Name: 전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 학습하세요 Arabidopsis 꽃봉오리와 어린 silique의 전체-마운트 클리어링 및 염색 기법을 이용한 생식 기관 관찰 방법을. 이 기법은 식물 발달 생물학 연구와 유전자 기능 분석에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 취리히 대학, IEF 마리 퀴리 그랜트에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. 아에 TransEpigen-254797), 유럽 연구 위원회의 고급 부여 (부여 없음. U.G.를 MEDEA-250358), 그리고 SystemsX.ch, 시스템 생물학에서 스위스 이니셔티브에서에서 연구 및 기술 개발 프로젝트 (그랜트 U.G.에 MecanX).

1. 꽃과 Silique 고정
<ol><li>수확 꽃과 식물에서 siliques 첫 번째 꽃의 개통에 동기화. 참고: 여기에 사용 된 실험 조건에서 식물 시작 重와 Skoog (MS)에서 토양에 이식 후 약 21 일 꽃. 씨앗은 4 ° C에서 3-4 일에 대 한 층 화와 출 아 했다/성장 22 ° C/16 h 빛과 18 ° C/8 h에서 MS 접시에 어두운 (그림 1) 동일한 조건 하에서 보관 하는 냄비에 영양분이 풍부한 토양에 묘 종을 이식 하기 전에 8 ~ 10 일 동안. 복제의 수는 특정 연구 목적에 따라 달라 집니다 하지만 각 치료에 대 한 (5 개별 공장)에서 5 inflorescences의 최소 권장 합니다. 꽃은 실험 단위, 복제 당 10 꽃의 최소 권장 합니다.</li>
	<li>Inflorescences 또는 꽃 (그림 1E-H) 작은 위 (예를 들어, 손톱이 위)를 사용 하 여 자르고 (단일 화 서/꽃 고정)을 위한 microcentrifuge 튜브 또는 (대 한 집단 fixations) 원뿔 튜브에 즉시 배치 Carnoy의, 메탄올/아세트산, 또는 FPA50 fixatives 만든 갓 포함 하는 응용 프로그램에 따라 참조 아래 얼음에. 참고: 샘플 해야 합니다 수 완전히 침수는 정착 제에.</li>
	<li>4 ° c.에서 하룻밤에 4 h에 대 한 정착 액 내 조직을 두고합니다 참고: 진공 침투는 조직으로, 속도 정착 액의 침투를 위해 사용 될 수 있지만이 조직의 구조를 보존 될 수 있습니다. 저자는 진공 침투를 구현 하지 마십시오.</li>
	<li>정착 액 제거 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 70% 에탄올을 추가 하 고 적어도 24 h; 4 ° C에 게 반환 샘플이이 솔루션에서 무기한으로 유지할 수 있습니다. 에탄올을 제거한 후 바로 다음 단계로 진행 합니다; 해 부, 또는 SDS 개간입니다.</li>
</ol>2입니다. 아래는 Stereomicroscope 해 부
<ol><li>넣어 갓 지원 위한 작은 페 트리 접시에 배치 하는 시계 메이커의 유리에 70% 에탄올을 했다.</li>
	<li>
장소는 화 서/꽃/silique이에 갓 정착 액 고 바늘으로 집게와 주사기를 사용 하 여 stereomicroscope에서 해 부.
	<ol>
<li>시계 메이커의 유리 또는 에탄올 (권장) inflorescences의 해 부 및 찢 어 떨어져 성숙한 꽃 (sepals, 꽃잎, 오시 수 있습니다가이 단계에서 해 부의 꽃 기관으로 완전히 덮여 수 샘플을 허용 하는 유사한 장치를 사용 하 여 )을 밖으로 건조 하는 샘플의 위험을 피하기 위해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
아래 설명 된 대로 siliques 및 슬라이드에 작은 꽃 봉 오리를 해 부.
