 존재 하지. 그러나 유전 공학,, 안전, 시간이 많이 걸리는 프로세스 및 식 벡터4,5의 낮은 효율의 불확 실한 수준을 포함 하는 많은 방 벽을 직면 한다. BCG를 개선에 관해서는 대체 접근 불확 실한 유전 교대에 대 한 필요 없이 immunogenicity를 개선 하기 위해 필요 합니다.
이 연구에서 biotin과 잘 알려진 높은 선호도 avidin 상호 작용을 기반으로 하는 BCG 세포 표면에 대 한 관심의 재조합 단백질의 디스플레이 대 한 새로운 전략을 소개 합니다. 이 접근 방식은 biotinylated BCG, 그것의 우수한 안전 하면서 효능의 최대한 향상을 달성 하기 위해 BCG의 광범위 한 조작을 용이 하 게 표면에 재조합 avidin 융해 단백질의 신속 하 고 재현할 수 첨부 파일 수 기록, 사용의 수 십년 동안 관찰 합니다.
Avidin 비타민 b 복합체에 대 한 선호도 매우 높은 (Kd = 10−15 M) 고 형성, 면 avidin 비타민 b 복합체 복합물은 매우 안정 조건6을 변성 시키기에서 중단 될 수 있습니다. 그러나, 유전자 전송 방법 대안 역할을 상호 작용의이 유형에 대 한 재조합 단백질의 장기 하지만 되돌릴 수 표시가 됩니다. 따라서, 우리는 여기 낮은 선호도 단위체 avidin 도입 (Kd = 10−7 M) 표면에서 단백질의 가역 릴리스 리드 BCG 항 원 제시 세포 안에 섭취 한 번 장식. 개념의 증거를 제공 하기 위해 ovalbumin (OVA)7,8에서 파생 된 대리 항 원에 해당 하는 단위체 avidin 공상 단백질을 사용 하 여이 방법을 테스트 했습니다. 결과 BCG 세포 표면 장식 하실 수 있습니다 쉽고 빠르게 단위체 avidin 융합 단백질 및이 바인딩 BCG 표면에는 안정 되 고 세균성 성장 및 생존에 감지 변경 없이 재현할 수 나타났다. 또한, 우리가 발견 BCG OVA (AviOVA)와 융합 하는 단위체 avidin 장식 BCG에 의해 유도 된 저것과 유사한 면역 반응을 일으킬 수 있다 유전으로 동일한 항 원 표현 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. 이 기술은 세균성 표면에 관심사의 단백질의 가역 디스플레이의 따라서 전통적인 유전자 전송 접근법의 효과적인 보충 이며 BCG의 광범위 한 조작 및 백신에 추가 응용 프로그램을 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 개발입니다.

<table><tbody><tr><td>내독소가 없는 RPMI 1640</td><td>StemCell 기술&nbsp;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS 비오틴</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer&nbsp;</td><td>MBL 인터내셔널&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON 폴리히스티딘-태그 정제 수지&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 공액 쥐 안티-마우스 CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 쥐 안티 마우스 IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 쥐 안티 마우스 I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 쥐 안티 마우스 CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE 쥐 안티 마우스 CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 쥐 안티 마우스 H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated goat anti rabbit 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 rat anti-mouse CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>초소형 금 접합 염소 안티 토끼 IgG</td><td>전자 현미경 과학</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 국물</td><td>BD 진단 시스템</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD 진단 시스템</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>트윈 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 쥐 대식 세포 세포주</td><td>미국식 Culture Collection</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDEST17 플라스미드&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-OVA 플라스미드&nbsp;</td><td>진스크립트</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP 클로나제&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR 클로나제&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>pDONR221 플라스미드</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 컬럼&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>피어스 단백질 농축기&nbsp;</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II 에피플루오레센스 현미경</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 디지털 카메라&nbsp;</td><td>Retiga EX, QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV 전자 현미경&nbsp;</td><td>FEI Company</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&뮤; m 팔콘 셀 스트레이너&nbsp;</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>EasyStep 마우스 비오틴 양성 선택 키트&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotin-Ter119/Ertyroid 세포 항체</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 키트&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem 발광계&nbsp;</td><td>Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6 마이크로톰</td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500 동결 건조기</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton boroscilicate 유리 바이알</td><td>Wheaton</td><td>&nbsp; 폭스바겐 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis bcg 백신에의 표현

