마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

이 방법의 전반적인 목표는 심장 장기 형성 중 심장 전구 세포 국소화 및 분포를 정량적으로 평가하는 것입니다. 이 방법은 정상적인 배아 발달 동안 심장 전구 개체군의 국소화를 관찰할 수 있게 함으로써 심장 발달 분야의 핵심 해답에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체적 이미지를 통해 조직 수준 역학에 대한 정량적 정보를 얻을 수 있고 재현성을 개선하기 위해 분석 파이프라인을 자동화할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 초기 심장 기관 형성에 대한 정보를 제공하지만 초기 배발생에 대한 일반적인 연구 또는 다른 관심 기관의 형태 형성에도 적용할 수 있습니다. 배아 8일째 아침, 임신한 쥐의 복부를 에탄올 70%로 소독하고 피부와 체벽을 통해 복부를 절개합니다. 한쪽 난관 위에서 시작하여 자궁 측면을 따라 자궁 경부까지 지방을 조심스럽게 절부합니다.

자궁경부를 절개하고 다른 난관 절제의 상단으로 계속 진행하여 자궁 전체를 풀어냅니다. 신선한 PBS가 들어있는 10cm 접시에 자궁에서 여분의 혈액을 씻고 각 데시두옴 사이에 메소메트리움을 자릅니다. 해부 현미경으로 신선한 PBS가 들어 있는 6cm 접시에 배아를 옮기고 5번 가는 집게를 사용하여 탈피 조직에서 자궁 조직을 제거합니다.

끝을 조심스럽게 잘라 배아를 드러내고, 데시두옴을 꼬집어 첫 번째 배아를 조심스럽게 밀고 당깁니다. 동물의 형태를 손상시키지 않고 가능한 한 많은 여분의 배아 조직을 해부하고 전달 피펫을 사용하여 얼음 위의 새로운 PBS가 들어 있는 1.5ml 튜브에 배아를 넣습니다. 모든 배아를 채취한 후 각 튜브에서 PBS를 흡인하고 새로운 PBS로 배아를 헹굽니다.

각 튜브에서 PBS를 철저히 흡인한 후 배아를 4% 파라포름알데히드에 실온에서 1시간 동안 고정한 다음 새 PBS로 3회 세척한 다음 배아를 섭씨 4도에서 보관합니다. 먼저 PBS를 1ml의 블로킹 버퍼로 교체하여 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 차단 완충액을 적절한 1차 항체 혼합물과 희석된 차단 완충액으로 교체하여 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다.

다음날 아침, 과잉 항체를 흡인하고 PBS의 0.1% 트리톤에서 세척당 1시간 동안 배아를 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 적절한 2차 항체 혼합물을 배아에 첨가하여 실온에서 3시간 동안 배양한 다음 방금 설명한 대로 3회 세척합니다. 다음으로, PBS에서 DAPI로 배아를 10분 동안 대조염색한 후 5분씩 두 번 세척한 다음 배아를 페이드 방지 장착 매체에 천천히 매달아 배아가 주기적인 부드러운 플링으로 최소 1시간 동안 평형을 이루도록 하여 표본이 용액에 떨어질 수 있도록 합니다.

배아를 장착하기 전에 배아당 하나의 현미경 슬라이드에 15-20mm 간격으로 5-6겹의 양면 스틱 테이프를 두 개의 평행 스택으로 만들고 테이프 스택 사이의 각 슬라이드에 15마이크로리터의 페이드 방지 매체를 떨어뜨립니다. 각 방울에 하나의 배아를 조심스럽게 옮기고 해부 현미경과 미세한 집게를 사용하여 배아의 앞쪽이 슬라이드에서 반대쪽을 향하고 몸체 축이 슬라이드의 긴 축과 일직선이 되도록 배아를 배치합니다. 커버 슬립을 배치하려면 먼저 유리의 한쪽 면을 양면 스틱 테이프 한 겹에 놓고 집게를 사용하여 다른 테이프 스택에 닿을 때까지 커버 슬립을 부드럽게 내립니다.

