Name: 사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 배우세요 MDCK-SIAT1 세포를 이용한 미세중화법으로 H3N2 인플루엔자 바이러스에 대한 인간 혈청 중화항체 반응을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 백신 접종 후 면역 효과를 평가하는 데 활용됩니다.

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우리이 원고 준비 박사 Xiuhua Lu, 박사 펭 류, 및 그들의 중요 한 검토 및 지원에 대 한 질병 통제 센터의 독감 부문에서 양 애슐리 버로우즈 감사합니다. 우리는 그림 3의 그래픽을 준비 하 고 그의 도움에 대 한 질병 통제 센터의 독감 부문에서 박사 아드리안 Reber 감사. 마지막으로, 우리는 박사 M. Matrosovich, Marburg, 독일 MDCK SIAT1 세포를 제공 하기 위한 감사 합니다.

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저자는 충돌의 관심을 보고. 결과 및 결론을이 책에서 저자는 고 반드시 센터의 질병 통제 및 예방 및 자금 지원 기관에 대 한 대표 하지 않습니다.

MN 분석 결과 인플루엔자 혈 청 학에 대 한 인플루엔자 감염이 나 예방 접종을 다음과 같은 항 체 응답을 검색 하는 데 사용 하는 주요 분석 실험 중 하나입니다. 많은 인플루엔자 seroepidemiology 연구의 주요 결과 titers MN 분석 실험에서 생성 된 자주 사용 됩니다. MN 분석 sero 진단 및 백신 immunogenicity의 평가 또한 널리 사용 됩니다. 국제 간 연구소 연구14여러 실험실 수행 하는 미네소타 분석 비교 실시 되었습니다.
안녕하세요, 달리 미네소타 분석 결과 직접 세포 배양에서 바이러스 감염을 중화 시킬 수 있는 기능 항 체를 측정 하도록 설계 되었습니다. 필드 전 세계 실험실에서 사용 하는 미네소타 분석 실험의 다양 한 형태가 있다. (즉, 중화 항 체의 존재 바이러스 infectivity의 감소) 분석 실험의 읽어 바이러스 NP 항 체, 바이러스, 또는 면역-각 우물에서 바이러...

