Name: 추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 배우세요 고압 액체 크로마토그래피와 전기화학 검출을 결합한 고체상 추출법으로 영아 소변의 카테콜아민 신경전달물질과 대사산물을 동시 분석하는 방법입니다. MHPG 바이오마커를 활용한 뇌손상 조기 진단에 임상 적용 가능성이 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 국립 과학 재단의 중국 (No.81172720, No. 81673230), 사회 개발 연구 프로그램의 장쑤 성 과학 및 기술 부 (제에 의해 지원 되었다 BE2016741), 과학 및 중국의 질 감독, 검사 및 검역 (2015QK055), 아동 발달 및 교육 과학기술부의 과학 학습의 주요 연구소의 오픈 프로젝트 프로그램 일반 관리의 기술 프로젝트 남동 대학 (CDLS-2016-04). 우리는 진심으 원 노래와 Ping Liu 샘플 컬렉션에 우리 지원 인정 합니다.

부모 로부터 동의 얻어, 그리고 연구에 대 한 제도적 검토 보드 승인을 얻은. 연구는 인간을 포함 하는 실험에 대 한 세계 의학 협회 (헬싱키의 선언)의 윤리 강령에 따라 수행 되었다. 연구에 등록 되 고에 대 한 동의 서 면 제공 하는 모든 참가자의 보호자. Zhongda 병원 윤리 위원회 승인을 동남 대학와 제휴도 입수 했다.
1. 열과 추출 및 Catecholamines의 결정에 필요한 솔루션의 준비
<ol><li>PFSPE 열을 준비 합니다. 5-6 aliquots로 PCE PS nanofibers의 1-2 mg을 분할 하 고 0.5 m m 직경을 가진 정밀한 강철 막대를 사용 하 여 질서 200 µ L의 양으로 피 펫 팁의 끝에 그들을 압축.</li>
	<li>2.427 g 우 레 아, 0.034 g 요 산, 0.09 g 크, 0.297 g trisodium 시트르산, 0.634 g 염화 나트륨, 0.45 g 염화 칼륨, 염화 암모늄 0.161 g, 0.089 g 염화 칼슘이 수화물, 황산 마그네슘 0.1 g 무게에 의해 인공 소변을 준비 heptahydrate, 0.034 g 나트륨 중 탄산염, 0.003 g 나트륨 수 산 염, 0.258 g 나트륨 황산 염, 0.1 g 나트륨 디 인산 염, 그리고 0.011 g disodium 수소 인산 염, 디졸브 200 mL에 위의 화학 이온을 제거 된 물.</li>
	<li>화합물의 2 mg 1 mL의 증류수에 용 해 하 여 2 mg/mL diphenylborate (DPBA) 솔루션의 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장</li>
	<li>
분석 표준 참고: 화학 구조 및 속성 catecholamines의 불안정, 그리고 그들은 쉽게 분해. 표준의 준비 과정 매우 신속 하 고 직접적인 햇빛에 노출 되지 않도록 해야 합니다.<ol>
<li>네브라스카, E, 다, MHPG, DOPAC 및 별도 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 내부 표준 3, 4 dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA 1.0 밀리 그램 무게. DHBA 솔루션을 사용 하기 전에 100 ng/mL를 물에 희석.</li>
		<li>Analytes 완전히 분해 때까지 빠른 속도로 어둠 속에서 준비 된 표준 흔들 리 다. 이것은 기본 주식; 몇 주까지-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
		<li>2 차 1000 ng/mL 분석 주식을 준비 합니다. 네브라스카, E, 다, DOPAC 및 MHPG, 증류수 5 mL 원심 분리기 튜브, 4,975 µ L에 5 µ L 각 기본 분석 재고의 전송 및 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 그것을 저장. 이러한 솔루션 신선한 매일을 준비 합니다. DHBA, 증류수 5 mL 원심 분리기 튜브에서 4,995 µ L로 기본 주식의 5 µ L를 전송 및 4 ° c.에서 별도로 어둠 속에서 그것을 저장합니다</li>
		<li>표준 곡선을 만드는 보조 분석 재고 더 희석을 만들기 (예., 보충 표 2). 4 ° C에서 어둠 속에서 솔루션을 저장 하 고 신선한 매일 준비 합니다.</li>
		<li>표준 재고를 사용 하 여 적절 한 농도로 ECD 검출기의 최적의 전압을 테스트 합니다. analytes가 가장 좋은 피크 모양의 찾을 값을 전압을 변화 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30% 인산, 15% 이기를 포함 하는 eluant를 준비 하 고 55% 증류수. Eluant 용 매 10 ml, 5.5 mL 증류수, 사용 하 고 물에 이기의 1.5 mL 및 인산에 의해 드롭의 3 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>2. 실제 소변 샘플 및 모바일 단계 준비
<ol><li>어머니 무 균 소변 컵을 사용 하 여 그들의 유아의 첫 번째 아침 소변을 수집 했습니다. 폴 리 프로필 렌 튜브와 라벨 샘플을 즉시 전송 합니다. 그런 다음,-20 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.</li>