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

결핵 (TB)는 심각한 전염 성 병과 사용 가능한 백신 M. bovis 균 메 게 랭 (BCG)는 안전 하 고 효과적인 어린이 심한 결핵 수 막 염과 결핵 전파의 일부 형태에 대 한 보호 하지만 보호 하기 위해 실패 폐 결핵에 대 한 질병의 가장 일반적인 형태입니다. 현재 BCG를 개선 하기 위해 유망 전략 immunodominant M. 결핵 (Mtb)를암호화 하는 유전자와 그것의 전이 의존-특정 항 원 또는 항 원 자극 하는 것이 공동 요소를 인코딩 하는 유전자와 보완성 셀을 제시. 이러한 접근을 주요 한계는 낮은 효율, 낮은 안정성, 그리고 불확 실한 식 벡터의 안전 수준을 포함합니다. 이 연구에서 우리는 백신 개선, BCG 보완성의 해당 유전자를 인코딩 하는 플라스 미드와 변환 보다는 박테리아의 표면에 대 한 관심의 외 인 단백질로 구성 된 다른 접근 방법 제시. 첫째, 관심사의 단백질은 표현 융합 표준 대장균 에서 단위체 avidin 식 시스템 biotinylated BCG의 표면을 장식 하는 데 사용 하는 고. 동물 실험 꾸며져 대리 ovalbumin 항 BCG 표면을 사용 하 여 수정 된 박테리아는 완벽 하 게 면역성 및 특정 T 세포 응답을 유도 할 수 보여줍니다. 모두, 여기에 강력 하 게 제시 하는 데이터 외 인 핵 산 보완성의 힘 드는 전통적인 접근 방식을 대체 현재 BCG 백신을 재편에 대 한 소설과 효율적인 방법을 지원 합니다.

위에서 설명한 일반 절차, BCG 표면 biotinylation와 대리 항 OVA와 장식의 타당성 시험 했다. 수정된 BCG의 immunogenicity 당시 에 비보를 테스트. 세균성 표면 biotin avidin 공상 항 세균성 고기에 감지 변경 없이 빠른 디스플레이와 쉽게 분류 됐다. 결과 수정된 BCG 항 프레 젠 테이 션 세포에 의해 효율적으로 섭취 하 고 쥐에 OVA-특정 면역 반응을 일으킬 수 있다.
단위체 avidin 퓨전 플라스 미드 및 단백질의 생성 한 식 플라스 미드 p17-Avi 단위체 avidin 융해 단백질을 생산 하는 데 사용할 게이트웨이 방법론과 호환 되도록 생성 되었습니다. OVA는 p17-Avi로 복제 및 대장균, 표현 순화 그리고 refolded ...

세균성 표면에 급속 한 항 원 디스플레이 대 한 새로운 기술, 표면 biotinylation 단위체 avidin와 퓨전에 관심사의 단백질에 노출에 의해 다음을 포함 하 제공 됩니다. 선택 된 항으로 BCG를 성공적으로 로드 표면 장식 전통적인 유전 접근을 대체할 수 있는 제안 그것의 immunogenicity를 향상 시킵니다.

