Name: 마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 마우스 배아 심장 조상 세포의 전체 마운트 면역형광 및 정량적 체적 분석 방법입니다. 이 기술은 심장 발생 과정에서 세포 분포를 정량적으로 평가하고 다른 장기 연구에도 적용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH/NHLBI R56 HL128646 및 Mindich 보건 개발 연구소 (MCHDI) (노스다코타)에 ISMMS에 의해 투자 되었다. E.B.는 NIH/NIDCR Traineeship T32 HD075735에 의해 지원 됩니다. 현미경 및 이미지 분석 Tisch 암 연구소의 마운트 시 나이 P30 CA196521-암 센터 지원 그랜트에 의해 부분에서 지원 되는 시내산에서 아이 칸 의학 학교에서 현미경 코어에서 수행 되었다.

여기에서 설명한 모든 방법을 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 아이 칸의과 시내산에서.
 1. 수확 및 처리 심장 초승달 단계 배아 <ol><li>비옥한 스 터 드 남성으로 비옥한 여성 마우스 친구.</li>
	<li>확인 질 결합의 존재에 대 한 플러그 무딘 프로브 또는 집게를 사용 하 여. 플러그 감지 당일 정오 배아 간주 됩니다 하루 (E) (참조 그림 1A 전체 타임 라인에 대 한) 0.5. 
	참고: 플러그 확인 되어야 합니다 아침에, 그들은 하루 내내 손실.</li>
	<li>8 번째 날 (E8.25)의 아침에 희생 임신 댐 공동 2 흡입, 또는 지역 및 기관 규정. 
	참고: 정확한 타이밍 종속 스트레인 수 및 형태에 의해 실험적으로 결정 되어야 합니다.</li>
	<li>발산을 최소화 하 고 지역을 청소 70% 에탄올과 마우스의 복 부를 스프레이. 피부와 체 벽을 통해 복 부 절 개를 수행 하 여는 내장 노출.</li>
	<li>자 궁을 찾아서 동물에서 전체 자 궁 경적을 조심 스럽게 제거 합니다. 자 궁 끝에 진행 하는 동안 자 궁에서 지방 트리밍 한 수 란 관, 위에서 절단 하 여 시작 합니다. 자 궁 경부를 통과 하 고는 다른 수 란 관, 전체 자 궁 출시를 절단의 상단 끝에 계속.</li>
	<li>장소 10 cm에 궁 요리와 성 식 염 수 (PBS, pH 7.4)를 초과 피를 씻어 버퍼링. 서브는 배아를 포함 하는 각 deciduum 사이 mesometrium를 절단 하 여 자 궁 해 부. 신선한 PBS 가진 6 cm 접시에 배아를 전송.</li>
	<li>해 부 현미경을 사용 하 여 미세 집게 (#5) decidual 조직에서 자 궁 조직을 제거.</li>
	<li>사용 하 여 집게, 신중 하 게 태아를 계시 하기 위하여 deciduum의 배아 절반의 팁을 슬라이스. 태아를 밖으로 밀어를 조심 스럽게 태아를 꺼내 deciduum 꼬집어.</li>
	<li>배아 ( 그림 1B)의 형태를 손상 없이 최대한 멀리 extraembryonic 조직 해 부.</li>
	<li>신선한 PBS 가진 1.5 mL 튜브에 배아를 배치 하 고 얼음에 배치를 전송 피 펫을 사용 합니다. 계속 하기 전에 1.7-1.9 나머지 배아에 대 한 반복.</li>
	<li>Aspirate PBS 그리고 PBS 가진 한 번 린스입니다. PBS를 발음. 
	참고: 손상 또는 배아를 건조 하지 않고 가능한 많은 PBS를 제거 하려고 합니다. 솔루션의 수동 제거 모든 단계에서 배아의 손실을 방지 하기 위해 좋습니다.</li>