	<ol>
<li>사전 처리 샘플 시계 메이커의 유리를 치워 고 최종 해 부에 대 한 정상적인 슬라이드를 사용 합니다.</li>
		<li>슬라이드에 관심의 샘플을 이동 하 고 신선한 70% 에탄올의 10 µ L를 추가 합니다. 최종 해 부에 신속 하 게 작업 하 고 샘플 과도 한 액체 없이 촉촉한 유지에 필요한 경우 에탄올, 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>Stamens에서 꽃가루 곡물 방출 단계 5.1 참조. Carpels 및 ovules 해 부를 위해 그림 2에 설명 된 절차를 따릅니다. 이 절차는 심 피, 녹색 siliques의 발달의 단계 등의 개발의 모든 단계에 적용 됩니다. 참고: 샘플; 이동에서 충분 한 에탄올 이성 경우 에탄올을 추가 하지 마십시오 아주 작은 샘플을 해 부 하는 것은 액체의 최소한에 훨씬 쉽게입니다. 항상 슬라이드에만 관심 (sepals, 꽃잎, stamens, carpels, ovules, 씨앗, 또는 꽃가루 곡물)의 장기 유지. 이 이렇게는 슬라이드와 시험, 결과 높은 동질성, 그리고 따라서 현미경 검사 (높은 수 대상 표본에 대 한 효율에 따라 장기의 두께 해당 하는 coverslip 간의 균일 한 두께 보장 한다 에 동일한 초점 비행기).</li>
	</ol>
</li>
	<li>압 종이의 작은 조각을 사용 하 여 흡수 하 고 가능한 많은 에탄올을 제거. 신속 하 게 밖으로 샘플 건조 하기 전에 (섹션 3, 4, 또는 6) 다음 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>3. Chloral 하이드 레이트-기반 개간 및 결합 된 개간 얼룩
참고: 개간 chloral 하이드 레이트-기반에 대 한 최상의 결과 얻으려면 FPA50 소재 고정으로 얻을 수 있습니다.
<ol><li>솔루션을 비운의 장소 20 µ L (chloral 하이드 레이트/글리세롤, 수정 Hoyer의 매체, 하느님의 4½, 또는 하느님의이 키 4½ 솔루션) 견본-베어링 슬라이드에. 그들 사이 공간을 줄이고 그 대칭 이동 하 여 필요한 경우는 표본 위치 hypodermal 바늘, 주사기의 쌍을 사용 하 여 관심의 기관 아래쪽으로 직면 하는 곳. 바늘을 사용 하 여 모든 나머지 공기 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>옆으로 coverslip 낮은 고 부드럽게, 매우 부드럽게 눌러 놓고 개간 솔루션 사이는 공간을 채우는 때까지 기다립니다. 아래는 coverslip 전체 공간을 채우기 위해 필요한 경우 최소한의 개간 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 증기 두건에서 그것을 두고. 적어도 4 h 후와 다음 4-5 일 동안 현미경 관찰으로 이동 합니다.</li>
</ol>4. 알렉산더 얼룩과 하느님의 4½ 개간 Anthers의 결합
참고: 원래 알렉산더 프로토콜 기반으로 얼룩이 지기 전에 슬라이드에 꽃가루 곡물을 공개 합니다. 효율적이 고 더 유익한 수정 알렉산더 얼룩 지우기 절차 이며 성숙 하지만 비 dehiscent anthers 내 성숙한 꽃가루 곡물의 얼룩.
<ol><li>Dehiscent 비 anthers 오픈 하려고 갓 수확된 꽃 봉 오리를 선택 합니다. 참고: 알렉산더 얼룩이 지는 성숙한 꽃가루 곡물을 위한 효율적으로 미숙한 꽃가루 곡물을 얼룩이 되지 않습니다 때문에 어린 꽃 봉 오리를 복용 하지 마십시오. 치료에서 다른 식물과 inflorescences 수확 당 5 꽃의 최소 것이 좋습니다.</li>
	<li>꽃 봉 오리를 잠수함 충분 한 알렉산더의 솔루션과 96 잘 접시를 준비 합니다. anthers sepals 및 꽃잎을 제거 하 여 노출 하 고 알렉산더의 솔루션에서 그들을 담가. 1-3 h 연기 후드 샘플을 유지.</li>
	<li>하느님의 4½ 솔루션으로 알렉산더의 솔루션을 대체 하 고 야간 보육에 대 한 증기 두건에서 다시 다 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 부드럽게 새 슬라이드에 지운된 꽃 봉 오리 이동 합니다. 알렉산더의 솔루션의 일부 월 발생할 수 있습니다 이후 압 지를 사용 하 여 가능한 많은 청소 솔루션을 제거.</li>
	<li>Stamens를 해 부하 고 다른 모든 조직을 제거 합니다. 절의 하느님의 4½ 솔루션을 사용 하 여 3 단계를 따릅니다.</li>
</ol>5. 꽃가루 곡물에서 제거 하는 Exine
참고: DAPI 얼룩에 대 한 Carnoy의 정착 제를 사용 하 여 것이 좋습니다.