	<li>소용돌이 원심 분리기 1,510 x g에서 10 분에서 오 줌 샘플 룸 온도 (RT) 대부분 미 립 자 방해의 제거를. 퇴적 물을 버리고 고 추가 실험 supernatants 수집 합니다. Analytes를 효과적으로 추출 하기 위해 centrifuging 직후 PFSPE 전처리 (3 단계)로 이동 합니다.</li>
	<li>
모바일 단계 준비
	<ol>
<li>깨끗 한 병, 적어도 1 기사 준비 모바일 단계의 구성 보충 표 1;에 나열 된 1 L 모바일 단계, 구 연산 산, 에틸렌 diamine tetra 아세트산 (EDTA) disodium 소금, monometallic 나트륨 orthophosphate의 7.02 g 93.06 mg의 측정 6.7242 g에 대 한 1-heptanesulfonic 산 나트륨 소금, 404.5 마그네슘과 나트륨의 3.5 g 병으로 하이드 레이트. 40 mL 이기를 추가 하 고 1000 ml 증류수. 선동 하 고 솔루션에 문제 모두 해산 될 때까지 15 분 동안 초음파 진동.</li>
		<li>유리 전극으로 pH 미터를 사용 하 여, 포화 수산화 나트륨 솔루션 4.21로 모바일 위상의 pH 값을 조정 합니다.</li>
		<li>0.45 μ m polyvinylidene 불 소 미소 한 구멍이 있는 막과 불순물을 제거 하는 진공 흡입 장치 모바일 단계를 필터링 합니다.</li>
		<li>15 분에 대 한 초음파 진동을 사용 하 여 모바일 단계 사용 하기 전에 각 시간을 드.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PFSPE 추출 및 HPLC 분석
<ol><li>nanofibers를 활성화 합니다. 누르고 메탄올의 100 µ L의 물 100 µ L 순차적으로 통해 느린, dropwise 방식에서 5 mL 주사기를 사용 하 여 PFSPE 열.</li>
	<li>믹스 100 µ L 소변 100 µ L 2 mg/ml DPBA 솔루션 및 30 µ L 100 ng/ml의 DHBA 솔루션 (IS, 내부 표준) 0.5 mL EP 튜브 샘플 다음 혼합된 솔루션 PFSPE 열을 전송 합니다. 5 mL 기밀 플라스틱 주사기 공기 압력의 힘을 사용 하 여 PFSPE 열 통해 혼합된 샘플 솔루션을 누릅니다.</li>
	<li>SPE 열에 DPBA 솔루션 (2 mg/mL)의 100 µ L을 로드 하 여 열 세 번 걸러 고 5 mL 기밀 플라스틱 주사기를 사용 하 여 공기 압력으로 천천히 카트리지를 통해 솔루션을 밀어.</li>
	<li>PFSPE 열에 eluant의 50 µ L을 로드 하 고 0.5 mL EP 튜브 eluate 수집 열을 통해 밀어.</li>
	<li>시스템에서 공기를 드 하 HLPC degasser를 켭니다. 샘플 분석, 이전 시스템 equilibrate 및 기준선 소음 모바일 단계와 0.5 h 이상에 대 한 실행 해야 합니다. HPLC 시스템의 설치 매개 변수를 보여주는 보충 표 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>20 µ L의 eluate 자동 샘플러를 사용 하 여 샘플 그리고 HPLC ECD 시스템에 주입.</li>
	<li>실행 완료 되 면 감지기 인터페이스를 사용 하 여 검출기 셀 끕니다. 이 악기를 손상 시킬 수 있는 검출기, 뒷면 스위치 셀에서 설정 하지 마십시오.</li>
	<li>모바일 단계 구성 10% 메탄올과 90% 물 수동으로 변경 합니다. 적어도 30 분 동안 실행 합니다. 그런 다음, 수동으로 HPLC 급 메탄올 모바일 위상을 변경 합니다. 메탄올에 시스템을 보호 하기 위해 약 15 분 동안 실행 합니다. 권장된 실행 시간을 다음이 단계를 실행 하는 실패는 열 및 검출기 손상 될 수 있습니다. 흐름을 끄십시오 다음에 degasser를 해제 합니다.</li>
</ol>4. Phenylboronic 산 카트리지 (PBA) 추출
PBA 카트리지 추출 절차 쿠마 외에 계획에 유사 했다. (2011 년) 25. 모든 솔루션 PBA 카트리지 (100 mg, 1 mL)을 통해 공기를 주사기에 의해 강제로 적용 됩니다.
<ol><li>조건 1 80:20 이기-물 (v/v) 순차적으로 1% 개미 산 성 및 50 m m 인산 버퍼 (pH 10)의 1 mL를 포함 하는 카트리지.</li>
	<li>PBA 카트리지 통해 버퍼링된 소변 샘플 (1 mL 소변 및 2 mL 인산 염 버퍼, pH 8.5)를 누릅니다.</li>
	<li>워시 1 mL 50: 50 v/v 이기 인산 버퍼 (10 m m, pH 8.5) 카트리지.</li>
	<li>1 mL 이기-물 (80:20 v/v) 1% 개미 산을 포함 하는 카트리지 elute</li>
</ol>5. 식별 및 Catecholamines의 정량화
<ol><li>
선형성
	<ol>
<li>6 농도 (1.5, 3, 12, 25, 50, 그리고 100 ng/mL); 인공 소변 보조 analytes 재고 희석 인공 소변의 희석 볼륨 보충 표 2다음과 같습니다. 보정 곡선을 건설 하기 위한 18 분석 실험 솔루션을 각 농도와 세 개의 병렬 샘플을 확인 합니다.</li>