	실시간에서 1 시간에 대 한 PBS에 <li>수정 배아 4 %paraformaldehyde (PFA) 
	참고: 배아에 고정 될 수 있는 오버 나이트 (O/N) 4 ° c.</li>
	<li>PBS로 3 회 린스입니다. 면역 형광 검사 진행 준비가 될 때까지 4 ° C에서 배아를 유지. 
	참고: 포인트를 일시 중지 합니다. 태아 수 있습니다 안전 하 게 저장 PBS에 4 ° C에서 몇 주 동안.</li>
</ol> 2. 면역 형광 검사 얼룩 참고: 외피 조건 아래 서로 다른 일정에 맞게 조정 될 수 있다. 부드러운 진동 또는 모든 긴 인큐베이션 단계 락의 사용은 권장.
<ol><li>PBS를 제거 하 고 차단 버퍼 (0.5% 사포닌, 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에)의 1 mL을 추가.</li>
	<li>품 어 실시간에 적어도 4 h 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.</li>
	<li>블로킹 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 혼합물 희석 블로킹 버퍼에 추가. O/N 4 ° c.에 품 어 
	참고: 항 체에 대 한 참조 자료 섹션 사용 하 고 희석을 제안 했다. 항 체 희석은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 심장 초승달에 대 한 참조 얼룩으로 Nkx2-5의 사용 권장 이며 다운스트림 핵심 이미지 세분화 및 분석 단계.</li>
	<li>포부에 의해 1 차 항 체를 제거.</li>
	<li>1 h 각 0.1%에 대 한 3 번 세척 PBS에 트리톤.</li>
	<li>세척 제거 하 고 차단 버퍼에 희석 하는 이차 항 체 혼합물을 추가 합니다. 실시간에서 3 h에 대 한 품 어 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.</li>
	<li>워시 1 h 각 0.1%에 대 한 3 회 PBS에 트리톤. 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.</li>
	<li>Counterstain 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) PBS에 10 분 대 한 
	참고:이 counterstain 수행할 수 있습니다 동시에 이차 항 체.</li>
	<li>세척 2 번 5 분 각각 0.1%와 PBS에서 트리톤.</li>
	<li>천천히 방지 페이드 설치 미디어 (2 %w / v n-틸 gallate (nPG), 90% 글리세롤, 1 x PBS;에 배아를 일시 중단 자세한 내용은 대 한 참조 자료 섹션). 장착 하기 전에 적어도 1 시간을 equilibrate 수 있습니다. 부드럽게 배아 방지 페이드 솔루션에 수 있도록 주기적으로 튜브 영화. 
	참고: 포인트를 일시 중지 합니다. 배아 마운트 이미지 준비까지 방지 페이드 솔루션에서 며칠 동안 저장 될 수 있다.</li>
</ol> 3. 현미경 검사 법에 대 한 배아를 장착 <ol><li>준비 현미경 슬라이드 더블 막대기 테이프 또는 실리콘 스페이서를 사용 하 여 장착. 더블 막대기 테이프를 사용 하는 경우 5-6 층 약 15-20 m m의 두 개의 병렬 스택 떨어져 확인 합니다. 이 배아를 놓고 coverslip ( 그림 1C) 확보에 충분 한 공간을 떠날 것 이다.</li>