<ol><li>섹션 1과 2에에서 설명 된 고정 및 해 부 절차를 따릅니다. 지금까지, 한 70% 에탄올의 최소 금액 내에서 슬라이드에 많은 예를 하나 있어야 한다.</li>
	<li>압 지를 사용 하 여 초과 에탄올을 제거 하 고 DAPI 솔루션의 5-10 µ L를 추가 합니다. 바늘과 주사기의 몇을 사용 하 여, 그 작은 솔루션 (예를 들어, stamen와 꽃가루 곡물을 해제 하는 다른 고정에 사용 한 주사기) 내 꽃가루 곡물 놓습니다. 경우에 솔루션을 밖으로 마르면 DAPI의 또 다른 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Stamen 모든 파편을 제거는 중요 한 단계 같은 슬라이드와는 coverslip 사이 꽃가루 곡물만 남아 있습니다.</li>
	<li>coverslip 견본 베어링 슬라이드에 옆으로 낮추어 놓고 DAPI 솔루션 공간을 작성 하는 데 필요한 최소한의 금액을 추가 합니다. coverslip에 검지 손가락을 놓고 너무 부 수 없이 많은 게 빠르고, 회사, 그리고 짧은 운동 슬라이딩 합니다. 참고: 필요한 힘 및 슬라이딩 움직임의 진폭을 측정 하기 위해이 단계 한다 연습을 여러 번 검사 결과 현미경 때마다.</li>
	<li>필요한 경우 DAPI 솔루션을 추가 하 고 1 h. 넓은 필드 형광 또는 24 h. 이내 confocal 현미경 샘플을 관찰 하는 진행을 15 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 습 한 상자에 슬라이드 SDS 여부 추가 확인을 지우고이 절차를 결합 하려고 하는 장소 개선 사항을 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>6. 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 지우기
참고: 분석, 꽃 기관 및 연구자의 기술을 해 부하는 아주 부드럽고 작은 표본에 SDS 처리 실행 될 수 있다 밖으로 하기 전에 (대 한 경험이 풍부한 연구자) 또는 해 부 단계 (덜 경험에 대 한 후 연구원) 메탄올-아세트산 소재 고정에.
<ol><li>시계 메이커의 유리, 오목 슬라이드 또는 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 1 %SDS 실 온에서 하룻밤 0.2 N NaOH 솔루션 또는 비 해 부 해 부 샘플을 품 어.</li>
	<li>샘플과 매우 부드럽고 투명 한 모양 때문에 관심을가지고 처리 합니다. 물으로 여러 번 씻어. 참고: SDS 솔루션의 나머지 발생할 수 있습니다 강 수는 얼룩 솔루션, 예를들면, 아닐린 블루 추가할 때.</li>
	<li>비 해 부 샘플에 대 한 2, 70% 에탄올 대신 물을 사용 하 여 절에서 설명한 해 부 절차를 따릅니다. 원하는 조직 해 부, 후 잔해와 파편, 및 압 지와 어떤 과잉의 물 제거 후 얼룩 솔루션의 20-40 µ L을 추가 하 고 6.5 단계로 진행.</li>
	<li>해 부 샘플에 대 한 신중 하 게 세척 솔루션에서 샘플을 이동 및 그것 깨끗 한 슬라이드에 놓고 얼룩 솔루션의 20-40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 옆으로 그것을 낮추는 방법으로 슬라이드에는 coverslip 장소. 알아서 하지 준비 스쿼시. 조직 너무 연약한 경우에, 장소 어떤 얇은 슬라이드 (예를 들어, 테이프 또는 깨진된 coverslip)의 모서리에 coverslip 사이 구분 기호는 coverslip 표본 분쇄 하지 않습니다 되도록 슬라이드 사이의 coverslip, 챔버 같은 공간을 떠나.</li>
	<li>습 한 상자 내에서 모든 슬라이드를 배치, 알루미늄 호 일, 표지 및 적어도 1 h. widefield 형광 또는 24 시간 이내 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 표본 관찰을 진행 4 ° C에서 그것을 배치.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

애기, 모든 꽃 발달 단계에 걸친의 단일 화 서 내의 많은 꽃 봉 오리의 존재 연구 효과 치료의 발달 기능을 특성화 하기 위한 독특한 기회를 제공 꽃 발달의 다른 단계 걸쳐 동시에. 다른 개별 공장 사이 좋은 기준점은 주 화 서의 첫 번째 꽃의 개통. 식물 꽃 동기화 하는 방식으로 처리 됩니다 만큼 가능한 (예를 들어, 4 ° C에서 층 리 동기 씨 발 아 및 따라서 꽃도 더 극대화 하는 3-4 일), 그리고 그들의 첫 번째 꽃 같은 날에 열리는 식물만 치료 사이의 복제; 배포 하는 일괄 처리로 찍은 계속 되는 일에 준비 일괄 처리 실험을 복제를 사용할 수 있습니다. 다음이 절차, 더 강력한 비교 분석, 시간과 사이 식물, 환경과 발달 변화에 대 한 제어를 수행할 수 있습니다.
