전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

이 프로토콜은 꽃봉오리, 꽃 및 어린 빙송을 적절하게 해부하는 방법을 설명합니다. 그리고 다양한 염색 및 관찰 기술을 위한 후속 전체 장착 투명화. 이 방법은 성 식물 생산 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

꾸준히 돌연변이 분석 또는 꽃의 발달 및 기능에 대한 환경 및 실험적으로 유도 된 실패와 같은. 이 기술의 주요 장점은 여러 발달 단계를 동시에 쉽고 빠르게 선별할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 꽃 기관 해부 단계가 꽃 해부학 및 해부 기술에 대한 사전 지식이 필요하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

시작하려면 작은 가위를 사용하여 동기화 된 식물에서 꽃을 제거하십시오. 그리고 즉시 적절한 고정제가 들어 있는 개별 미세 원심분리기 튜브에 넣으십시오. 다음으로, 정착액을 제거하고 샘플을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 70% 에탄올을 첨가합니다.

샘플을 최소 24시간 동안 섭씨 4도로 되돌립니다. 그런 다음 시계 제작자의 잔에 갓 만든 70% 에탄올을 채우고 작은 페트리 접시에 넣어 지지합니다. 그런 다음 꽃차례를 시계 제작자의 유리에 넣고 에탄올로 완전히 덮여 있는지 확인합니다.

집게와 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 꽃받침, 꽃잎 및 수술을 찢어 실체 현미경으로 꽃을 해부합니다. 그런 다음 시계 제작자의 유리를 한쪽에 놓고 유리 슬라이드를 사용하여 최종 해부를 합니다. 샘플을 슬라이드로 이동하고 갓 만든 10% 에탄올 70마이크로리터를 추가합니다.

손목의 양쪽을 자르고 필요에 따라 회전시킵니다. 그런 다음 밸브를 부드럽게 제거하여 난자를 노출시킵니다. 용기에서 전달 조직의 절반을 분리하기 위해 날카롭게 작게 자르고 집게와 바늘을 사용하여 두 반쪽을 찢습니다.

스티그마 스타일과 꽃자루를 날카로운 컷으로 제거합니다. 집게와 바늘을 사용하여 아직 붙어있는 난자를 부드럽게 뒤집고 배열하여 두 개의 평행 한 줄을 얻습니다. 작은 블로팅 페이퍼를 사용하여 유리 슬라이드의 샘플에서 에탄올을 제거합니다.

그런 다음 슬라이드에 20마이크로리터의 세척 용액을 추가합니다. 피하 주사 바늘이 있는 주사기를 사용하여 표본을 배치하고 남아 있는 기포를 제거합니다. 다음으로, 커버 슬립을 슬라이드에 부드럽게 놓고 세척 용액이 커버 슬립과 샘플 사이의 공간을 채울 때까지 기다립니다.

슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 흄 후드 아래에 두십시오. 그러니 갓 수확한 꽃봉오리는 탈염되지 않은 꽃밥으로 열리려고 합니다. 그런 다음 꽃봉오리가 완전히 잠길 수 있도록 충분한 Alexander 용액이 포함된 96웰 플레이트를 준비합니다.

꽃받침과 꽃잎을 제거하여 꽃밥을 노출시키고 알렉산더 용액에 담그십시오. 접시를 흄 후드 아래에 1-3시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 Alexander 용액을 Herr의 4.5 용액으로 교체하고 흄 후드 아래의 플레이트를 밤새 배양합니다.

다음날 집게를 사용하여 깨끗한 새싹을 새 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로 수술을 절개하고 샘플에서 다른 모든 조직을 제거합니다. 그런 다음 Herr의 4.5 용액을 사용하여 클로랄 수화물 기반 세척 및 복합 세척 염색을 진행합니다.

먼저 시계 제작자의 유리에서 슬라이드로 꽃을 옮기고 압지를 사용하여 과도한 에탄올을 제거합니다. 5-10 마이크로 리터의 DAPI 솔루션을 추가하십시오. 피하 주사 바늘이 달린 주사기 2개를 사용하여 수술을 절개하고 다른 모든 꽃 기관을 제거합니다.

