주의 골 기능 재생성 된 대 퇴 골으로 이어지는 쥐 모델에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜
2017년 10월 23일
이 연구는 재현 하 고 상세한 프로토콜 사용 하 여 새로 개발된 된 외부 fixator 산만 골에 대 한 (할) 대 퇴 쥐에 모델 외부 fixator의 제거 후에 동물에 의해 체중 베어링 생리는 허가 설명 합니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 기능적 뼈 재생을 평가하기 위해 쥐 모델에서 대퇴골 산만 골형성을 재현적이고 효율적으로 유도하는 것입니다. 이 방법은 골형성 의학 분야에서 유고 기간을 결정하고 단축하는 것 또는 뼈 복구 메커니즘을 확인하는 것에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 외부 고정기를 만든 사람과 수술을 하는 사람을 안내하고 최적의 뼈 재생을 위한 안정적인 환경을 제공하는 데 매우 중요합니다.
이 기술의 의미는 뼈 종양 절제 수술 후 발생하는 모든 치료적 상지 및 하지 연장 또는 뼈 결함으로 확장됩니다. 이 절차의 시연은 제 연구실의 약학 강사인 에두아르 라미(Edouard Lamy)가 진행했습니다. 마취된 12주 된 수컷 Sprague Dawley 쥐를 왼쪽 측면 위치에 놓고 오른쪽 뒷다리의 털을 제거하는 것으로 시작합니다.
안연고를 바른 후 포비돈 요오드 용액으로 수술 부위를 소독하고 동물을 누운 자세로 눕힙니다. 외부 고정 장치를 내측 축을 따라 위치시킨 상태에서 마커를 사용하여 시상면의 내측선을 따라 무릎에 한 점을, 엉덩이에 두 번째 점을 만듭니다. 두 점을 연결하고 메스를 사용하여 선을 따라 피부를 절개하고 대퇴골이 완전히 노출될 때까지 대퇴 이두박근과 광대 외측 사이를 자릅니다.
골막을 들어 올리고 루진을 사용하여 뼈에서 연조직을 분리합니다. 외부 고정 장치의 가장 근위 및 원위 구멍에 핀을 삽입합니다. 두 핀을 모두 고정할 수 있는 경우 두 개의 Senn 견인기를 사용하여 근육을 열고 대퇴골 중간에 있는 드릴 가이드의 클램프를 조이고 근위 및 원위 구멍에서 시작하여 중간 두 개의 구멍으로 마무리하고 금속 0.6mm 드릴 비트를 뼈에 통과시켜 4개의 가이드 구멍을 만듭니다.
0.8mm 반나사산 핀을 사용하여 핀을 앞뒤로 움직여 대퇴골에 수직을 유지하도록 주의하면서 4개의 사전 구멍을 확대합니다. 핀을 이식하려면 바늘 홀더를 사용하여 각 1mm 반나사산 핀의 머리를 잡고 핀을 개별적으로 가라앉혀 가이드 구멍을 확대합니다. Senn의 견인기를 사용하여 핀이 1mm 이상 돌출되지 않고 두 피질을 모두 관통하는지 확인합니다.
핀이 제자리에 있으면 외부 고정 장치를 절반 나사산 핀에 연결하고 오프셋이 약 6mm인지 확인하여 쉽게 재봉하고 강성을 높일 수 있습니다. 그런 다음 외부 고정 장치가 핀에 잠기도록 4개의 잠금 나사를 고정합니다. Piezotome을 사용하여 두 개의 중앙 핀 사이에 절골술을 수행합니다.
그런 다음 Mayo-Hegar 바늘 홀더, 재흡수성 5-0 봉합사 및 연속 스티치를 사용하여 상처를 봉합합니다. 수술 직후 동물을 엑스레이로 촬영하여 핀의 깊이와 장축을 따라 골절술된 사지의 정렬을 확인합니다. 그런 다음 모니터링을 통해 쥐가 완전히 회복할 수 있도록 합니다.