최근에 대 한 보고 우리가 클래식 개간 솔루션에 비해 허가 샘플에 대비를 향상 시킬 뿐만 아니라 꽃과 배아 개발 하는 동안 전 분 역학 하 이블의 개간 솔루션과 Lugol의...

꽃은 가장 중요 한 중 장기 적의 정의. 꽃 식물 몇 백만 90-130 년 전에 나타나1, 너무 빨리 그들의 급속 한 외관 찰스 다윈2"지독한 미스터리"로 기술 되었다 다양 하 고. 꽃 개발에 대 한 식물 연구자의 관심사는 다양 하다. 일부 연구는 전체, 또는 꽃3,,45,6의 특정 해 부, 구조, 및 기능 속성의 진화로 이해 하는 꽃의 진화 근원에 집중 . 그들에 의존 하는 성적 및 성적 재생산의 모드 뿐만 아니라 꽃 형태와 구조, 높은 변형 꽃 매우 복잡 한 구조를 확인 합니다. 유전 및 분자 조사7과 결합 될 수 있는 빛과 전자 현미경 기술을 사용 하 여 꽃 기관의 해부학 및 구조적 기능을 특성화 하기 위해 다양 한 노력을 주도하 고 있다. 또한, 과일과 씨앗, 소스 꽃은 인간과 동물 영양에 대 한 파라마운트 중요성의 이다. 따라서, 꽃 및 과일 개발의 특성화는 늘어나는 인구와 생태 보존 전략 변화 환경8 아래에 대 한 식량 안보를 포함 하 여 응용된 연구에 대 한 많은 의미는 , 9 , 10.
애기 에 꽃 개발 꽃 유도 및 꽃이 핌 (꽃의 그룹) 분열 조직에 식물 분열 조직의 변환으로 시작합니다. 꽃 primordia 옆 화 서 분열 조직11의 측면에서 시작 됩니다. 꽃 기관 primordia는 꽃의 중심에는 외부에서 동심 whorls에 점차적으로 형성 하 고 결국 sepals, 꽃잎, stamens, 및 carpels7으로 개발. 이러한 꽃 기관의 행 독특한 영양, 보호, 및 기능 (예를 들어, pollinator 매력) 다양 한 식물 종, 남성과 여성의 gametophytes, 각각12 의 개발을 유지 하는 성적인 기관 역할 , 13. gametophytes, 차례 차례로, 각 남성 (정자)의 쌍 차별화와 결합 시 여성 gametes (계란과 중앙 셀), 더블를 다음 세대, zygote, 기본 endosperm 수정 터미널 조직 지원 합니다 배아14,15의 개발. 과일, 종자 개발 성장, 성숙, 그리고 태아와, 결국, 그것의 분산의 보존을 지원 합니다. 광범위 한 연구 모델 종 애기7,,1617에 (서) 특히 다양 한 식물 종, 꽃과 배아 개발 특성화를 수행 하고있다.
꽃 발달의 이른 현미경 분석 시간이 걸리는 샘플 처리 및 파라핀 또는 수 지를 포함, 단면, 등 기법, 결합 빛 또는 전자 현미경 관찰에 근거 했다. 이러한 전통적인 현미경 기술은 돌연변이, 제자리에서 교 잡에 의해 RNA의 지역화 또는 단백질의 면역 검출의 현미경 분석 등 분자 유전자 조사와 함께에서 자주 사용 했다. 넓은 필드와 공초점 형광 현미경 검사 법, 최신의 3 차원 전산 이미지 분석 및 최소 처리 전체 산 표본에 사용 될 수 있는 분자 방법의 지속적인 세련미에에서 최근 진행 상황에 대 한 필요를 주도하 고 있다 효율적이 고 최소 샘플 처리 기술 정량 분석을 우선적으로 받을. 최근 몇 년 동안, 상당한 진행이 했다 전체-산 동물 표본에 개간 기술 개발. 그들은 렌더링 샘플 투명 수성 우 레 아 또는 설탕 기반 약 (예를 들어, 규모, SeeDB, 큐빅)을 사용 하 여18,,1920, 또는 선택적으로 후 (SDS 세제를 사용 하 여) 하는 지질을 제거 하 여 안정적인 hydrogels;에 샘플 포함 지질 제거 될 수 있다 수동 확산에 의해 달성 (예를 들어, 선명도 프로토콜21, 협정-동위-바퀴22수정) 또는 전기 이동 법 (원래 선명도 프로토콜23 , 법-프레스 토24)으로 적극적으로. 이 빠른 진행에 의해 격려 해, 일부 파생된 기술도 등장 하고있다 식물에 사용 하기 위해.