인플루엔자 바이러스는 인간의 인구 매년 사망률 및 사망 원인을 계속. 하는 인플루엔자 바이러스의 주요 표면 당단백질. HA를 대상으로 하는 중화 항 체는 인플루엔자 감염1,2의 보호와 상관 관계가 주요 면역 메커니즘입니다. Hemagglutination 억제 (HI) 분석 실험 및 MN 분석 널리 인플루엔자 감염이 나 예방 접종3후 인간의 혈 청에 항 체 응답을 측정 하는 데 사용 하는 두 가지 방법이 있습니다. 이 분석 결과 붉은 혈액 세포의 바이러스 hemagglutination의 항 체 억제를 측정 하 고 분석 결과 대리 하는 것으로 간주 됩니다. 안녕, 달리 미네소타 분석 결과 직접 인간의 세라 셀 문화에서 인플루엔자 감염을 중화 하는 항 체의 수치를 측정할 수 있습니다. MDCK 셀 인플루엔자 바이러스 분리에 자주 사용 하 고 미네소타 분석 실험4.
인플루엔자 바이러스는 지속적으로 antigenic 드리프트와 shift, 바이러스의 수용 체 의무적인 특이성을 변경할 수 있는 HA 단백질에 돌연변이 인수 받 다. 2014 년 이후 A(H3N2) 바이러스의 새로운 클러스터 등장 하 고 현재 시즌까지 회람 하기 위하여 계속 했다. 이 바이러스의 대부분은 유전 그룹 3C.2a와 3C.3a HA 단백질의 계통 발생 분석에 기반에 속한다. 순환 3C.2a 바이러스의 많은 hemagglutinate 붉은 혈액 세포 수를 감소 했다 고이 분석 실험5에 의해 특성화 될 수 없습니다. 중립화 분석6hemagglutinate 하지 않는 이러한 바이러스에 항 체 응답을 측정 하기 위해 사용 되어야 한다. 또한, 연구는 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스 수용 체 바인딩 속성 이전 A(H3N2) 바이러스에 비해 변경 및 문화 적응 돌연변이 및 다형성 체 외에서 세포에 passaged 때 축적 하는 경향이 나타났습니다. 문화7,,89. 기존의 MDCK 세포와 비교 하면, MDCK-SIAT1는 Matrosovich 그 외 여러분 에 의해 개발 된 셀 라인 인간의 α2, 6-sialtransferase (SIAT1)의 cDNA와 MDCK 세포의 안정 되어 있는 transfection을 통해 이 셀 라인 α2, 6 sialic 갈 락 토스 moieties 및 α2, MDCK 셀10부모 보다 3 sialic acid moieties 감소 금액의 증가 양을 표현 한다. MDCK-SIAT1 세포 MDCK 세포11에 비해 A(H3N2) 바이러스에 대 한 격리 속도 향상 시킬 나타났습니다. 최근, 린 외. 보고는 새로 등장 3C.2a 및 3C.3a 인간 A(H3N2) 인플루엔자 바이러스, 더 충실 한 바이러스 복제와 더 나은 바이러스 infectivity 달성 했다 바이러스 MDCK SIAT1 셀 라인 MDCK 셀7와 비교에 교양 있었다. 따라서, MDCK-SIAT1 세포는 더 미네소타 A(H3N2) 바이러스의 최근 클러스터에 대 한 항 체 응답 특성 분석에 적합 합니다.
여기 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 인간 혈 청에 항 체 응답을 측정 하기 위해 MDCK SIAT1 셀을 사용 하 여 MN 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과에 계란 또는 세포에서 바이러스를 사용할 수 있습니다. 열 비활성화 세라 중화 항 체를 포함 하는 먼저 순차적으로 희석, 다음 100 TCID50/인플루엔자 바이러스에 바인딩할 세라에 항 체를 수 있도록 A(H3N2)의 인 큐베이 팅. MDCK-SIAT1 셀 다음 바이러스 항 체 혼합물에 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 A(H3N2) 바이러스 MDCK SIAT1 세포를 감염 하 고 복제를 허용 하도록에서 18-20 h에 대 한 인 큐베이 팅. 야간 보육, 후 판을 고정 하 고는 ELISA 항 인플루엔자 A NP 단일 클론 항 체를 사용 하 여 각 우물에서 바이러스의 양을 계량은. NP의 감지 바이러스 감염의 존재와 항 체를 중화의 부재를 나타냅니다. 중화 항 체 titer 바이러스 infectivity ≥ 50% 억제를 제공 하는 높은 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium(DMEM) with high Glucose</td><td>Life Science</td><td>11965</td><td>멸균 세포 배양, 바이러스 전파 및 바이러스 희석 배지의 중요한 구성 요소</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 분획 V, 프로타제 프리</td><td>시그마-알드리치</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>생명 과학</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>소듐 피루베이트</td><td>생명 과학</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 디설페이트 염&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A1720-5G&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>생명 과학</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>생명 과학</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>80% 농도</td></tr>의 <tr><td>인산염-시트르산 완충액과 과붕산나트륨 함유 완충액에서 사용됨&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-Phenylenediamine Dihydrochloride 정제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>세포 배양 등급 물 100ml당 1</td></tr>정 <tr><td>황산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>사용 0.5M 최종 농도</td></tr><tr><td>에탄올, 변성, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>70% 농도에서 사용</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>생명 과학</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II "Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NP 마우스 단클론 Ab</td><td>Millipore 풀</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP&nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플랫 바텀 플레이트</td><td>, Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td>, <td>분자 소자</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr>, <tr><td>세포 배양 플라스크 162 cm2/벤트 캡</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

사용 하 여 mdck siat1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 microneutralization에 의해 인간의 세라에 a(h3n2) 바이러스를 중화