배아를 조심스럽게 배치하고 장착하는 것이 특히 중요합니다. 올바르게 배치되지 않은 배아는 이미지화하기가 훨씬 더 어려우며 정량화 가능한 좋은 데이터를 얻기 위해 추가 처리가 필요할 수 있습니다. 피펫을 사용하여 슬라이드와 커버슬립 사이에 페이드 방지 매체를 추가하여 이미징 중에 샘플이 건조되지 않도록 하고 전체 심장 초승달 영역을 하나의 시야에서 캡처할 수 있는 가장 높은 배율 대물렌즈를 선택합니다.

그런 다음 표준 이미징 모범 사례를 사용하여 이미징 매개변수를 설정하고 Nyquist 샘플링 속도를 사용하여 각 배아의 XYZ 복셀 치수를 결정합니다. 배아 이미지를 분석하려면 원시 이미지 데이터 세트를 적절한 이미지 분석 소프트웨어에 로드하고 superpass view에서 첫 번째 파일을 엽니다. 데이터는 최대 강도 투영 모드에서 3D 보기로 로드됩니다.

디스플레이 조정 창을 열고 참조 채널만 선택합니다. 필요에 따라 이미지의 임계값을 조정합니다. 신호 대 잡음비가 너무 낮아 분할할 수 없는 경우 감마를 조정하십시오.

이미지 획득 중 모범 사례를 따르는 것은 적절한 데이터를 얻는 데 중요하며 사용되는 특정 현미경 설정에 따라 달라집니다. 감마에 대한 조정이 필요한 경우 이러한 이미지를 형광 강도를 비교하는 데 사용해서는 안 됩니다. surface algorithm 대화 상자를 사용하여 참조 채널에 대한 새 표면을 만들고 segment only origin of interest 상자를 선택합니다.

레퍼런스 스테인으로 표시된 관심 영역이 포함되도록 바운딩 박스 영역을 조정하고 소스 채널 드롭다운 메뉴에서 레퍼런스 채널을 선택합니다. 스무딩을 Z 복셀 크기의 절반으로 설정하고 임계값 슬라이더를 사용하여 하한을 절대 강도로 조정하여 표면이 채널 신호를 넘어 확장되지 않도록 합니다. 복셀 번호 또는 볼륨별로 개체를 필터링하여 알고리즘이 생성했을 수 있는 배경 개체를 거부하고 알고리즘을 완료합니다.

그런 다음 새로 생성된 표면을 선택하고 편집 창에서 마스크 세트 기능을 선택합니다. 마스크 확인란을 적용하기 전에 중복 채널이 선택되었는지 확인하여 관심 있는 실험 채널을 선택하고 디스플레이 조정 창에서만 마스크 채널을 선택합니다. 그런 다음 방금 설명한 대로 새 표면을 만듭니다.

각 표면이 선택된 체적 데이터를 얻으려면 통계 탭에서 세부 하위 탭을 열고 드롭다운 메뉴에서 평균값을 선택합니다. 표면의 총 부피는 생성된 테이블의 합계 열에서 찾을 수 있습니다. 여기서, 방금 시연된 바와 같이 항-심장 초승달 항체로 표지된 GFP 양성 심실 심혈관 전구 세포를 가진 배아 8.25일 마우스 배아가 도시되어 있습니다.

염색된 조직에 대한 참조 채널을 선택한 후 표면 생성 알고리즘을 시작하기 전에 강도와 감마를 조정합니다. 관심 영역이 선택되고 표면 세부 정보 수준이 선택됩니다. 초기 표면은 표면의 모든 실제 신호를 포함하도록 임계값이 설정됩니다.

그런 다음 필터링을 수행하여 작은 배경 조각을 제거하여 최종 참조 표면을 생성합니다. 참조 표면을 선택하면 비교 채널을 복제하고 마스킹할 수 있습니다. 이 채널의 강도와 감마는 동일한 단계 시퀀스를 통해 두 번째 표면을 생성하기 전에 조정됩니다.

그런 다음 각 표면의 총 부피가 자동으로 계산되어 정량적 및 시각적으로 비교할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 절개된 배아의 품질, 항체 효율, 장착 방향 및 이미징 설정이 모두 최종 데이터의 품질에 영향을 미친다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 정량적 분석 파이프라인 외에도 디콘볼루션과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 정성적 데이터를 생성할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 심장 발달 연구자들이 초기 배발생 동안 새로운 심장 전구 세포 집단의 역학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.