추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 전기화학적 검출을 통한 고압 액체 크로마토그래피와 결합된 편리한 고체상 추출을 통해 유아의 소변에서 3개의 모노아민 신경전달물질과 2개의 대사산물을 동시에 측정하는 것입니다. 이 방법은 짧은 시간에 쉽게 작동하여 전체 샘플에서 불안정한 표적 화합물을 예측하고 측정할 수 있습니다. 예시는 좁은 섬유로 채워진 고체면 쿼럼으로 쉽게 사전 세척할 수 있으며, 샘플의 분석물은 전기화학 검출 시스템에서 쉽게 농축, 용해 및 검출할 수 있습니다.

우리는 생물학적 유체에서 카테콜아민 신경전달물질의 추출 및 분석이 저항성 기능 및 관련 질병을 평가하는 데 중요하다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 빛 노출을 피해야 하고 전처리 시간을 가능한 한 짧아야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시연하기 위해 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Lanlan Wei와 Qing Han

시작하려면 2mg의 화합물을 1ml의 증류수에 용해시켜 DPBA 용액의 1ml당 2mg을 준비합니다. 용액을 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하십시오. 분석물 증량제를 준비할 때 카테콜아민의 화학 구조와 특성이 불안정하고 쉽게 분해되기 때문에 전처리 공정 증량제는 매우 빨라야 하며 얇은 햇빛에 노출되는 것을 피해야 합니다.

노르에피네프린, 에피네프린, 도파민, MHPG, DOPAC 및 내부 표준 DHBA 1.0mg을 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 1.0ml의 증류수를 첨가하여 0.01 리터당 몰 염산 용액에 용해되어야하는 에피네프린을 제외한 각 화합물을 용해시킵니다. 분석물이 완전히 용해될 때까지 어두운 곳에서 고속으로 준비된 표준물질을 진동시킵니다.

이들은 주요 재고이며 최대 몇 주 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 노르에피네프린, 에피네프린, 도파민, DOPAC 및 MHPG의 2차 분석물 스톡을 준비하려면 각 1차 분석물 스톡의 5마이크로리터를 별도의 5밀리리터 원심분리 튜브에 담긴 4, 975마이크로리터의 증류수로 옮깁니다. 이러한 용액을 매일 신선하게 준비하고 사용할 때까지 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하십시오.

DHBA의 경우, 5마이크로리터의 1차 스톡을 5밀리리터 원심분리기 튜브에 담긴 4, 995마이크로리터의 증류수에 넣고 섭씨 4도의 어두운 곳에 따로 보관합니다. 2차 분석물 스톡으로 추가 희석을 수행하여 표준 곡선을 생성합니다. 용액을 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하고 매일 신선하게 준비하십시오.

다음으로, 적절한 농도의 표준 스톡을 사용하여 ECD 검출기의 최적 전압을 테스트합니다. 전압을 변화시켜 분석물이 가장 잘 피크 모양을 갖는 값을 찾습니다. 10ml의 용리액 용매를 준비하려면 5.5ml의 증류수를 사용한 다음 1.5ml의 아세토니트릴과 3ml의 인산을 물에 한 방울씩 첨가합니다.

이동상을 준비하려면 텍스트 프로토콜에 나열된 성분을 깨끗한 1리터 병에 넣어 측정합니다. 40 밀리리터의 아세토 니트릴과 증류수를 1, 000 밀리리터에 첨가하십시오. 용액의 물질이 모두 용해될 때까지 15분 동안 초음파로 교반하고 진동합니다.

유리 전극이 있는 pH 측정기를 사용하여 포화 수산화나트륨 용액으로 이동상의 pH 값을 4.21로 조정합니다. 0.45미크론 폴리비닐리덴 플루오라이드 미세다공성 멤브레인과 진공 흡입 장치로 이동상을 여과하여 불순물을 제거합니다. 사용하기 전에 매번 이동상을 탈기하기 위해 15분 동안 초음파 진동을 사용하십시오.

그런 다음 소변 샘플을 1, 510배 G에서 실온에서 10분 동안 와류 및 원심분리하여 대부분의 미립자 간섭을 제거합니다. 상층액을 모으고 추가 실험을 위해 퇴적물을 버립니다. 분석물을 효과적으로 추출하려면 원심분리 직후 충전된 섬유 고체상 추출 또는 PFSPE 전처리를 진행하십시오.

나노섬유를 활성화하려면 5밀리리터 주사기를 사용하여 PFSPE 컬럼을 통해 100마이크로리터의 메탄올과 100마이크로리터의 물을 천천히 적하 방식으로 순차적으로 누릅니다. 소변 샘플은 소수성을 개선하고 카테콜아민과 대사 산물이 섬유에 흡수되도록 돕기 위해 DPPA 용액과 혼합되어야 합니다. DHBA 용액도 내부 표준으로 추가해야 합니다.