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

조류 독감 바이러스 (HA)에 대 한 중화 항 체는 인플루엔자 감염에 대 한 보호와 상관 관계가 주요 면역 메커니즘으로 간주 됩니다. Microneutralization (미네소타) 분석 실험 자주 독감 예방 접종 또는 감염 후 인간의 혈 청의 중화 항 체 응답을 측정 하는 데 사용 됩니다. Madine 다 비 개 신장 (MDCK) 세포는 미네소타 분석 실험에 대 한 일반적으로 사용 되 셀 기판. 그러나, 현재 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 인플루엔자 바이러스 획득 순환 수용 체 바인딩 특이성 변경. 표면에 증가 된 α-2, 6 sialic 갈 락 토스 moieties로 MDCK SIAT1 셀 라인은 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스에 대 한 향상 된 infectivity 기존의 MDCK 셀 보다 더 충실 한 복제를 제공을 입증 했다. 여기, 우리는 미네소타 분석 결과 MDCK SIAT1 셀을 사용 하 여 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 계량 하도록 최적화 된 설명 합니다. 이 프로토콜 열 비활성화 세라 중화 항 체를 포함 하는 먼저 순차적으로 희석, 다음 100 TCID50/인플루엔자 바이러스에 바인딩할 세라에 항 체를 수 있도록 A(H3N2)의 인 큐베이 팅. MDCK-SIAT1 셀 다음 바이러스 항 체 혼합물에 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 A(H3N2) 바이러스 MDCK SIAT1 세포를 감염 시킬 수 있도록에서 18-20 h에 대 한 인 큐베이 팅. 하룻밤 배양 후 플레이트 고정 되 고 각 바이러스의 양을 잘 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 항 인플루엔자를 사용 하 여 계량은 nucleoprotein (NP) 단일 클론 항 체. 중화 항 체 titer 바이러스 infectivity의 50% 억제를 제공 하는 높은 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.

바이러스 주식의 infectivity의 결정만 분석 결과 첫 번째 단계입니다. 그림 2 에서는 접시 레이아웃을 바이러스 주식의 TCID50 결정을 보여 줍니다. 알 수 없는 infectivity 바이러스 주식, 대 한 바이러스 바이러스의 infectivity 계산을 최고의 적정 곡선을 캡처하기 위해 여러 사전 희석, 예 10-2 와 10-3에서 적정 수 있습니다. MN 분석 결과에 사용 된 바이러스 금액 100 TCID50/well (50 µ L)를 표준화 해야 한다. 바이러스 주식 100 TCID50달성 / 잘의 최소 희석 1: 100입니다.
 그림 3 ...

인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

이 미세중화(microneutralization) 분석법의 전반적인 목표는 MDCK-SIAT1 세포를 사용하여 인간 혈청에서 현대 H3N2 인플루엔자 바이러스에 대한 중화항체 반응을 측정하는 것입니다. 이 방법은 인플루엔자 면역을 평가하기 위한 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 인플루엔자 백신 접종이 순환하는 H3N2 바이러스에 대한 충분한 중화 항체 반응을 유도하여 감염을 예방하는지 여부를 결정할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 MDCK-SIAT1 세포와 미세 중화 분석을 활용하여 H3N2 인플루엔자 바이러스의 항원 클러스터를 재설정하기 위한 항체 반응을 검출한다는 것입니다. 바이러스 스톡은 미세중화 분석에 사용하기 전에 전염성이 높은 역가로 전파되어야 합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 MDCK-SIAT1 세포에서 AH3N2 바이러스를 증식하는 것으로 이 절차를 시작합니다.첫째 날에는 바이러스 바이알을 실온에서 해동하고 즉시 바이러스를 얼음에 놓습니다. 두 가지 다른 시작 희석액에서 바이러스를 테스트하려면 먼저 100마이크로리터의 바이러스에 99밀리리터의 바이러스 희석제를 추가하여 10:2 사전 희석합니다. 그런 다음 10:2 사전 희석 1ml를 바이러스 희석제 9ml에 추가하여 10:3 사전 희석을 합니다.두 개의 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 96웰 마이크로타이터 플레이트 중 1열을 제외한 모든 웰에 100마이크로리터의 마이크로 희석액을 추가합니다. 다음으로, half-log 10 희석을 수행합니다. 1열의 모든 웰에 146마이크로리터의 바이러스 시작 희석을 추가하고 1열에서 11열까지 46마이크로리터를 연속으로 이동합니다.컬럼 사이의 파이펫 팁을 교체합니다. 11열을 혼합한 후 46마이크로리터 희석액이 있는 팁을 버립니다. 12열은 바이러스 희석제만 포함하는 세포 제어로 사용합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소를 1 시간 동안 접시를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MDCK-SIAT1 셀을 준비합니다. 100마이크로리터의 희석된 세포를 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 추가합니다.그리고 접시를 덮으십시오. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 18-20시간 동안 세포를 배양합니다. 2일차에는 먼저 마이크로타이터 플레이트에서 배지를 제거하여 ELISA를 수행합니다.200마이크로리터의 PBS로 각 웰을 세척한 후 각 웰에 300마이크로리터의 차

measuring-influenza-neutralizing-antibody-responses-to-h3n2-viruses

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 인간 혈청에서 α2,6 연결된 시알산을 과발현하는 Madin-Darby Canine Kidney cell을 사용하여 중화 항체를 측정하는 Microneutralization 분석을 보여줍니다. 이 분석법은 종종 인플루엔자 인간 혈청학에...