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

이 절차의 전반적인 목표는 기존의 유전자 기반 접근 방식에 대한 대안으로 재조합 단백질을 사용한 표면 장식을 사용하여 마이코박테리움에서 표면 단백질을 발현하는 것입니다. 이러한 방법은 진균학(mycobacteriology) 분야, 특히 병원 상호 작용 및 백신 개발 분야에서 중요한 연구 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 잠재적인 간섭 요인 또는 항원 후보를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.그것은 까다롭고 시간이 많이 걸리는 전통적인 유전 기반 접근 방식과 빠르게 비교될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 조교인 Amina Talal입니다. 프로토콜의 이 부분은 P17 Aviden OVA 플라스미드를 E.Coli BL21로 변환하는 것으로 시작합니다.이를 위해 섭씨 37도에서 3시간 동안 IPTG로 250ml의 E.Coli BL21 배양을 유도합니다. 3시간 후, 먼저 유도된 BL21 배양액을 펠릿화하고 상층액을 폐기하여 박테리아를 용해시켜 봉입체를 용해시킵니다. 그런 다음 펠릿을 10ml의 용해 완충액에 다시 현탁시키고 세포를 15분 동안 용해시킵니다.그런 다음 교반을 위해 회전자를 사용하여 실온에서 배양을 계속하고 밤새 그대로 두십시오. 아침에 혼합물을 30 분 동안 원심 분리하십시오. 그런 다음 가용화된 봉입체를 포함하는 상등액을 수집합니다.다음으로 니켈 NTA 컬럼을 사용하여 Aviden OVA 단백질을 정제합니다. 먼저 상층액을 lysis buffer에 1-2 희석하고 부피를 추정합니다. 그런 다음 희석된 상등액 250ml당 4mL의 니켈 NTA 수지가 들어 있는 컬럼을 준비하고 희석액을 컬럼에 로드합니다.다음으로, 세척당 pH 7에서 10ml의 용해 완충액을 사용하여 컬럼을 세 번 세척합니다. 재조합 단백질을 수집하려면 이미다졸이 포함된 용해 완충액으로 컬럼을 세척하고 용리액을 수집합니다. 재조합 단백질에 봉입체가 없는 경우 다음은 당사 실험실의 많은 단백질에 적합한 절차입니다.먼저, 재접힘 용액의 pH를 단백질의 등전점보다 한 단위 높거나 낮게 조정합니다. 다음, 점차적으로 refolding 해결책에 있는 1에서 10 희석에 단백질을 와류로 그리고 묽게 하십시오. 그런 다음 자석 교반기에서 단백질을 실온에서 30분 동안 배양하여 다시 접는 과정을 완료합니다.다음으로, 탈염 및 완충액은 단백질 농축기를 사용하여 다시 접힌 단백질을 PBS로 교환합니다. 그런 다음 컬럼을 원심 분리하고 용해성 단백질의 알로콰트를 섭씨 20도에서 보관합니다. BCG는 레벨 2 병원체이므로 개인 보호 장비를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 작업하십시오.BCG 세포의 표면을 비오틴화하려면 먼저 셰이커 플랫폼에서 세포를 적절한 밀도로 성장시킵니다. 약 10억 개의 세포를 수집하고 500마이크로리터의 얼음처럼 차갑고 내독소가 없는 PBST를 사용하여 세 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 멸균된 내독소가 없는 PBS에 현탁시킵니다.다음으로, 멸균 여과수에 신선한 10밀리몰 sulfo-NHSSS 비오틴을 준비합니다. 그런 다음 0.5 밀리몰의 설포-NHSSS 비오틴을 함유한 1밀리리터의 육수에 박테리아를 배양합니다. 실온에서 30분 동안 배양을 수행합니다.다음으로, 이전과 같이 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBST로 현재 라벨링된 박테리아를 세 번 세척하여 반응하지 않은 시약을 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 PBST 1ml에 다시 현탁시킵니다. 비오틴화 효율을 평가하기 위해 1억 개의 비오틴화된 BCG를 25마이크로리터의 스트레프라비딘-FITC로 염색합니다.그런 다음 염색된 박테리아를 파라포름알데히드로 잠시 배양한 다음 유세포 분석을 사용하여 비오티닐화 수준을 측정합니다. 비오틴화된 마이코박테리아의 성장과 생존을 평가한 후 Aviden 융합 단백질을 이들에 결합하는 작업을 진행합니다. 먼저, 5억 개의 비오틴화된 BCG를 Aviden 융합 단백질과 혼합하여 최종 농도를 1밀리리터당 10마이크로그램의 단백질로 만듭니다.이 반응을 셰이커의 실온에서 한 시간 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBST로 박테리아를 세 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 20분 동안 토끼 항-Aviden 항체로 박테리아를 염색합니다.20분 후 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBST로 세척 단계를 한 번 수행합니다. 그런 다음 FITC-conjugated goat anti-rabbit IGG 항체로 박테리아를 염색합니다. 다음으로, 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBST를 사용하여 박테리아를 세척하고 유세포 분석으로 박테리아를 분석하여 표면 장식을 평가합니다.설명된 프로토콜을 따른 후, 세포학은 비오틴화된 박테리아에 대한 OVA 결합의 최소 수준과 비오틴화된 박테리아에 대한 OVA 결합의 상당한 수준이 있음을 보여줍니다. 중요한 것은 박테리아 표면의 Aviden OVA 수치가 동결 건조 및 실온에서 보관 후 한 달 후에도 안정적으로 검출 가능했다는 것입니다. 다음으로, RAW 세포와 dsRed 박테리아를 사용하여 식세포작용 분석을 수행했습니다.다행히도, 대식세포 표현형에는 억제력이 없었습니다. Aviden OVA가 대식세포 내에서 BCG의 운명을 장식한 것을 검사하기 위해 부착된 RAW 세포를 감염시키고 형광 현미경으로 검사했습니다. Aviden OVA는 박테리아 표면에만 존재하는 것이 아니라 박테리아에서 멀리 떨어진 세포질로 분리 및 전이되었습니다.면역-금 염색 실험에 따르면 Aviden OVA 항원은 BCG 표면에서 분리되어 식체막을 가로질러 세포질로 이동할 수 있습니다. Aviden OVA BCG에 감염된 대식세포는 Avi OVA와 IA 분자의 공동 국소화를 보여주었습니다. 이는 Aviden 융합 단백질이 MHC2 분자에 적재될 항원 발표 구획으로 분리 및 전이됨을 시사합니다.Aviden OVA 펩타이드는 또한 H2K 염색에서 볼 수 있듯이 BCG 식체(phagosome) 내에서 클래스 I 분자와 공동 국소화되었습니다. 따라서, 대식세포에 의해 CD8 양성 T-세포에 Avi OVA 항원이 제시될 가능성이 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마이코박테리아에서 단백질을 발현하는 방법과 이 유기체는 현재 유전 방법으로 조작하기 어려운 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술이 끝나면 이를 사용하여 마이코박테리아 항원이 6인 백신을 로드하는 데 성공했습니다. 그런 다음 변형된 백신이 마우스 모델에서 특정 면역 반응으로 사용할 수 있는 기회임을 보여주었습니다. 우리는 현재 테라틴에서 이 접근법을 탐구하기 위해 협력하고 있습니다: 우리는 선택된 항원 또는 면역 인자와 함께 업그레이드된 BCG를 사용할 것을 제안했습니다.