	<li>는 슬라이드 더블 막대기 테이프 사이 안티 페이드의 15 µ L 드롭 장소. 신중 하 게 슬라이드에 하나의 배아를 전송. 
	참고: 둘 이상의 태아를 슬라이드에 배치할 수 있습니다. 그러나, 이후의 방향 단계 더 어려운 여러 개의 배아, 그리고 긴 기간 이미징 사진 표백 될 수 있습니다.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 해 부 현미경, 아래 위치 태아는 앞쪽 면 슬라이드의 긴 축에 맞춰 몸 축 슬라이드에서. 그림 1C 장착 설치의 회로도 참조 하십시오.</li>
	<li>신중 하 게 장소는 coverslip 샘플 더블 막대기 테이프의 한 스택에 한쪽을 쉬고 부드럽게 될 때까지 다른 테이프 연락처는 coverslip를 낮은 집게를 사용 하 여. 
	참고: 3.3 및 3.4 단계는 영상에 대 한 배아의 올바른 방향을 위해 중요 합니다. 앞쪽 방향으로 후부 따라 coverslip 낮추어 태아 롤 하지 해야 하 고 심장 초승달 지역 슬라이드 이미지는 거꾸로 한 현미경에 이상적입니다에서 방향이 있을 것입니다.</li>
	<li>는 피 펫을 사용 하 여 추가 방지 페이드 슬라이드 샘플 저장/이미징 동안 밖으로 죽기에서 유지 하는 coverslip 사이 추가.</li>
</ol> 4. Confocal 영상 <ol><li>취득 이미지 보기의 한 필드에서 캡처 전체 심장 초승달 지역에 대 한 수 높은 배율 목표를 사용 하 여. 나이 키스 트 샘플링 속도 사용 하 여 x-y-z 복 치수를 결정. 대부분의 현미경 제조 업체 해야한다는 &#34; 최적화 &#34; 나이 키스 트 샘플링 되도록 버튼. 
	참고: Nkx2-5에 대 한 얼룩는 도움이 여기, 그것 심장 초승달 지역 전체 윤곽을 그리 다 것입니다. 작은 Z 단계 크기 (오버 샘플링) 더 나은 3D 모델링 결과 얻을 것 이다 하지만 확장된 수집 시간 및 몇 가지 샘플에 대 한 표백으로 이어질 수 있습니다.</li>
	<li>이미징 표준 최고의 이미징 방법을 사용 하 여 매개 변수를 설정 합니다. 즉, 가장 낮은 가능한 레이저 강도 사용 하 여 각 fluorophore에 대 한 좋은 신호 대 잡음 비율을 달성 하 고 이득 선택 수준 신호를 흠뻑 젖 게 하지 않고 넓은 동적 범위를 생성 하는 오프셋을. 
	참고: 매개 변수 사이의 직접 비교 샘플 이미지와 일치 수 있습니다. 이것은 다운스트림 3D 분석 및 정량화에 대 한 특히 중요 하다.</li>
</ol> 5. 이미지 분석 및 양적 3D 모델링 참고: 이 프로토콜에 대 한 이미지는 Imaris 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 분석 되었다. 비슷한 분석 대체 패키지를 사용 하 여 있을 수 있습니다. 아래 설명 참조 채널 (즉 Nkx2-5)에 대 한 분석 파이프라인 및 한 실험적인 채널 (즉 YFP) 포함 한다. 추가 채널 단계 반복을 통해 분석할 수 있습니다. 아래 분석을 복제를 사용할 수 있는 제공 된 예제 데이터 집합 되었습니다.
<ol><li>Imaris 경기장 보기에 원시 이미지 데이터 세트를 로드 하 고 Surpass 보기에서 원하는 배아에 대 한 파일을 엽니다. 데이터는 성능 측정 (최대) 모드에서 3 차원 보기에 로드 됩니다. 디스플레이 조정 창을 열고만 참조 채널을 선택 합니다.</li>