		<li>100 ng/mL 실험 솔루션을 인공 소변 DHBA 보조 재고를 10 배 희석.</li>
		<li>단계 3 (PFSPE 추출 절차)에 따라 5.1.1에서 모든 분석 솔루션을 pretreat. 단계 3, HPLC 크로마를 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluate의 20 µ L를 주사.</li>
		<li>농도의 비율에 대 한 Y 축으로 피크 지역 (대상/IS)의 비율을 그려서 5 analytes의 보정 곡선을 건설 (대상/IS) X 축으로 보충 그림 1에서 보듯이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
감도 대 한 LOD 및 LOQ 값
	<ol>
<li>샘플의 HPLC 크로마를 (3 단계), 마찬가지로 HPLC ECD 시스템에 빈 인공 소변의 20 µ L를 주사.</li>
		<li>5.2.1에서 크로마에 11 빈 신호 값을 수집 하 고 계산 하는 평균 값 Xb 와 표준 편차 Sb. XL XL, 신뢰의 특정 수준에서 검출 될 수 있는 물질의 최소 신호를 계산 X =b+ K * Sb (K는 신뢰 수준에 의해 결정 계수의 잡음 레벨을 반영 하는 Sb 는 측정 방법 및 기계 소음 수준). 따라서, LOD = (L-Xb) X /S = (K * Sb) /S (S 스탠드 작업 곡선의 기울기 값에 대 한).</li>
		<li>3:1 (K = 3) 검출 (LOD)의 제한에의 한 S/N 및 S/N 10:1 (K = 10) 정량화 (LOQ)의 제한으로 정의 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
평가 복구
	<ol>
<li>진짜 하 고 아군 소변 샘플을 준비 합니다. 3 개의 농도를 실제 소변 보조 analytes 재고 희석 (5, 50, 100 ng/mL) 아군된 소변 샘플을 얻기 위해. 각 분석 솔루션에 대 한 3 개의 병렬 샘플을 준비 합니다. 소변 샘플으로 아군 대상의 수량으로 아군된 농도 계산 합니다. S로이 값을 정의 합니다.</li>
		<li>100 ng/mL, 단계 5.1.2 에서처럼 하 희석 DHBA 주식.</li>
		<li>5.3.1에 따라 3 단계에서 각 샘플 솔루션 (PFSPE 추출 절차)를 처리 하 고 크로마 결과 얻기 위해 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluant의 20 µ L를 주입. Analytes의 값 아군된 소변 샘플에서 측정할 대상 화합물의 수량으로 계산 됩니다. T으로이 값을 정의 합니다.</li>
		<li>크로마 결과 얻기 위해 HPLC-ECD (3 단계)로 시스템에 소변 샘플의 20 µ L를 주사. Analytes의 값 소변 샘플에서 측정할 대상 화합물의 초기 수량으로 계산 됩니다. 나는이 값을 정의 합니다.</li>
		<li>표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 백분율 복구 방법론 복구 %로 추정 된다 (t - Ai) = × 100 / (s). 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
평가 부정확성
	<ol>
<li>5, 50, 및 100 ng/mL 농도 단계 5.3.1 에서처럼 아군된 인공 소변 샘플을 준비 합니다. 각 분석 솔루션에 대 한 6 병렬 샘플을 준비 합니다. 매일 신선한 실험 샘플을 준비 합니다.</li>
		<li>DHBA 재고 단계 5.1.2 에서처럼 100 ng/mL를 희석.</li>
		<li>하루 정밀 평가 (n = 6). 3 단계에 따라 5.4.1에서 각 샘플 솔루션을 처리 하 고는 크로마를 ECD HPLC 시스템으로 각 특 파 원 eluant의 20 µ L를 주입. 6 번 같은 날에에서 같은 작업을 할.</li>
		<li>표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 같은 화합물의 동일한 농도에서 하루에 6 개의 분석 실험의 상대 표준 편차 (RSD)-하루 정밀도로 결정 됩니다. 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.</li>
		<li>간 날 정밀 평가 (n = 6). 6 개의 순차적 일에서 매일 같은 시간에 5, 50, 100의 3 개의 농도 대 한 아군된 인공 소변 샘플을 준비 ng/mL, 5.4.1 및 5.4.2., 3 단계에 따라 각 분석 샘플 솔루션을 처리 하 고.</li>
		<li>결과 얻기 위해 크로마 매일 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluate 5.4.5에서 20 µ L를 주사. 표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 간 날 정밀은 3 개의 농도에서 아군된 인공 소변 샘플에서 분석 실험 수량 RSD 6 순차적 일에서에 표현 됩니다. 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는이 문서에서 설명 하는 자료에 관한 모든 금융 조직과 충돌의 관심을 증명 합니다.