애기모델에 초점을 맞춘이 방법 종이, 우리 꽃 봉 오리, 꽃, 그리고 젊은 siliques의 적절 한 해 부와 다양 한 얼룩에 대 한 전체-마운트 샘플의 비운에 대 한 절차 및 사용 하 여 관찰 절차 설명 클래식 또는 최근 SDS 기반 개간 방법. 전 분, callose, 및 chromatin는 얼룩이 지기에 대 한 예제는 주어진 다. 이러한 절차 개선 및 적응 다른 종이 함께 사용 될 때 추가 해야 할 수도 있습니다, 하지만 그들은 많은 연구 프로젝트의 출발점은이 간단 하지만 중요 한 방법에 추가 연구를 위한 무대를 설정 됩니다 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>시약 및 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드 용액</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr>, <tr><td>프로피온산</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>클로랄 수화물</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Roth</td><td>: 3783.1</td><td></td></tr><tr><td>아라비아 고무</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>젖산</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>페놀</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>우리는 액체 페놀이 사용했습니다 (밀도를 사용하여 솔루션에 필요한 부피를 찾으십시오)</td></tr><tr><td>클로브 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>요오</td>드 <td>플루카</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>요오드화 칼륨</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>공작석 그린</td><td>플루카</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>푹신 산</td><td>플루카</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>시그마</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이</td>트 <td>시그마 - 알드리치</td><td>L3771</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>인산이 수소 나트륨</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염 기성</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>인산칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>형광 증백제 28</td></tr><tr><td>Auramine</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>독성</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>아닐린 블루</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS 미디엄</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>영양이 풍부한 기질</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>시계 메이커 유리</td><td></td><td></td><td>특정 브랜드 없음</td></tr><tr><td>15ml 팔콘 원심 분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumond 집게</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>준비 바늘</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>절단 모서리</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>습한 상자</td><td></td><td></td><td>: 젖은 종이 타월과 슬라이드 지지대가있는 플라스틱 상자</td></tr> <tr><td>< 강한> 이름 < / 강한></td> <td>< 강한> 회사 < / 강한> <</td> <td>강한> 카탈로그 번호 < / 강한></td> <td>< 강한>코멘트 < / 강한></td></tr><tr><td>< 강한> 솔루션 < / 강><</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>강> 고정제< / 강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carnoy's (Farmer's) 고정액</td><td></td><td></td><td>절대 에탄올 : 빙초산, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>메탄올/아세트산 고착제</td><td></td><td></td><td>50 % (v/v) 메탄올, 10 % (v/v) 빙초산 탈이온수</td></tr><tr><td>FPA50 고정액</td><td></td><td></td><td>포르말린, 프로피온산, 50% 에탄올; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td><강>투명화 용액</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로랄 하이드레이트/글리세롤</td><td></td><td></td><td>클로랄 하이드레이트 : 글리세롤 : 물, 8:1:2 (g:ml:ml). 모든 꽃 발달 단계와 DIC 현미경을 통한 실리크 발달에 사용할 수 있습니다. 가장 좋은 정착제는 포르말린 기반 FPA50</td></tr><tr><td>Modified Hoyer</td><td></td><td></td><td>Gum arabic 7.5g, 클로랄 수화물 100g, 글리세롤 5ml, 물 30ml입니다. 모든 꽃 발달 단계와 DIC 현미경을 통한 실리크 발달에 사용할 수 있습니다. 가장 좋은 정착제는 포르말린 기반 FPA50</td></tr><tr><td>Herr's 4&frac12; 투명액</td><td></td><td></td><td>젖산, 염소 수화물, 페놀 결정, 정향 오일, 자일렌, 2:2:2:2:1, 중량으로. 