인간 혈청에서 중화 항체 역가를 측정하기 위한 미세중화 분석

이 비디오는 인플루엔자 A와 B 바이러스 간의 항원 관계를 분석하기 위한 이미징 기반 미세 중화 분석을 보여줍니다. 바이러스 감염 예방에 대한 항체 또는 기타 치료법의 효과를 평가할 수 있는 정량적이고 시각적인 방법을 제공합니다.

이미지 기반 미세중화 분석을 사용한 바이러스 간의 항원 관계 분석

이 비디오는 중화 인플루엔자 바이러스 단클론 항체의 탈출 변종을 생성하는 기술을 보여줍니다. 항체 중화 바이러스 현탁액을 배아 계란에 주입하여 탈출 변이체를 선택적으로 증식시킵니다. 그 결과 주로 탈출 변이체의 바이러스 집단이 발생하며, 이는 Hemagglutination 분석을 통해 확인되었습니다.

중화 항체에 대한 인플루엔자 바이러스 탈출 변이의 생성

이 동영상은 혈청 샘플에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하는 분석을 보여줍니다. NA에 대한 항체를 포함하는 혈청 샘플을 페투인(fetuin)으로 코팅된 마이크로웰 플레이트에 첨가합니다. 바이러스를 추가하면 항체가 바이러스 NA가 fetuin을 쪼개고 갈락토오스 부분을 노출시키는 것을 방지합니다. 그런 다음 과산화효소(peroxidase-conjugated lectin)가 첨가되어 노출된 갈락토스에 결합합니다. NA 억제 항체 역가는 비색 테스트를 사용하여 측정되며, 여기서 과산화효소 기질은 고정된 렉틴 접합 과산화효소에 의해 절단되어 색상을 생성합니다.

인플루엔자 뉴라미니다아제 억제 항체 역가를 측정하기 위한 분석

이 동영상은 거대세포바이러스(HCMV)의 중화를 측정하기 위해 고안된 면역형광 분석을 보여줍니다. 바이러스 특이적 항체는 바이러스와 혼합되어 인간 섬유아세포 세포와 함께 배양됩니다. 항체는 바이러스를 중화하여 숙주 세포를 감염시킬 수 없게 만드는 반면, 중화되지 않은 바이러스는 세포를 감염시킵니다. 배양 후, 중화 정도는 면역형광을 사용하여 바이러스에 감염된 세포를 정량화하여 결정됩니다.

인간 거대세포바이러스의 중화를 측정하기 위한 면역형광 방법

혈청에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하기 위한 효소 결합 렉틴 분석법(ELLA)을 설명합니다. 이 분석은 땅콩 응집소를 사용하여 NA가 fetuin으로 코팅된 96웰 플레이트에서 시알산을 제거할 때 접근할 수 있는 갈락토오스 잔류물을 정량화합니다.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

제시 프로토콜 인플루엔자 백신 받는 사람 혈 청 샘플에서 인플루엔자-특정 항 체 titers 척도를 hemagglutination 억제 시험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 첫 번째 분석 결과 hemagglutination에 의해 최적의 바이러스 성 항 원 농도를 결정합니다. 두 번째 분석 결과 hemagglutination 저해 하 여 인플루엔자-특정 항 체 titers 단정.

인플루엔자-특정 항 체 Titers 계량에 최적화 된 Hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과

인플루엔자 A 바이러스 (IAVs)는 중요 한 인간의 호흡기 병원 균. IAVs pathogenicity 이해 하 고 새로운 백신 접근의 전 임상 시험 수행 인간의 생리를 흉내 낸 동물 모델은 필요. 여기, 우리가 IAV pathogenesis, 체액 성 반응과 감염 마우스 모델을 사용 하 여 백신 효능을 평가 하는 기법을 설명 합니다.

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

우리는 우리가 대상으로 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 성 조류 인간 또는 murine 단일 클론 항 체의 바인딩을에 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 다른 바이러스 표면 glycoproteins 그리고 그들의 해당 중화 항 체에 적용할 수 있습니다.

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

배우세요 MDCK-SIAT1 세포를 이용한 미세중화법으로 H3N2 인플루엔자 바이러스에 대한 인간 혈청 중화항체 반응을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 백신 접종 후 면역 효과를 평가하는 데 활용됩니다.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

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