이 문서에 제안 된 PFSPE 메서드는 중요 하 고 그것의 신속성, 단순성, 및 편의 의미 있을 수 있습니다. Adsorbents 프로토콜에 사용 되는 electrospun nanofibers, 높은 표면 영역 볼륨 비율, 있고 높은 효율으로는 analytes를 흡착 한. 절차만 nanofiber의 몇 밀리 그램 및 eluant 용 매, 작은 볼륨을 필요로 하 고는 analytes을 집중 하는 증발 단계를 필요 하지 않습니다. 여기, 우리 설정 검색에 대 한 효과적인 방법에 새 사용자를 허용 하는 HPLC ECD 기반 프로토콜에 대 한 자세한 개요와 3 catecholamines의 2 (네브라스카, E, 다, 고 MHPG, DOPAC) 그들의 대사 산물의 정량화를 제시 했습니다.
이 프로토콜의 우수성 주로에서 유래 4 개의 중요 한 단계는 절차 동안, 그림 1에서 보듯이: PCE PS nanofibers 매 빠른 흡수로 이어지...

카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 체액에 그들의 대사 산물 내용을 신경 기능에 영향을 하 고 대부분1에 응답 자극의 균형에 영향을 미칠 수 있습니다. Abnormities는 pheochromacytoma, ganglioneuroma, 신경, 신경 성 질환1,2등 질병의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 추출 및 체액에서 catecholamines에의 결정은 관련 질병의 진단에 의미가 있습니다. 그러나, catecholamines 생물 학적 샘플에 낮은 농도에서 존재 하 고 쉽게 산화 된다. 또한, 그들은 매우 많은 양의 중간3에서 간섭 때문에 elute 어렵다입니다. 따라서, catecholamines 생물 학적 체액에서의 동시 검출은 여전히 도전.
리뷰 요 catecholamines 스트레스, 측정 될 수 있습니다 그리고 그들의 수준은 신생아5처리 촉각 자극에 응답 하는 중요 한 생물 학적 마커 표시 되었습니다. 연구에 따르면 조 사건에서 고통을 모든 유아 뇌 부상4,,56에 대 한 위험이 있으며 부상 catecholamines 비정상적인 릴리스 체액에 관련된 문제를 발생할 수 있습니다. 고급 자기 공명 기술을 이전 단계7,8뇌 손상을 감지할 수 있는 존재 한다. 그러나, 첫 번째 48 h 내 비정상적인 neurodevelopmental 과정 하면 영구적인 뇌 손상 의료 이미지11분명 되지 않습니다. 게다가, 높은 비용 및 부족 한 악기 자원을 다른 요인 함께 인해 이러한 전문된 신경 이미징 기법에 대 한 액세스를 모든 신생아 단위에 대 한 없습니다. 그러나, (예: catecholamines 및 그들의 대사 산물) 쉽게 친근 하 고 실용적인 바이오 마커를 사용 하 여 이러한 단점을 극복할 수 고 인간의 체액에 바이오 마커 검사 수 있습니다 뇌 손상의 조기 진단에 도움이 프롬프트 이어질 신생 유아 neuroprotection9필요의 식별. 소변에서 catecholamines 체액 및 neuroactivity 기능으로 그들의 양 사이의 직접적인 상관 관계 때문에 간단 하 고 명백한 인덱스 수 있습니다.
생물 학적 체액 중 뇌 척추 액체 (CSF) 및 플라즈마 샘플 쉽지 않은 기존 외상 성 절차를 통해 얻을 수 그리고 그것은 또한 매우 어려운 접착 단백질 및 기타 불순물, 선도 하는 귀찮은 간섭 제거 하 고 시간이 걸리는 샘플링 과정 반복된 탐지를 위한 적합 하지 않습니다. 또한, 어린이 위한 아니다 거의 충격적인 패션에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 따라서, 요 샘플링은 샘플링의 다른 형태의 보다 더 나은 그것은 비 침략 적, 간편한 작동, 그리고 반복 해 서 행 해질 수 있다. 소변 샘플은 풍부 하 고 쉽게 저장 하 고, 큰 이점이 생물 샘플의 다른 형태의 표시.