일주일 후, 팔다리를 엑스레이로 촬영하여 핀의 위치와 뼈 분절의 정렬을 다시 확인합니다. 주의를 산만하게 하려면 10일 동안 12시간마다 사각 너트를 시계 방향으로 반 바퀴 수동으로 돌립니다. 주의 산만 과정의 중간과 끝 부분에서 팔다리를 X-레이로 촬영하여 핀의 위치와 뼈 세그먼트의 정렬을 모니터링합니다.
산만함이 끝나면 매주 팔다리를 엑스레이로 촬영하고 64일째에 외부 고정 장치를 제거합니다. 66일째에는 메스를 사용하여 엉덩이 위쪽에서 무릎 앞쪽까지 수술 흉터를 통해 피부를 절개합니다. 대퇴골이 완전히 드러날 때까지 대퇴이두근과 광대박근 사이를 절단하여 뼈에서 근육을 최대한 분리하십시오.
무릎의 모든 인대를 자르고, 관절을 해체하고, 엉덩이의 관절낭을 자릅니다. 핀을 제거하지 않고 메스를 사용하여 연조직을 모두 제거하여 뼈를 철저히 청소하십시오. 반대쪽 대퇴골을 청소한 후 양쪽 대퇴골을 X-ray합니다.
핀을 제거하고 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 스캔 분석을 위해 대퇴골을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이 대표적인 실험에서 수술 직후부터 통합 종료까지 X선 영상은 대퇴골 핀 내의 절반 나사산 핀이 시술 내내 평행하고 잘 보존되며 풀리지 않은 상태로 유지되는 것을 보여주었으며 이는 안정적인 고정을 나타냅니다. 더욱이, 골절개된 사지(osteotomized departements)는 산만(distraction) 골형성 과정(osteogenesis process) 동안 뼈의 세로축을 따라 명확하게 잘 정렬되어 있었습니다.
잠복기가 끝날 무렵, 골절개된 사지 근처에서 석회화된 부위가 보이지 않았습니다. 주의를 산만하게 하는 기간이 끝날 무렵, 기존의 피질 가까이에서 몇 개의 석회화된 부위가 보였다. 통합 28일 후, 골절술된 사지 사이의 틈새의 석회화되지 않은 영역이 더 작아졌고, 핀과의 틈 수준 근처에서 골막 굳은살이 관찰될 수 있었습니다.
47일간의 응고 후, 재생하는 굳은살이 완전히 연결되었습니다. 외부 고정 장치를 제거하고 이틀 동안 생리적 체중 부하를 가한 후, 동물들은 생리학적 걸음걸이를 보였고 골절의 증거는 관찰되지 않았다. 재생 굳은살의 연속적인 세로 단면에 대한 3D 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석은 재생 굳은살의 주변에서 관찰되는 연속적인 외부 피질과 함께 석회화된 브리징이 항상 존재한다는 것을 보여주었습니다.
49일간의 통합 후, 재생된 굳은살의 중심에서 광물화가 덜 된 부위가 지속되었음에도 불구하고 골절은 관찰되지 않았습니다. 이 수술 기법은 일단 숙달되면 제대로 수행된다면 45분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 수술 중 무균 환경을 유지하고 수술 후 동물을 철저히 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
개발 후,이 기술은 의학 분야의 연구자가 특히 임상 실습에서 통합 기간을 단축하기 위해 산만 골 형성 기술을 개선 할 수있는 길을 열어줍니다. 이 절차에 따라 성장 인자 추가 또는 빌드 재료 추가와 같은 다른 방법을 수행하여 뼈의 응고를 개선할 수 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이러한 기술을 핀 간의 평행도를 보장하기 위한 지침으로 사용하여 쥐 모델에서 대퇴골 연장을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 연구는 새로 개발된 외부 고정기를 사용한 대퇴골 흰쥐 모델에서 점진적 골 신생(DO)에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 고정기 제거 후 생리적인 체중 부하를 가능하게 하여 기능적 골 재생의 평가를 용이하게 합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 골 재생
- 점진적 골 신생
- 동물 모델
배경
- 점진적 골 신생은 골격 기형을 재건하는 데 사용되는 외과적 과정입니다.