	<li>더 좋은 시각화를 위해 필요한 경우 이미지의 임계값을 조정 합니다. 이 분석 조정 감마 신호 대 잡음 비율 세분화를 위한 너무 낮은 경우. 
	참고: 지금까지 있는 비 선형 조정, 감마 보정을 수행 하는 경우에 조정 된 이미지 강도 측정 또는 비교에 사용할 수 없습니다. 이 단계에서 신호 대 잡음 비율을 만족 하지 않으면 더 이미지 사전 처리 (즉, 조명 수정, 가우스 흐림 또는 다른 필터링)을 수행할 수 있습니다. 데이터 집합에 있는 모든 이미지에 대 한 같은 전처리 단계를 수행 해야 합니다 사전 처리를 수행 하려는 경우.</li>
	<li>표면 알고리즘 대화를 사용 하 여 참조 채널에 대 한 새로운 표면을 작성.
	<ol><li>선택은 &#34;만 지역의 관심을 세그먼트 &#34; 확인란.</li>
		<li>경계 상자 영역으로 참조 얼룩에 의해 delineated 관심 (ROI, 즉 심장 초승달 영역) 영역 포함 되도록 조정.</li>
		<li>소스 채널 드롭다운 메뉴에서 참조 채널을 선택합니다. 스무 딩 (z 복 크기와 같음)에 대 한 기본 설정은 일반적으로 충분 하지만 경험적 최적화 필요할 수 있습니다. 이 분석에 대 한 사용 하 여 부드럽게 반 z 복-크기.</li>
		<li>절대 강도 의해 임계 처리 수행입니다. 표면 채널 신호 넘어 확장 되지 않습니다 있도록 조정 슬라이더를 사용 하 여 하한값. 
		참고: 셀 쉽게 delineated 될 수 있는 특정 이미지를 포함 시킬 수 있습니다는 &#34; 개체를 감 동적 분할 &#34; 알고리즘 추가 배경에서 신호를 분리 하.</li>
		<li>복 번호 또는 볼륨 개체를 필터링 하 고 거부 배경 (작거나 Nkx2-5 지역 이외의 지역에서 발견) 개체는 알고리즘 생성 될 수 있습니다. 알고리즘 완료.</li>
	</ol></li> <li>새로 만든된 표면을 사용 하 여 실험 채널에 대 한 마스크 채널을 만듭니다.
	<ol><li>선택 사용 선택은 &#34; 마스크 Sel... ͟ &#34; 편집 창에서 함수.</li>
		<li>관심 (즉 YFP)의 실험적인 채널을 선택합니다. 있는지 확인은 &#34; 마스크를 적용 하기 전에 채널을 중복 &#34; 확인란이.</li>
	</ol></li> <li>디스플레이 조정에 창만 마스크 채널을 선택 합니다. 5.3 5.3.5 단계를 수행 하 여 마스크 채널 새로운 서피스를 생성. 
	참고:이 시점에서 그것은 도움이 될 수 있습니다 3D 모델의 시각화를 촉진 하기 위하여 각 마스크의 모양을 조정: 각 서피스를 선택 하 고 필요에 따라 색상 탭 조정 기본 색상 및 투명도 선택. 표면 색상 중첩 때 병합 하지 마십시오.</li>
	<li>선정 각 표면 체적 데이터를 얻으려면 통계 탭을 선택 합니다. 에 &#34; 상세 &#34; 하위 탭, 선택 &#34; 평균 값 &#34; 드롭-다운 메뉴에서. 생성 된 테이블의 금액 열에 표면의 총 볼륨을 찾을 수 있습니다. 
	참고: 생성 된 표면에 잘못 된 조각 (즉, 배경 신호에서 제외 되지 않습니다 동안 세분화 또는 주요 표면에서 불연속 조각) 있으면 그것은 해야 할 수 있습니다 총 볼륨을 수동으로 계산 또는 볼륨 또는 복의 수에 의해 표면 필터 및 신호 세그먼트에만 계산에 포함 됩니다. 표면의 각 부분에 대 한 볼륨을 선택 하 여 찾을 수 있습니다 &#34; 모든 값 &#34; 드롭-다운 메뉴에서. 해당 영역이 제외 값 결정에 에이즈 노란색 표시 되도록 각 값을 선택 하면.</li>
</ol>