생물 학적 체액에 catecholamines 척도를 주요 방법 등 radioenzymic 분석 실험10, 면역 매 분석 실험 효소 연결 된11, voltammetry12 열 렌즈 분석13. 하지만 단점이 존재, 복잡 한 작업 등 및 감지 하드 여러 대상을. 오늘, 지배적인 분석 기술은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)14, 그것의 높은 감도 및 좋은 선택 때문에 민감한 전기15 또는 fluorimetric 검출16와 결합 이다. 같은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 기술로 질량 분석 (LC/MS) 및 액체 크로마토그래피/질량 분석/질량 분석 (LC/MS/MS), 분석 및 정량화는 신경 전달 물질의 높은 얻을 수 있습니다 / 정확성과 특이성17,18. 그러나, MS 기술 비싼 계측 뿐만 아니라 대부분의 기존 실험실에서 보편적으로 적용 하는 방법 어렵게 실질적으로 자격 갖춘된 인력을 필요 합니다. ECD HPLC 시스템은 일반적으로 가장 전통과 임상 실험실에 있고 따라서 연구 그룹 화학 결정에 대 한 사용을 위한 일반적이 고 좋은 선택 되고있다 하지만 그들은 샘플의 청결을 시스템에 도입 해야 미 양19. 따라서, 정화 하 고 분석 하기 전에 샘플을 응축에 매우 중요 하다. 정화 단계에 대 한 고전적인 방법 이며 액체-액체 추출14,,1520 오프 라인 고체 상 추출, 활성된 알 루미나 열21,22 포함 하 여 및 diphenylborate (DPBA) complexation23,,2425,26.
명 리 외. 사용 하고있다 폴리머 수 지는 화학적으로 흡착 제는으로 크라운 에테르로 수정 인간의 소변에서 200727이후 catecholamines을 선택적으로 추출. 또한, 2006 년에, Haibo 그 외. 보여주는 boronate 선호도 추출 매 byutilizing에 대 한 손쉬운 종합 접근 functionalizable nanomagnetic 다면체 oligomeric silsesquioxane (포스) 기반된 nanomagnetic 합성, catecholamines에의 농축에 적용 인간의 소변 (더욱, 피 네 프 린 및 isoprenaline)28. 그들은 또한 나노 전기 불리고는 nanoscale 중합체 섬유 물자 형성 기술을 사용 하 여 작업을 수행 하기 위해 나노 소재 활용을 했다. 전기 프로세스는 작동 전압을 제어 하 고 다른 매개 변수29는 회전 솔루션의 내용을 변경 하 여 직경, 형태, 그리고 제품의 공간 맞춤을 조정할 수 있습니다. 기존 SPE 카트리지 비교, electrospun nanofibers는 추출 하 고 복잡 한 매트릭스에서 대상 analytes 풍부 매우 적합 한 그들은 높은 효율으로는 analytes를 adsorb 높은 표면 지역에 양 비율을 갖추고 있습니다 그리고 더 쉽게 제어 표면 화학 속성을 대상 화합물의 편리한 부착을 전시 한다. 이러한 속성을 있도록 SPE adsorbents, 크게 고체 단계와 탈 착 용 금액30,31,,3233감소에 대 한 좋은 선택. 소변 샘플에서 catecholamines에 대 한 electrospun nanofibers 폴리스 티 렌 (PCE-PS)와 apolymeric 크라운 에테르의 구성 3 catecholamines (네브라스카, E, 및 다)34를 선택적으로 추출 하 사용 되었다. 종이 선택적 크라운 에테르 흡착 네브라스카, E, 및 다, catecholamines 수소 결합을 형성을 통해 바인딩하는 정확한 기하학을 기반으로 했다 어떤의 대상 표시. 결과 표시 소재 크라운 에테르 효과적으로, 생물 학적 샘플에 포함 된 다른 간섭 화합물을 제거. 이 보고서에 의해 영감, 새로운 메서드는 catecholamines의 선택적 추출에 의해 개발 되었다 electrospun 복합 nanofibers PCE 추 구성의 사용
이 문서에 메서드를 보고 이전34 개선 되었고 성공적으로 E, 네브라스카, 고 다, 뿐만 아니라 그들의 대사 산물, MHPG 및 DOPAC, 소변에서 분석 뿐만 아니라 고용. 우리는 또한 흡착 과정의 메커니즘에 대 한 새로운 가능성을 탐험. 메서드 표시 만족 추출 효율과 5 analytes에 대 한 선택도 하 고 메서드가 perinatal 뇌 손상와 건강 한 컨트롤 위험이 높은 유아에서 소변의 분석에서 검증 되었다.