모든 꽃 발달 단계(특히 수술 발달)와 DIC 현미경을 통한 실리크 발달에 사용할 수 있습니다. 가장 좋은 정착제는 포르말린 기반 FPA50</td></tr><tr><td>SDS/NaOH 용액</td><td></td><td></td>으로<td>, SDS 및 NaOH 원액을 1% SDS/0.2N NaOH(10배 희석)로 혼합 희석합니다. 꽃과 규질의 발달 단계의 모든 단계에. 가장 좋은 정착제는 메탄/아세트산 정착제입니다. 다른 두 정착제도 사용할 수 있습니다. calcofluor, auramine, DAPI 및 아닐린 블루 염색 용액과 결합할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>SDS 원액</td><td></td><td></td><td>10 % (w / v) 도데 실 황산나트륨. 10g의 도데실황산나트륨을 80ml의 탈이온수에 녹이고 탈이온수로 최대 100ml를 만듭니다.</td></tr><tr><td>NaOH 원액</td><td></td><td></td><td>2 N NaOH 용액 : 40ml의 탈 이온수에 NaOH 4g을 용해시키고 탈 이온수로 최대 100 ml를 만듭니다</td></tr> <tr><td> Combined clearing and staining solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr의 IKI-4 &frac12;</td><td></td><td></td><td>표준 4&frac12; (총 9g) 추가 : 요오드 100mg, 요오드화 칼륨 500mg. 이 세척 용액은 모든 꽃 발달 단계와 실리크 발달에 사용할 수 있으며, 대비를 높이거나 전분 역학을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 구조 분석에는 FPA50을 사용하고 정량적 전분 분석에는 Carnoy의 정착제를 사용합니다.</td></tr><tr><td>알렉산더 염색</td><td></td><td></td><td>에탄올 95% 10ml, 공작석 녹색(95% EtOH 중 1%) 1ml, 푹신산(ddH2O 중 1%) 5ml, 오렌지 G(ddH2O 중 1%) 0.5ml, 페놀 5g, 클로랄 수화물 5g, 빙초 아세트산 2ml, 글리세롤 25ml . 이 투명화/염색은 단독으로 또는 Herr's 4&frac12와 함께 사용됩니다. 용액은 성숙한 꽃가루 알갱이와 삼세포 꽃가루 알갱이가 있는 꽃의 꽃가루 중단을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 갓 갓 만든 고정되지 않은 재료에 사용됩니다.</td></tr><tr><td><강>염색 용액</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>칼슘플루오르 용액</td><td></td><td></td><td>Calcofluor 0.007% (g:ml). 원래는 광학 브라이트너로 사용되었습니다. 세포벽의 셀룰로오스, 카르복실화 다당류 및 칼로스를 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 꽃가루 알갱이의 내부를 염색하는 데 자주 사용됩니다. 세 가지 정착제를 모두 이 용액과 함께 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>오라민 용액</td><td></td><td></td><td>오라민 0.01% (g:ml). 이 친유성 형광 염료는 큐티클, 큐틴, 엑신 등을 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 세 가지 고정제 모두</td></tr><tr><td>Calcofluor-Auramine 혼합물</td><td></td><td></td> Auramine 용액과 함께 사용할 수 있습니다 <td>: Calcofluor 용액, 3 : 1. 두 용액에 의한 결합 염색에 사용할 수 있습니다. 다른 비율은 auramine에 관하여 calcofluor의 더 작은 비율을 유지하는 분석될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DAPI 용액</td><td></td><td></td><td>DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7), 0.1% 트리톤-X-100, 1 mM EDTA. 이 용액은 남성과 여성의 감수 분열 중 염색체 확산과 모든 조직의 세포핵을 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 꽃가루 입자 발달을 연구하는 데 자주 사용됩니다. Carnoy's와 메탄올/아세트산은 이 솔루션에 가장 적합한 정착제입니다. FPA50과 같은 포름알데히드 기반 고정제는 염색을 방해할 수 있습니다. UV의 여기 및 약 461nm의 최대 방출.</td></tr><tr><td>인산나트륨 완충액 (0.1 M)</td><td></td><td></td> <td>양성자 수용체 : 0.2 M Na2HPO4, 양성자 공여자 : 0.2 M NaH2PO4, 비율 양성자 공여체 / 양성자 수용체 : 1.364 (pH 7의 경우)</td></tr> <tr><td>아닐린 블루 용액</td><td></td><td></td><td>0.1 % (w / v) 아닐린 블루, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2 % 글리세롤. 이 용액은 여러 발달 단계의 칼로스 및 셀룰로오스를 염색하는 데 사용할 수 있습니다 (예 : 남성 및 여성 terad의 callose 침착, 꽃가루 튜브의 callose plugs). UV의 여기와 약 455의 최대 방출. 또한 세포 함량 염색을 위해 빨간색으로 방출되는 514nm에서 여기될 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 siliques의 얼룩

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

분자 유전자 연구에 대 한 강력한 도구, 인 애기 thaliana 식물 생물학으로 하 고, 특히, 식물 생식 생물학에서에서 가장 눈에 띄는 모델 종 중 하나입니다. 그러나, 식물 형태학, 해부학, 그리고 ultrastructural 분석 전통적으로 포함 포함 시간과 절차 밝은 필드, 스캐닝, 및 전자 현미경 단면. 공초점 형광 현미경 검사 법, 최신의 3 차원 전산 현미경 분석, 및 최소 처리 전체 산 표본에 사용 될 분자 기술의 지속적인 세련미에 최근 진행 상황에 대 한 수요 증가를 주도하 고 있다 효율적이 고 최소 샘플 처리 기술 개발. 이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 기본 기술, 청소를 제대로 해 부에 대 한 기술 설명 그리고 일부 얼룩 절차 전체-마운트의 생식 구조 관찰.