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</ol>

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위의 프로토콜 후 이식 마우스 배아의 높은 품질의 전체 마운트 면역 형광 이미지에서 양적 데이터를 얻기 위한 전략을 설명 합니다. 올바르게 수행 하는 경우이 단계를 통해 생성 된 3 차원 체적 데이터 태아 내의 여러 도메인의 비교 및 intersectional 분석에 사용할 수 있습니다. 잘 설립 참조 구조에 비해 소설 세포 인구를 조사할 때 설명 하는 접근을 마스킹 표면 신호 특정 사용입니다.
이 방법은 기존의 접근 방법에 뚜렷한 장점을 제공 믿습니다. 넓은 필드 영상과 전체 마운트 면역 형광 세포 해상도 부족 하지만 조직 수준 정보를 제공할 수 있습니다. 반대로, 직렬 섹션의 면역 형광 이러한 데이터 부족 전체 마운트 영상의 3 차원 장점은 비록 자세한 세포 수준의 해상도 줄 수 있습니다. 이러한 단점을 해결 하는 3-차원 confocal 영상 몇 사용자가이 데이터의 양적 잠재력의 활용, 우리는 희망 하는 동안 우리의 프로토콜 그들이 수집 하는 데이터를 활용 하기 위해 더 많...

Organogenesis의 연구는 오랫동안 발전 태아에 전체적 이벤트의 관찰에 의존 했다. 이러한 연구는 자주 정의 참조 인구의 라벨 형광 염료 또는 조합에서 혈통 추적 기자 들의 사용에 의존 합니다. 1 이러한 라벨의 상대적 위치를 비교 하 여 정보 출처, 운동, 또는 관심의 인구의 궁극적인 기여에 얻을 수 수 있습니다. 이식 및 운명 매핑 실험 다음 개발된 배아에 기여에 대 한 검사의 관심, 셀의 시작 지점을 정의 하 형태학 랜드마크 또는 비 운동 계보에 염료의 주입을 사용 합니다. 2 , 3 , 4 , 5 유전 계보 추적 실험 실험 조작 없이 라벨 세포 인구에 사용 되는 잘 정의 된 기자 대립 유전자와 동일한 개념을 사용 합니다. 이러한 접근 키 높은 공간 해상도, 실험의 위치 및 참조 레이블을 확인 하는 기능입니다. 이러한 방식을 사전 이식 개발에 뛰어난 진행 굴복 했다 고 explant organogenesis 연구. 6 , 7 , 8 , 9
심장 morphogenesis 기반이 발달 이벤트 최근 몇 년 동안에서 점점 더 잘 설명 되었습니다. 10 연구의이 분야의 주요 발견 중 하나는 고유 마커의 식에 의해 구별 될 수 있다 조상 인구 수의 설명 이다. 11 이 인구는 첫번째와 두 번째 심장 필드 (FHF SHF), 배아 날 (E) 8.25 마우스 개발에 태아의 앞쪽 측면에서 심장 초승달 내 존재는 포함 됩니다. 12 이 인구 넓은 필드 현미경 검사 법, 면역 형광 분석, 조직 수준 정보 및 직렬 단면화를 제공 하 높은 세포 해상도을 제공의 결합을 통해 검사 자주 2 차원 공간 정보입니다. 13 따라서, 이러한 연구는 크게 고급 심장 개발에 대 한 우리의 이해 하는 동안 사용할 수 있는 방법을 제한 morphogenesis의 깊이 정량 분석에 검사 하는 방법에 대 한 필요성을 만들어,이 단계는 이러한 인구 전체 유기 체 수준에서의 조직.
최근 confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 분석 허용 셀 및 구조에서 현장에서 의 고해상도 높은 처리량 알고리즘 개조를 비교적 쉽게 따라서 성패 상세한 연구에 대 한 복잡 한 세포 구조입니다. 14 컴퓨팅 파워의 증가와 큰 데이터 관리 알고리즘, 데이터 집합, 이미지의 크기의 지 수 증가 처리 하기 위해 필요한 두 개발 분석 이제 자동화할 수 있습니다 완전히. 15 영상 데이터 세트의 자동 분석 수 있는 이점이 되 고의 편견, 하지만 입력된 데이터 집합;의 품질 안정 그것은 절대적, 다음, 최고의 품질, 편견된 분석을 지키는 모범 사례 수집 및 이미지 사전 처리 하는 동안 사용 됩니다. 16 프로토콜 수 완전히 자동화 되 고 재현성에 대 한 공유와 독점 소프트웨어에 의해 사용 되는 알고리즘은 쉽게 친숙 현대 독점을가지고 과학자 들에 의해 사용 되는 라이브러리를 통해 사용할 수 또는 오픈 소스 개발자 도구입니다. 17
다음 프로토콜 organogenesis, 심장 개발 하는 동안 심장 초승달의 형성에의 한 잘 정의 된 모델에 이러한 분석을 수행 하기 위해 필요한 단계를 설명 합니다. 특히,이 프로토콜 (1) 수확 하는 방법에 설명 합니다 및 심장 초승달 단계 태아를 해 부, (2) 참조 (Nkx2-5)에 대 한 전체 마운트 면역 형광 검사 수행 및 실험 (Foxa2Cre:YFP18,19) 마커, (3) 준비 하 고 배아 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 그리고 마지막으로 (4) 분석 하 고 계량 고급 3 차원 접근을 사용 하 여 결과 이미지. 심장 초승달에 적절 한 수정, 예를 들어, 사용 된다 초기 somite 단계 배아를 gastrula에서 여러 계보의 분석을 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>무딘 프로브</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마 Aldrich</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>RPI</td><td>A4490</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 Nkx2-5</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-8697</td><td>1:100-1:500</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP</td><td>abcam</td><td>ab13970</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Islet1</td><td>abcam</td><td>ab109517</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Hcn4</td><td>Millipore</td><td>AB5808</td><td>1:100</td></tr><tr><td>488 안티 치킨</td><td>잭슨에 사용 Immunoresearch</td><td>703-546-155</td><td>물에서 재구성하고 -20 °C에 보관; 50% 글리세롤의 최종 농도에서 C. 1:500에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>555 안티 염소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td>1:500에 사용</td></tr><tr><td>647 안티 토끼</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-606-152</td><td>물에서 재구성되어 -20 °C에 보관됨; 50% 글리세롤의 최종 농도에서 C. 1:500에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>n-프로필 갈레이트</td><td>시그마 Aldrich</td><td>2370</td><td>재고 용액은 DMSO에서 20% w/v입니다. 1 부 10x PBS와 9 부 100 % 글리세롤을 혼합하고 0.1 부 원액을 천천히 첨가하여 제조 된 작업 용액.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>VWR Scientific</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm 커버 슬립</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.1</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