<table><tbody><tr><td>200 &마이크로; L 피펫 팁</td><td></td><td></td><td>컬럼은 나노 섬유를 포함하고,</td></tr><tr><td>PFSPE 추출 용</td><td>나노 섬유</td><td></td><td></td> 재료</tr><tr><td>강철 막대 (직경 약 0.5mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr>를 기<tr><td>밀 플라스틱 주사기 (5ml)</td>에 나노 섬유를 채우고, <td></td><td></td> 팁 메탄올 Sinopharm 화학 시약의 <td>끝으로 용액을 압축합니다.</td></tr><tr><td></td><td>, Ltd</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>디페닐보린산 2-아미노에틸 에스테르(DPBA)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-106408</td><td>복합 시약</td></tr><tr><td>노르에피네프린(NE)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-9512</td><td>분석물</td></tr><tr><td>3-메톡시-4-하이드록시페닐글리콜(MHPG)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H1377</td><td>분석물</td></tr><tr><td>에피네프린(E)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>100154-200503</td><td>분석물</td></tr><tr><td>3, 4- 디하이드록시페닐아세트산(DOPAC)</td><td>시그마-Aldrich.Inc</td><td>D-9128</td><td>분석물</td></tr><tr><td>도파민(DA)</td><td>시그마-알드리크.Inc</td><td>H-8502</td><td>분석물</td></tr><tr><td>3, 4-디하이드록시벤질아민 하이드로브로마이드(DHBA)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>858781</td><td>내부 라벨</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>75-05-8</td><td>엘루리안 및 이동상</td></tr><tr><td>인산</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>7664-38-2</td><td>eluriant</td></tr><tr><td>요산</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>69-93-2</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>크레아티닌</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>60-27-5</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>구연산 삼나트륨</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>6132-04-3</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm 화학 시약Co. , Ltd</td><td>7447-40-7</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>12125-02-9</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>SWC0140326</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>C2Na2O4</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>62-76-0</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>NaSO4</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>7757-82-6</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>인산수소</td> 나트륨 <td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>10039-32-4</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>요소</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>57-13-6</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>7647-14-5</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>10034-99-8</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>10035-04-8</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>7647-01-0</td><td>인공 소변</td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>77-92-9</td><td>인공 소변 및 이동상</td></tr><tr><td>EDTA 이나트륨 염</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>34124-14-6</td><td>이동상</td></tr><tr><td>단금속 오르토 인산 나트륨</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>7558-80-7</td><td>인공 소변 및 이동상</td></tr><tr><td>1- 헵탄 술폰산 나트륨 염</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>22767-50-6</td><td>이동상</td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>Sinopharm 화학 시약Co., Ltd</td><td>1310-73-2</td><td>이동상</td></tr><tr><td>페닐 보론산 칼럼 (PBA 칼럼)</td><td>Aglilent</td><td>12102018</td><td>PBA 추출</td></tr><tr><td>Inertsil&reg; ODS-3 5 &마이크로; 남 4.6&배; 150mm 열</td><td>Dikma</td><td>5020-06731</td><td>분리 용 HPLC 컬럼</td></tr><tr><td>SHIMADZU SIL-20AC 돌출 자동 샘플러</td><td>Shimadzu Corporation, 일본</td><td>SIL-20AC</td><td>자동 주입 eluriant</td></tr><tr><td>SHIMADZU LC-20AD 고성능 액체 크로마토 그래</td>피 <td>Shimadzu Corporation, 일본</td><td>LC-20AD</td><td>HPLC 펌프</td></tr><tr><td>SHIMADZU L-ECD-60A 전기 화학 검출기</td><td>Shimadzu Corporation, 일본</td><td>분석물용</td> <td>L-ECD-60A</td> 검출기</tr><tr><td>ASAP 2020 가속 표면적 및 기공계 시스템</td><td>Micromeritics, 미국</td><td></td><td>표면 및 다공성 분석기&nbsp;</td></tr></tbody></table>