애기 는 corymb (그림 1)에서 배열 하는 양성 꽃 inflorescences 베어링 Brassicacea 가족에 속한다. 각 꽃에는 4 개의 sepals, 4 개의 꽃잎, 6 예 (4 개의 길고 2 개의 짧은), 및 4 개의 동심 whorls25,26에 배열 두 선천적인 융합된 carpels (그림 1 층-H)로 구성 된 syncarpous gynoecium는 있다. 애기 는 tenuinucellate, anatropous ovules 난소 (45-80 ovules의 합계)의 2 개의 locules의 각 내에서 두 개의 행 (각 행의 ovules 12-20)에 정수 리 placentation에...

이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

이 프로토콜은 꽃봉오리, 꽃 및 어린 빙송을 적절하게 해부하는 방법을 설명합니다. 그리고 다양한 염색 및 관찰 기술을 위한 후속 전체 장착 투명화. 이 방법은 성 식물 생산 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.꾸준히 돌연변이 분석 또는 꽃의 발달 및 기능에 대한 환경 및 실험적으로 유도 된 실패와 같은. 이 기술의 주요 장점은 여러 발달 단계를 동시에 쉽고 빠르게 선별할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 꽃 기관 해부 단계가 꽃 해부학 및 해부 기술에 대한 사전 지식이 필요하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.시작하려면 작은 가위를 사용하여 동기화 된 식물에서 꽃을 제거하십시오. 그리고 즉시 적절한 고정제가 들어 있는 개별 미세 원심분리기 튜브에 넣으십시오. 다음으로, 정착액을 제거하고 샘플을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 70% 에탄올을 첨가합니다.샘플을 최소 24시간 동안 섭씨 4도로 되돌립니다. 그런 다음 시계 제작자의 잔에 갓 만든 70% 에탄올을 채우고 작은 페트리 접시에 넣어 지지합니다. 그런 다음 꽃차례를 시계 제작자의 유리에 넣고 에탄올로 완전히 덮여 있는지 확인합니다.집게와 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 꽃받침, 꽃잎 및 수술을 찢어 실체 현미경으로 꽃을 해부합니다. 그런 다음 시계 제작자의 유리를 한쪽에 놓고 유리 슬라이드를 사용하여 최종 해부를 합니다. 샘플을 슬라이드로 이동하고 갓 만든 10% 에탄올 70마이크로리터를 추가합니다.손목의 양쪽을 자르고 필요에 따라 회전시킵니다. 그런 다음 밸브를 부드럽게 제거하여 난자를 노출시킵니다. 용기에서 전달 조직의 절반을 분리하기 위해 날카롭게 작게 자르고 집게와 바늘을 사용하여 두 반쪽을 찢습니다.스티그마 스타일과 꽃자루를 날카로운 컷으로 제거합니다. 집게와 바늘을 사용하여 아직 붙어있는 난자를 부드럽게 뒤집고 배열하여 두 개의 평행 한 줄을 얻습니다. 작은 블로팅 페이퍼를 사용하여 유리 슬라이드의 샘플에서 에탄올을 제거합니다.그런 다음 슬라이드에 20마이크로리터의 세척 용액을 추가합니다. 피하 주사 바늘이 있는 주사기를 사용하여 표본을 배치하고 남아 있는 기포를 제거합니다. 다음으로, 커버 슬립을 슬라이드에 부드럽게 놓고 세척 용액이 커버 슬립과 샘플 사이의 공간을 채울 때까지 기다립니다.슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 흄 후드 아래에 두십시오. 그러니 갓 수확한 꽃봉오리는 탈염되지 않은 꽃밥으로 열리려고 합니다. 그런 다음 꽃봉오리가 완전히 잠길 수 있도록 충분한 Alexander 용액이 포함된 96웰 플레이트를 준비합니다.꽃받침과 꽃잎을 제거하여 꽃밥을 노출시키고 알렉산더 용액에 담그십시오. 접시를 흄 후드 아래에 1-3시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 Alexander 용액을 Herr의 4.5 용액으로 교체하고 흄 후드 아래의 플레이트를 밤새 배양합니다.다음날 집게를 사용하여 깨끗한 새싹을 새 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로 수술을 절개하고 샘플에서 다른 모든 조직을 제거합니다. 그런 다음 Herr의 4.5 용액을 사용하여 클로랄 수화물 기반 세척 및 복합 세척 염색을 진행합니다.먼저 시계 제작자의 유리에서 슬라이드로 꽃을 옮기고 압지를 사용하여 과도한 에탄올을 제거합니다. 5-10 마이크로 리터의 DAPI 솔루션을 추가하십시오. 