적 발전 이미징 기술 사용 하 여 광범위 하 게 배아 개발의 증가 된 이해에 기여 하고있다. 사전 이식 개발 및 organogenesis는 연구의 두 영역을 크게이 진보, 사전 이식 배아 이미징 또는 vivo 장기 전 직접 얻을 수 있는 데이터의 높은 품질에서 benefitted 있다. 사전 이식 배아는 특히 높은 공간 해상도와 데이터 굴복 했다, 하는 동안 후기 3 차원 개조를 덜 의무가 있다. 운명 매핑 또는 유전 계보 추적 함께 알려진된 미 발달 구조에 대 한 높은-품질 3 차원 또는 체적 데이터를 가져오는 embryogenesis 동안 일어나 전체적 사건의 보다 포괄적인 분석을 위해 수 있게 됩니다.
이 프로토콜 있도록 라벨, 시각화, 및 개발 심장 초승달 내 조상 세포 인구의 정량화에 대 한 키 구조 형성 심장 개발 하는 동안 전체 마운트 면역 형광 접근 방식을 설명 합니다. 접근 같은 디자인은 모두 세포 및 조직 수준의 정보를 얻을 수 있는 방법. Confocal 현미경 검사 법 및 이미지 처리를 사용 하 여이 프로토콜 허용 함으로써 지역화 및 특정 조상 인구 중의 조직 분석 하는 기능을 제공 하는 심장 초승달의 3 차원 공간 재구성 심장 개발의이 중요 한 단계. 중요 한 것은, 참조 항 체의 사용은 심장 초승달의 연속 마스킹 및 초승달 일대의 후속 양적 측정에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜만 초기 심장 개발의 상세한 검사를 사용 하지 않습니다 하지만 적응과 초기 somite 단계 마우스 배아를 gastrula에 대부분 기관 시스템에 적용 되어야 합니다.

최종 데이터 분석의 품질 크게 (1) 무결성과 해 부 배아 및 (2) 높은 특이성 항 체의 사용, (3) 적절 한 설치 매개 변수를 이미징의 형태에 따라 달라 집니다. 손상 된 배아는 표면 생성 프로세스를 혼동 하 고 정량 분석을 방해 합니다. 제대로 해 부 및 무대 태아의 예는 그림 2B에 표시 됩니다. 배아는 항 체 자주 바인딩하는 것입니다 비-특히 노른자위 낭을 제거 하 여 더 해 부 될 수 있다. 그러나, 노른자위 낭의 제거가 하게된다 배아를 덜 강력 하 고, 그래서 주의 다운스트림 처리 동안 해야.
이미지 설정과 적절 한 고품질 항 체의 결합이 높은 신호 대 잡음 비율 이미지를 달성 하기 위해 중요 합니다. 그림 2A 쇼 레이블을 참조 마커로 Nkx...

여기, 우리는 전체 마운트 면역 형광 검사 및 초기 단계 마우스 배아의 양적 volumetric 분석 이미지 기반에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 질적 및 양적 개발, 심장 구조를 평가 하 고 다른 기관 체계에 광범위 하 게 적응할 수 있을 수 있습니다 제안에 대 한 강력한 접근으로이 방법을 제시.