100 마이크로리터의 소변 샘플과 100 마이크로리터의 밀리리터 DPBA 용액 및 30 마이크로리터의 DHBA 내부 표준물질 용액 100 마이크로리터를 0.5 밀리리터 Eppendorf 튜브에 혼합합니다. 그런 다음 공기 압력의 힘을 사용하여 5ml 가스형 플라스틱 주사기로 PFSPE 컬럼을 통해 혼합 샘플 용액을 누릅니다. 5ml 가스형 플라스틱 주사기를 사용하여 컬럼을 세 번 침출하여 100마이크로리터의 DPBA 용액을 SPE 컬럼에 로드하고 공기 압력으로 카트리지를 통해 용액을 천천히 밀어 넣습니다.

이 헹굼 단계는 DPBA 용액이 분석물이 유지되는 동안 불순물을 제거할 수 있어 분석물에 대한 감도와 선택성을 향상시킬 수 있기 때문에 필요합니다. 다음으로, PFSPE 컬럼에 50마이크로리터의 용리액을 주입하고 컬럼을 통해 밀어 넣어 0.5ml Eppendorf 튜브로 용리액을 수집합니다. HPLC 탈기 장치를 켜서 시스템의 공기를 제거합니다.

시료 분석 전에 시스템은 기준선 잡음을 평형화하고 줄이기 위해 이동상으로 0.5시간 이상 실행해야 합니다. 자동 샘플러를 사용하여 용리액 20마이크로리터를 샘플링한 다음 HPLC ECD 시스템에 주입합니다. 실행이 완료되면 감지기 인터페이스를 사용하여 감지기 셀을 끕니다.

기기가 손상될 수 있으므로 감지기 뒷면에 있는 스위치로 셀을 끄지 마십시오. 이동상 조성을 10%메탄올과 90%물로 수동으로 변경합니다. 최소 30분 동안 실행한 후 이동상을 HPLC 등급 메탄올로 수동으로 변경합니다.

메탄올로 보호하기 위해 약 15분 동안 시스템을 실행합니다. 권장 실행 시간 내에 이 단계를 실행하지 않으면 컬럼과 검출기가 손상될 수 있습니다. 흐름을 끈 다음 탈기 장치를 끕니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 카테콜아민 분석을 진행합니다. 표적과 내부 표준물질이 있는 스파이크수 샘플의 크로마토그램은 추출 없이 표시됩니다. 프로토콜의 HPLC 조건에서 PFSPE 방법의 5개 표적 피크는 잘 분리되어 있으며 상용 페닐보론산 카트리지에 의해 추출된 피크보다 훨씬 높습니다.

또한 PBA 카트리지 추출 결과에서 DOPAC 피크가 나타나지 않았는데, 이는 PBA 컬럼이 DOPAC을 추출할 수 없음을 나타냅니다. 소변 샘플을 추출할 때 PFSPE 방법은 피크 식별이 우수하여 표적을 추출할 수 있을 뿐만 아니라 소변의 간섭 대부분을 제거할 수 있었습니다. 검량선은 피크 면적의 비율을 플로팅하여 각 화합물에 대해 구성되었으며, 낮은 농도에서 우수한 선형성을 보여주었습니다.

실제 소변 샘플로 검증하기 위해 28명의 고위험 영아와 22명의 건강한 영아의 소변 샘플을 테스트했습니다. 일부 카테콜아민은 고위험군과 건강군 간에 유의한 차이가 없었지만, 고위험군 영아는 대조군보다 MHPG 대사산물의 양이 더 많았다. 따라서 소변 MHPG 수치는 고위험 영아를 조기에 식별할 수 있는 잠재적인 지표가 될 수 있습니다.

이 기술을 마스터하면 몇 분 안에 완료할 수 있습니다. 절차를 시도하는 동안 재를 신선하게 준비하고, 걱정을 빨리 하고, 직사광선에 노출되지 않도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 흡수 및 헹굼 단계에서 디페닐보레이트-산-용액 첨가도 중요합니다.

이 절차에 따라, 혈장 또는 뇌척수액에서 카테콜아민 및 대사 산물의 종결 부족을 측정합니다. 다른 생물학적 유체를 테스트할 때 이 프로토콜의 보편성을 결정하기 위해 Alsliver를 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 신경 발달 결핍과 어린이 샘플의 소변 카테콜아민 수치 사이의 관계를 연구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 나이르 수치와 간단한 장치로 고체상 추출 방법을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, PCE PS 공기 비뷸리스 기업 폐기물 DPBA는 소변 샘플에서 카테콜아민 신경 전달 물질을 청소하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 유아의 뇌 손상 위험이 있는 카시스의 조기 진단으로 확장됩니다. 비교 분석 결과 자폐증 아동의 단항 MHPG에서 비정상적인 차이가 발견되어 카테콜아민 대사 산물이 중요한 후보 마커일 수 있음을 나타냅니다.