추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

추출 및 생물 학적 체액에서 카 테 콜 아민 신경 전달 물질의 분석은 신 경계 기능 및 관련된 질환 평가에 매우 중요 하지만 그들의 정확한 측정은 여전히 도전 이다. 많은 프로토콜 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 포함 하 여 악기의 다양 한 신경 전달 물질 측정에 대 한 설명 했습니다. 그러나, 단점, 복잡 한 작업 또는 감지 하드는 피할 수 없는 여러 대상 이며 현재, 지배적인 분석 기술은 여전히 HPLC로 인해 민감한 전기 또는 fluorimetric 탐지와 결합 그것의 높은 감도 그리고 좋은 선택입니다. 여기, 상세한 프로토콜에서에서 설명 하는 전처리 및 전기 화학적 검출 (HPLC-ECD) 고압 액체 크로마토그래피와 catecholamines의 검출을 위한 electrospun 복합 nanofibers 구성을 사용 하 여 유아의 실제 소변 샘플 폴리스 티 렌으로 adsorbent와 고분자 크라운 에테르의 포장 섬유 고체 상 추출 (PFSPE) 메서드 라고도합니다. 우리는 소변 샘플을 쉽게 nanofiber 포장 단단한 단계의 열을 어떻게 샘플에서 analytes는 빠르게 농축 될 수 있다, precleaned 수 있습니다 desorbed, 방법과 ECD 시스템에서 발견을 보여줍니다. PFSPE 감소 시간, 비용, 목표의 손실의 감소에 대 한 수 있도록 생물 학적 샘플에 대 한 전처리 절차를 크게 간소화 합니다.
전반적으로,이 작품에서는 세 monoamine 신경 전달 물질 (노르 (NE), (E) 피 네 프 린, 도파민 (DA))의 동시 결정 하 고 두 개의 HPLC ECD 시스템에 결합 하는 고체 상 추출에 대 한 간단 하 고 편리한 프로토콜 그들의 대사 산물 (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) 및 3, 4-dihydroxy-phenylacetic 산 (DOPAC)) 유아의 소변에서. 설립된 프로토콜 요도 catecholamines의 차이 주 뇌 손상 위험이 높은 유아와 건강 한 컨트롤 사이의 그들의 대사 산물을 평가 하기 위해 적용 되었습니다. 비교 분석으로 카 테 콜 아민 대사 산물의 경우 유아의 뇌 손상에 대 한 위험이 조기 진단 위한 중요 한 후보 마커를 있을 수 있습니다 나타내는 두 그룹 사이의 요도 MHPG에 상당한 차이가 나타났다.

이 프로토콜은 간단 하 고 편리한 PFSPE 메서드 소변 샘플을 pretreat HPLC ECD 시스템;을 통해 탐지를 위한 5 catecholamines 풍부 하 프로세스의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜은 주로 4 단계 활성화, 로드, rinsing, 그리고 방출-PCE PS nanofibers 및 간단한 고체 상 추출 장치의 소량과 함께 포함 되어 있습니다. PCE PS nanofibers의 형태는 표면 및 다공성 분석기를 사용 하 여 평가 했다 ( 재료의 표참조). 텍스처 속성에 내기 (Brunauer, 모트, 텔러) 표면 지역, 기 공 볼륨 및 기 공 크기-2.8297 m2 g-1, 0.009 c m3 g-1, 그리고 12.76 nm, 각각. 이러한 데이터 프로토콜에 사용 되는 재료는 높...

선물이 3 monoamine 신경 전달 물질의 동시 결정 하 고 두 유아 소변에 그들의 대사 산물의 전기 화학 검출 (ECD) 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 결합 하 여 편리한 고체 상 추출. 우리 또한 유아에 대 한 뇌 손상의 조기 진단에 대 한 잠재적인 biomarker로 대사 산물 MHPG를 식별합니다.