그런 다음 꽃가루 알갱이를 DAPI 용액으로 방출합니다. 슬라이드에서 수술의 모든 파편을 제거하고 슬라이드에 꽃가루 알갱이만 남도록 합니다. 슬라이드에서 수술 파편을 모두 제거하는 것이 진탕 제거를 위한 가장 중요한 단계입니다.

슬라이드와 커버 슬립 사이에는 꽃가루 알갱이만 남겨야 합니다. 다음으로, 시편 베어링 슬라이드에 커버 슬립을 놓고 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공간을 채우는 데 필요한 최소한의 DAPI 용액을 추가합니다. 검지 손가락을 커버 슬립에 부드럽게 놓고 빠르고 짧게 미끄러지는 움직임을 만듭니다.

슬라이드를 사람 상자에 넣어 섭씨 4도의 어둠 속에서 최소 15분 동안 놓습니다. 그런 다음 24시간 이내에 광시야 형광 또는 컨포칼 현미경 아래에서 슬라이드를 관찰합니다. 시계 제작자의 유리에서 해부된 샘플을 1% SDS와 0.2 수산화나트륨 용액으로 채워진 구멍이 있는 유리판으로 옮깁니다.

실온에서 밤새 배양하십시오. SDS 수산화나트륨 용액은 샘플을 빠르게 제거하여 몇 분 안에 투명하게 보이게 합니다. 샘플을 물로 조심스럽게 헹구고 깨끗한 슬라이드에 놓습니다.

그런 다음 슬라이드에 20-40 마이크로 리터의 염색 용액을 첨가하십시오. 분석할 꽃 기관과 연구자의 기술에 따라 이 DS 치료는 숙련된 연구자의 경우 해부 전에 수행될 수 있으며 경험이 적은 연구자의 경우 해부 단계 후에 수행될 수 있습니다. 그런 다음 준비물이 부서지지 않도록 주의하면서 덮개 슬립을 슬라이드에 놓습니다.

그런 다음 준비된 모든 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮인 인간 상자에 넣고 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 광시야 형광 또는 컨포칼 현미경 검사에서 표본을 관찰합니다. 프로토콜에 설명된 해부 절차에 따라 관찰을 방해할 수 있는 불필요한 조직을 제거하고 보다 상세한 이미지를 얻을 수 있습니다.

목적에 따라 클로랄 수화물 염색을 사용하여 전체 꽃봉오리 수준에서의 조기 꽃 발달, 꽃밥의 감수분열 및 미세 gomedal 발생, 초기 배주 발달 및 거대포자 모세포의 사양화, 암컷 go-med-ified 발달 또는 중앙 그리드의 꽃가루관 침입을 특성화할 수 있습니다. Alexander staining과 Herr의 four and half clearing을 결합하면 주어진 locule 또는 꽃밥 전체 내에서 꽃가루 유산을 평가할 수 있습니다. 생존 가능한 꽃가루 알갱이는 붉은 세포질을 나타내지만, 중단된 꽃가루 알갱이는 빈 세포질을 나타내며 결국 불규칙한 모양으로 완전히 부서집니다.

엑신(exine)을 제거하면 핵의 염색 강도가 증가하고 염색질 조직의 세부 정보가 높아집니다. 염색 전에 SDS 수산화 나트륨 세척을 사용하여 꽃차례를 투명하게 만들었습니다. 그리고 꽃 조직 내에서 칼로스의 염색이 더 높았습니다.

그것은 일반적으로 칼로스 축적을 보기 어렵다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어 생식 세포와 식물 세포를 분리하는 Callose 층과 같습니다. 꽃가루 알갱이가 꽃밥 안에 아직 들어 있을 때조차도.

이러한 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 48시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 결과는 적절한 고정제 사용, 적절한 해부 수행, 슬라이드에서 관심 조직 분리와 같은 우수한 샘플 준비에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.