- 이 기술은 새로운 골 형성을 촉진하기 위해 골 부분을 점진적으로 이동시키는 것을 포함합니다.
- 골 치료 메커니즘을 이해하는 것은 임상 결과를 개선하는 데 중요합니다.
- 본 연구는 이러한 메커니즘을 효과적으로 탐구하기 위해 흰쥐 모델을 활용합니다.
연구 목적
- 대퇴골 점진적 골 신생을 유도하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 확립합니다.
- 통제된 환경에서 골 재생의 기능적 측면을 평가합니다.
- 골 치료의 집결 기간 및 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
사용된 방법
- DO를 위해 새로 개발된 외부 고정기의 사용.
- 12주령 수컷 Sprague Dawley 흰쥐 모델의 참여.
- 약학 강사에 의한 절차 시연.
- 수술 후 체중 부하 능력의 평가.
주요 결과
- 이 프로토콜은 점진적 골 신생의 효과적인 유도를 가능하게 합니다.
- 외부 고정기 제거 후 생리적인 체중 부하가 이루어집니다.
- 최적의 골 재생을 위한 안정적인 환경이 제공됩니다.
- 사지 연장 및 골 결손 수복에 대한 잠재적 영향이 있습니다.
결론
- 이 기술은 골 재생 연구를 위한 귀중한 도구입니다.
- 이는 골 신생 의학 분야의 발전으로 이어질 수 있습니다.
- 추가 연구를 통해 임상 환경에서의 응용을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol establishes a reproducible model for functional bone regeneration in rats, enabling preclinical evaluation of bone healing mechanisms and therapeutic interventions. By achieving physiological weight-bearing post-fixator removal, it provides a physiologically relevant system for assessing bone quality and structural integrity. The method supports target validation in osteoanabolic pathways and mechanistic de-risking of bone repair strategies prior to translational investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in bone regeneration by providing a controlled in vivo model to assess callus formation and cortical bridging.
- Operational Value: Offers standardized surgical and distraction parameters that reduce variability in preclinical bone healing studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative endpoints such as micro-CT-derived bone volume, mineral density, and cortical continuity for assay readouts.
- Operational Value: Supports development of reproducible imaging and biomechanical assays to evaluate compound effects on bone regeneration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models clinically relevant distraction osteogenesis for studying consolidation period shortening and bone defect repair.
- Operational Value: Provides a preclinical platform to test growth factors, biomaterials, or mechanical stimuli in a weight-bearing competent system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone anabolic agents and regenerative therapies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on molecular pathways involved in osteoblast activation and angiogenesis during distraction.
- Screening: Enables standardized preparation of bone regeneration models for high-fidelity compound screening.
- Analytics: Delivers quantitative micro-CT and biomechanical outputs that support cross-condition comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Aligns with clinical distraction osteogenesis applications, supporting preclinical continuity for limb lengthening and bone defect repair strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical and postoperative workflow for multi-program evaluation of bone-healing therapeutics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in bone regeneration outcomes through reproducible functional regeneration and weight-bearing capacity.
- Operational Value: Delivers a standardized, rigid external fixator system that improves surgical reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by enabling early functional assessment of bone quality in preclinical models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted go/no-go decisions for osteoanabolic programs based on structural and functional bone endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent orthopedic surgery, microsuturing, and external fixator application.
- Depends on access to precision drilling tools, half-threaded pins, and imaging equipment for pin alignment verification.
- Necessitates standardized postoperative monitoring and distraction scheduling to ensure consistent regeneration outcomes.
- Involves adaptation considerations when translating pin placement and distraction rates to other skeletal sites or species.
- Limited by the need for aseptic technique and prolonged postoperative care to prevent fixation failure or infection.