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

이 절차의 전반적인 목표는 전기화학적 검출을 통한 고압 액체 크로마토그래피와 결합된 편리한 고체상 추출을 통해 유아의 소변에서 3개의 모노아민 신경전달물질과 2개의 대사산물을 동시에 측정하는 것입니다. 이 방법은 짧은 시간에 쉽게 작동하여 전체 샘플에서 불안정한 표적 화합물을 예측하고 측정할 수 있습니다. 예시는 좁은 섬유로 채워진 고체면 쿼럼으로 쉽게 사전 세척할 수 있으며, 샘플의 분석물은 전기화학 검출 시스템에서 쉽게 농축, 용해 및 검출할 수 있습니다.우리는 생물학적 유체에서 카테콜아민 신경전달물질의 추출 및 분석이 저항성 기능 및 관련 질병을 평가하는 데 중요하다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 빛 노출을 피해야 하고 전처리 시간을 가능한 한 짧아야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시연하기 위해 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Lanlan Wei와 Qing Han이 있습니다.시작하려면 2mg의 화합물을 1ml의 증류수에 용해시켜 DPBA 용액의 1ml당 2mg을 준비합니다. 용액을 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하십시오. 분석물 증량제를 준비할 때 카테콜아민의 화학 구조와 특성이 불안정하고 쉽게 분해되기 때문에 전처리 공정 증량제는 매우 빨라야 하며 얇은 햇빛에 노출되는 것을 피해야 합니다.노르에피네프린, 에피네프린, 도파민, MHPG, DOPAC 및 내부 표준 DHBA 1.0mg을 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 1.0ml의 증류수를 첨가하여 0.01 리터당 몰 염산 용액에 용해되어야하는 에피네프린을 제외한 각 화합물을 용해시킵니다. 분석물이 완전히 용해될 때까지 어두운 곳에서 고속으로 준비된 표준물질을 진동시킵니다.이들은 주요 재고이며 최대 몇 주 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 노르에피네프린, 에피네프린, 도파민, DOPAC 및 MHPG의 2차 분석물 스톡을 준비하려면 각 1차 분석물 스톡의 5마이크로리터를 별도의 5밀리리터 원심분리 튜브에 담긴 4, 975마이크로리터의 증류수로 옮깁니다. 이러한 용액을 매일 신선하게 준비하고 사용할 때까지 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하십시오.DHBA의 경우, 5마이크로리터의 1차 스톡을 5밀리리터 원심분리기 튜브에 담긴 4, 995마이크로리터의 증류수에 넣고 섭씨 4도의 어두운 곳에 따로 보관합니다. 2차 분석물 스톡으로 추가 희석을 수행하여

a-convenient-method-for-extraction-analysis-with-high-pressure-liquid

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 프로토콜은 세포에서 유리 및 에스테르화된 생체 활성 지방산의 추출 및 분석을 보여줍니다. 지방산은 안정 동위원소 희석, 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기 화학 이온화, 다중 반응 모니터링 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)을 사용하여 정확하게 정량화됩니다.

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

포스트 컬럼 유도체화(PCD)를 사용하는 방법을 위한 반응 흐름 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

포스트 컬럼 유도체 화 반응 흐름 고성능 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여

실시간 고해상도 질량 분석 다변량 통계 분석을 직접 분석에 의해 식물 재료의 종을 식별하는 방법이 제공된다.

실시간 고해상도 질량 분석에 직접 분석을 사용하여 식물 소재의 신속한 높은 처리량 종 확인

혼합 모드 양이온 교환 (MCX) 96- 웰 마이크로 플레이트상에서 효율적인 고체상 추출과 결합 된 선택적이고 민감한 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)이 유리 3- 니트로 티로신의 측정을 위해 개발되었다 3-NT)을 임상 적으로 사용하기에 적합합니다.

임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합

Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.

고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가

여기 멀티 주입-모 세관에 따라 품질 관리와 향상 된 해상도 및 약물 남용 및 그들의 대사 산물의 대형 패널의 검출에 대 한 허용 하는 포괄적인 약물 감시 하는 높은 처리량 방법 설명 전기 이동 법 질량 분석입니다.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.

급성 뇌 슬라이스에서 내인성 모아민 방출 측정을 위한 판 기반 분석

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

트로판 알칼로이드의 고속 질량 분석법(MS)/질량 분석법(MS) 기반 주석 및 분류를 위한 방법을 제시하며, 이는 트로판 함유 샘플의 예비 복제 및 분리를 위한 새로운 알칼로이드의 발견 모두에 유용합니다.

천연 제품 연구에서 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법의 응용 분야: 사례 연구로서의 트로판 알칼로이드

배우세요 고압 액체 크로마토그래피와 전기화학 검출을 결합한 고체상 추출법으로 영아 소변의 카테콜아민 신경전달물질과 대사산물을 동시 분석하는 방법입니다. MHPG 바이오마커를 활용한 뇌손상 조기 진단에 임상 적용 가능성이 있습니다.

추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

더 많은 동영상 탐색