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

이 방법의 전반적인 목표는 심장 장기 형성 중 심장 전구 세포 국소화 및 분포를 정량적으로 평가하는 것입니다. 이 방법은 정상적인 배아 발달 동안 심장 전구 개체군의 국소화를 관찰할 수 있게 함으로써 심장 발달 분야의 핵심 해답에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체적 이미지를 통해 조직 수준 역학에 대한 정량적 정보를 얻을 수 있고 재현성을 개선하기 위해 분석 파이프라인을 자동화할 수 있다는 것입니다.이 방법은 초기 심장 기관 형성에 대한 정보를 제공하지만 초기 배발생에 대한 일반적인 연구 또는 다른 관심 기관의 형태 형성에도 적용할 수 있습니다. 배아 8일째 아침, 임신한 쥐의 복부를 에탄올 70%로 소독하고 피부와 체벽을 통해 복부를 절개합니다. 한쪽 난관 위에서 시작하여 자궁 측면을 따라 자궁 경부까지 지방을 조심스럽게 절부합니다.자궁경부를 절개하고 다른 난관 절제의 상단으로 계속 진행하여 자궁 전체를 풀어냅니다. 신선한 PBS가 들어있는 10cm 접시에 자궁에서 여분의 혈액을 씻고 각 데시두옴 사이에 메소메트리움을 자릅니다. 해부 현미경으로 신선한 PBS가 들어 있는 6cm 접시에 배아를 옮기고 5번 가는 집게를 사용하여 탈피 조직에서 자궁 조직을 제거합니다.다음으로, 배아의 절반 배아의 끝을 조심스럽게 잘라 배아를 드러내고, 데시두옴을 꼬집어 첫 번째 배아를 조심스럽게 밀고 당깁니다. 동물의 형태를 손상시키지 않고 가능한 한 많은 여분의 배아 조직을 해부하고 전달 피펫을 사용하여 얼음 위의 새로운 PBS가 들어 있는 1.5ml 튜브에 배아를 넣습니다. 모든 배아를 채취한 후 각 튜브에서 PBS를 흡인하고 새로운 PBS로 배아를 헹굽니다.각 튜브에서 PBS를 철저히 흡인한 후 배아를 4% 파라포름알데히드에 실온에서 1시간 동안 고정한 다음 새 PBS로 3회 세척한 다음 배아를 섭씨 4도에서 보관합니다. 먼저 PBS를 1ml의 블로킹 버퍼로 교체하여 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 차단 완충액을 적절한 1차 항체 혼합물과 희석된 차단 완충액으로 교체하여 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다.다음날 아침, 과잉 항체를 흡인하고 PBS의 0.1% 트리톤에서 세척당 1시간 동안 배아를 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 적절한 2차 항체 혼합물을 배아에 첨가하여 실온에서 3시간 동안 배양한 다음 방금 설명한 대로 3회 세척합니다. 다음으로, PBS에서 DAPI로 배아를 1

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 ES 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 방법은 안정 cardiogenic 효율성을 단정 표준화된 플랫폼을 제공하고, 다른 세포 lineages의 연구에 적용됩니다.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

어린 배아 마우스 판막의 단백질 발현 분석은 이용 가능한 조직의 한계로 인해 방해를 받았습니다. 이 원고는 웨스턴 블롯 분석을 위해 발달 중인 배아 마우스 판막 영역에서 단백질을 준비하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

이 방법에서는, 배아 심장 조직 microdissected, 해리, 붙일 레이블 및 호스트 배아 조직으로 이식 수술이 있습니다. 이 개인 또는 조직 수준 발달 조직 아래 소성 hemodynamic 조건 및/또는 변경된 paracrine/juxtacrine 환경 공부를 위한 플랫폼을 제공 합니다.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

배우세요 마우스 배아 심장 조상 세포의 전체 마운트 면역형광 및 정량적 체적 분석 방법입니다. 이 기술은 심장 발생 과정에서 세포 분포를 정량적으로 평가하고 다른 장기 연구에도 적용할 수 있습니다.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

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