성장과 재생산 꼬마 선 충 의 화학 물질의 효과 측정

이 절차의 전반적인 목표는 토포이소머라제 억제제인 에토포사이드(etoposide)와 같은 화학 물질이 모델 동물 Caenorhabditis elegans의 성장 및 번식에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 이 방법은 약물 개발을 위한 독성 평가 및 환경 독성 물질의 위험 평가와 같은 독성학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비 포유류 시스템에서 다양한 화학 물질의 독성을 확인할 수 있으므로이 기술이 편리하고 비용 효율적이라는 것입니다.

연은 제 연구실의 대학원생인 이소영 씨가 시연할 예정입니다. 시작하려면 한 병에 염화나트륨 0.6g, 펩톤 0.5g, 한천 3.4g, 증류수 195ml, 자기 교반기를 추가하여 깨끗한 200ml 유리병 2개를 준비합니다. 그런 다음 다른 빈 병에 자석 교반기를 추가합니다.

섭씨 121도에서 15분 동안 병을 고압멸균한 다음 섭씨 55도에서 30분 동안 수조에서 병을 식힙니다. 다음으로, 채워진 병에 염화 칼슘 1 몰 0.2 밀리리터, 콜레스테롤 1 밀리리터 당 5 밀리그램 0.2 밀리리터, 황산 마그네슘 1 몰 0.2 밀리리터, 인산 칼륨 1 몰 5 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 55도의 핫 플레이트에서 자기 교반으로 용액을 혼합합니다.

혼합된 NGM 배지의 절반을 빈 200ml 병에 붓습니다. 그런 다음 한 병에 1ml의 DMSO를 넣고 자기 교반을 사용하여 다시 혼합합니다. 다른 병은 섭씨 55도의 수조에 보관하십시오.

그런 다음 3밀리리터의 DMSO 함유 중간에서 35 x 10밀리미터 페트리 접시를 분취합니다. 수조에서 다른 병을 제거하고 자기 교반을 사용하여 혼합합니다. 그런 다음 75밀리몰 에토포시드 1ml를 추가합니다.

그리고 다시 혼합한 후 부분 표본 절차를 반복합니다. 화학 물질이 함유된 NGM 플레이트를 약 3시간 동안 실온에 두어 냉각시킨 후 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 화학 테스트를 위해 각 NGM 플레이트에 100마이크로리터의 열 비활성화 E.coli OP50을 펴 바릅니다.

플레이트를 섭씨 20도의 C.elegans 인큐베이터에서 밤새 건조시킵니다. 연령 동기화된 예쁜꼬마선충 난자를 1%DMSO 또는 750마이크로몰 에토포시드가 보충된 NGM 플레이트로 옮깁니다. 예쁜꼬마선충을 섭씨 20도의 인큐베이터에 4일 동안 넣습니다.

매일 실체 현미경으로 예쁜꼬마선충의 현미경 이미지를 관찰하고 촬영하십시오. 또한 지렁이 크기 보정을 위해 현미경 스테이지 마이크로미터의 현미경 이미지를 촬영합니다. 각 시점에서 DMSO 또는 에토포시드로 처리된 예쁜꼬마선충의 몸 길이를 측정하려면 ImageJ에서 현미경 스테이지 마이크로미터 이미지를 엽니다.

그런 다음 직선 도구를 사용하여 이미지에서 1, 000마이크로미터의 선을 드래그합니다. 분석을 클릭한 다음 축척 설정을 클릭하고 알려진 거리 상자와 길이 단위 상자에 각각 1, 000 및 마이크로미터를 입력합니다. 그런 다음 글로벌을 선택하고 확인을 클릭합니다. File(파일)을 사용하여 웜 이미지를 연 다음 Open(열기)을 사용합니다.

그런 다음 Freehand Line 도구를 사용하여 각 웜의 특징을 따라 선을 그립니다. Analyze(분석)를 클릭한 다음 Measure(측정)를 클릭하여 체장 데이터를 가져옵니다. 50개의 웜에 대해 이 단계를 반복합니다.

DMSO 또는 에토포시드가 포함된 NGM 플레이트에서 연령 동기화된 난자를 섭씨 20도에서 성년이 될 때까지 64시간 동안 부화시킵니다. 5마리의 성충을 화학 물질이 없는 새 NGM 플레이트 또는 동일한 화학 전처리가 포함된 새 NGM 플레이트로 옮기고 24시간 동안 배양합니다. 방금 시연한 것처럼 성충을 새로운 NGM 플레이트로 옮기고 매일 난자 수를 세십시오.

또한 기어 다니거나, 죽거나, 내부적으로 부화한 벌레의 수를 세십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 계산을 수행합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 24-96 시간에 에토포시드를 처리하면 예쁜꼬마선충의 성장이 현저히 지연되었습니다.

96시간의 배양 후, 에토포사이드 처리된 기생충은 몸길이가 0.86mm로 자랐고, 차량 처리된 기생충은 1.04mm로 자랐다. 성장 지연은 또한 대조군 처리된 벌레와 비교하여 에토포사이드(etoposide)로 처리된 벌레의 이미지에서 볼 수 있듯이 실체 현미경 관찰에서 관찰되었습니다. 72시간의 배양 후, 차량에서 처리된 기생충의 알이 관찰되었습니다.

대조적으로, 에토포사이드 처리 96시간 후에 난자가 관찰되어 에토포사이드 처리가 C.Elegans의 첫 출산 시간을 지연시켰을 가능성을 제기했습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, 에토포시드 처리에 의한 총 난자 수의 감소는 지속적인 에토포사이드 처리의 유무에 관계없이 어린 성충을 배양할 때 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 모델 선충인 예쁜꼬마선충의 화학적 독성을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.