피하 주사 바늘이 달린 주사기 2개를 사용하여 수술을 절개하고 다른 모든 꽃 기관을 제거합니다.그런 다음 꽃가루 알갱이를 DAPI 용액으로 방출합니다. 슬라이드에서 수술의 모든 파편을 제거하고 슬라이드에 꽃가루 알갱이만 남도록 합니다. 슬라이드에서 수술 파편을 모두 제거하는 것이 진탕 제거를 위한 가장 중요한 단계입니다.슬라이드와 커버 슬립 사이에는 꽃가루 알갱이만 남겨야 합니다. 다음으로, 시편 베어링 슬라이드에 커버 슬립을 놓고 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공간을 채우는 데 필요한 최소한의 DAPI 용액을 추가합니다. 검지 손가락을 커버 슬립에 부드럽게 놓고 빠르고 짧게 미끄러지는 움직임을 만듭니다.슬라이드를 사람 상자에 넣어 섭씨 4도의 어둠 속에서 최소 15분 동안 놓습니다. 그런 다음 24시간 이내에 광시야 형광 또는 컨포칼 현미경 아래에서 슬라이드를 관찰합니다. 시계 제작자의 유리에서 해부된 샘플을 1% SDS와 0.2 수산화나트륨 용액으로 채워진 구멍이 있는 유리판으로 옮깁니다.실온에서 밤새 배양하십시오. SDS 수산화나트륨 용액은 샘플을 빠르게 제거하여 몇 분 안에 투명하게 보이게 합니다. 샘플을 물로 조심스럽게 헹구고 깨끗한 슬라이드에 놓습니다.그런 다음 슬라이드에 20-40 마이크로 리터의 염색 용액을 첨가하십시오. 분석할 꽃 기관과 연구자의 기술에 따라 이 DS 치료는 숙련된 연구자의 경우 해부 전에 수행될 수 있으며 경험이 적은 연구자의 경우 해부 단계 후에 수행될 수 있습니다. 그런 다음 준비물이 부서지지 않도록 주의하면서 덮개 슬립을 슬라이드에 놓습니다.그런 다음 준비된 모든 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮인 인간 상자에 넣고 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 광시야 형광 또는 컨포칼 현미경 검사에서 표본을 관찰합니다. 프로토콜에 설명된 해부 절차에 따라 관찰을 방해할 수 있는 불필요한 조직을 제거하고 보다 상세한 이미지를 얻을 수 있습니다.목적에 따라 클로랄 수화물 염색을 사용하여 전체 꽃봉오리 수준에서의 조기 꽃 발달, 꽃밥의 감수분열 및 미세 gomedal 발생, 초기 배주 발달 및 거대포자 모세포의 사양화, 암컷 go-med-ified 발달 또는 중앙 그리드의 꽃가루관 침입을 특성화할 수 있습니다. Alexander staining과 Herr의 four and half clearing을 결합하면 주어진 locule 또는 꽃밥 전체 내에서 꽃가루 유산을 평가할 수 있습니다. 생존 가능한 꽃가루 알갱이는 붉은 세포질을 나타내지만, 중단된 꽃가루 알갱이는 빈 세포질을 나타내며 결국 불규칙한 모양으로 완전히 부서집니다.엑신(exine)을 제거하면 핵의 염색 강도가 증가하고 염색질 조직의 세부 정보가 높아집니다. 염색 전에 SDS 수산화 나트륨 세척을 사용하여 꽃차례를 투명하게 만들었습니다. 그리고 꽃 조직 내에서 칼로스의 염색이 더 높았습니다.그것은 일반적으로 칼로스 축적을 보기 어렵다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어 생식 세포와 식물 세포를 분리하는 Callose 층과 같습니다. 꽃가루 알갱이가 꽃밥 안에 아직 들어 있을 때조차도.이러한 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 48시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 결과는 적절한 고정제 사용, 적절한 해부 수행, 슬라이드에서 관심 조직 분리와 같은 우수한 샘플 준비에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

식물 세포벽 구성은 조직 유형에 따라 다르며 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함할 수 있습니다. 세포 유형 수준에서 차이를 시각화하기 위해 다양한 염색 기술이 개발되었습니다. 이 논문은 일반적으로 사용되는 세포벽 염색 기술을 편집한 것입니다.

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

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여기에서는 형광 단백질의 안정성을 유지하면서 식물 조직을 투명하게 만드는 방법에 대해 설명한다. 이 기술은 물리적 단면화없이 제거 된 식물 조직의 깊은 이미징을 용이하게합니다.

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