expression-exogenous-antigens-mycobacterium-bovis-bcg-vaccine-via-non

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 mycobacteria의 열거에 대한 대안적인 접근 방식을...

Mycobacteria의 가능성을 측정하는 기능 전체 혈액 분석은 리포터 - 진 BCG 또는 M. TB (BCG 태그 사용 럭스 / M. TB 럭스)

이 비디오는 마취된 마우스의 전신 염증 유발을 보여줍니다. 마이코박테리아 항원 보조제 디포의 주입은 사이토카인 방출 및 국소 염증을 유발합니다. 림프관이 열려 면역 세포가 림프절로 들어갈 수 있게 되고 T세포가 활성화되어 전염증성 사이토카인을 방출하여 광범위한 염증을 유발합니다.

쥐 모델에서 전신 염증을 유발하기 위한 박테리아 항원의 피하 주사

이 동영상은 생물 발광 분석 및 집락 형성 단위 열거를 사용하여 Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux 접종물의 준비 및 정량화를 보여줍니다. 준비된 접종물은 감염 연구에 사용할 수 있습니다.

감염을 위한 Mycobacterium bovis BCG lux 접종물의 준비 및 정량화

이 동영상은 다가 표시 외막소포체(OMV) 백신을 생성하는 방법을 보여줍니다. 포유류 세포는 SpyTag 및 폴리히스티딘 태그에 융합된 바이러스 항원을 발현하고 분비하기 위해 transfection됩니다. 그런 다음 이러한 항원은 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화성 컬럼을 사용하여 정제됩니다. 정제된 항원은 표면 결합 SpyCatcher(SC) 단백질을 발현하는 외막 소포와 혼합됩니다. 여러 항원이 SpyTag(ST)를 통해 SpyCatcher에 공유 결합되어 항원을 표시하는 OMV를 생성하여 다가 백신 역할을 합니다.

다가 표시 외막 소포 백신 생성

이 비디오는 Mycobacterium bovis BCG에 항원을 적재하여 면역원성을 개선하는 기술을 보여줍니다. 이 방법은 avidin-biotin 시스템을 사용하여 박테리아 표면을 외인성 항원으로 코팅합니다.

Mycobacterium bovis BCG에서 표적 항원을 제시하기 위한 Avidin-Biotin 접합 기술

장기 배양 인터페론 γ 효소 - 결합 된 Immunospot 분석은 중앙 메모리 응답의 척도로서 사용하고 보호 항 미코 박테리아 백​​신 응답과 상관된다. 이 분석을 통해, 말초 혈액 단핵 세포는 마이코 박테리아 항원과 인터루킨 -2 14 일 동안 활성화, 분화 및 중앙 메모리 T 세포의 확장을 자극.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

본 문서에서는 마우스 모델에서 BCG를 사용하여 비강 내 및 피하 면역에 의해 유도된 보호 효능 및 폐 면역 반응을 비교하기 위해 따랐던 방법론을 자세히 설명합니다. 본 연구의 결과는 폐 백신 접종의 이점을 보여주며, 백신 유도 보호에서 IL17 매개 반응의 역할을 시사한다.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund's adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

학습하세요 진균 bovis BCG 백신에 재조합 단백질을 이용한 표면 장식 기법으로 유전자 기반 방법의 대안을 제공합니다. 이 방법은 마이코박테리올로지 및 백신 개발 연구에 활용됩니다.

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

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