Name: 셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 점 분석법을 사용하여 응집된 세포 시트의 이동 표현형을 평가하는 방법을 익히세요. 이 기술은 암 연구에서 세포 운동성에 대한 미세환경 신호의 영향을 이해하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 Bhagawat 수브라마니안, 이순신 (제이슨) 장 폴 란다 조, 그리고 캐롤 부모 읽기 및 원고에 대 한 코멘트에 대 한 감사를 기원 합니다. 이 작품은 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회.

1. 코팅의 요리 (1 일)
참고: 그것을 처리할 때 접시의 바닥에 지 문이나 먼지를 놓지 있는지 확인 합니다.
<ol><li>Thaw 마우스 콜라겐 얼음, IV 하 고 3 mL 10 µ g/mL 콜라겐 IV 솔루션의 준비 50 m m HCl (pH 1.3)와 희석. 참고: 콜라겐 37 ° c.에 침전 한다 그것은 그러므로 녹고 그것으로 작업 하는 동안 낮은 온도에서 콜라겐 솔루션을 유지 하는 것이 중요입니다. 적절 한 크기의 aliquots를 준비 하 여 반복된 freeze-thaw 주기를 방지-80 ° c.에서 그들을 저장 하 고</li>
	<li>12 잘 유리 하단 접시의 각 음에 250 µ L 콜라겐 IV 솔루션을 추가 하 고 적절 한 크기의 꽉 닫는 플라스틱 상자에 넣어. 젖은 종이 수건 및 습기 챔버는 상자를 접시 주위를 배치 합니다. 하룻밤 실 온에서 번호판을 품 어. 참고:만 성장 지역 코팅 필요, 그것은 콜라겐 솔루션 접시의 바닥에 붙어 있는 커버 슬립 커버 하기에 충분 한 ( 그림 1A, B 플레이트의 회로도 대 한 참조).</li>
	<li>다음날 아침 씻어 접시 이온 H2O 비 흡수 콜라겐 및 버퍼 제거를 두 번. (해당 되는 경우 물이 튀기는이 지역에 pipetted) 접시 바닥에 coverslip에 의해 형성 된 지 않기로 잘 접시의 가장자리에 물을 직접. 층 류 흐름 후드에서 접시 건조 접시를 즉시 사용 하거나 4 ° C에서 최대 5 일 동안 저장 합니다. 참고: 다른 셀 라인 다른 코팅, fibronectin 또는 콜라겐 같은 내가 필요할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 도금 점 분석 결과 (주 2)
<ol><li>
세포 현 탁 액 준비
	<ol>
<li>세포 현 탁 액을 준비, 5% 말 혈 청 80% 합류 보충 DMEM/F12 매체에 60-m m 조직 문화 접시에 재배 하 고 있는 셀을 사용</li>
		<li>칼슘 및 마그네슘 무료 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 셀을 한 번 린스 500 µ L 트립 신-EDTA (실내 온도), 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기에서 인큐베이터에서 3-5 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>4.5 mL 문화 중간 트립 신 활동을 중지 하 고 20 세에 분리 된 세포를 일시 중단 한 hemocytometer에 세포 현 탁 액의 µ L 약 수.</li>
		<li>3 분 x g 200에서 원심 분리 하 여 15 mL 원뿔 튜브에 남아 있는 세포를 작은, 상쾌한, 발음 그리고 3 x 106 셀/mL을 문화 매체에 셀 resuspend. 참고: 다른 코팅 기판 / 셀 라인, 최적의 셀 밀도 희석 시리즈에서 설정할 수 있어야 합니다. 3 x 106 셀/mL 출발점으로 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀을 도금
	<ol>
<li>장소는 10 µ L 드롭 콜라겐 IV의 각 커버 슬립의 중심에 세포 현 탁 액의 만지거나 긁는 (그림 1A, B) 코팅 없이 12 잘 유리 하단 플레이트 코팅. 37 ° C, 연결할 셀 수 있도록 습도 분위기에서 30 분 동안 접시를 품 어. 거꾸로 현미경 셀 연결 되어 있는지 확인 합니다. 참고:이 볼 수 있습니다 최고의 드롭의 가장자리에 형성 된 단층의는 (그림 1C) 관찰 될 수 있다. 필요한 경우, 접시를 최대 품 어 3 h. 반드시 인큐베이터에 습도 충분히 높이 신속 하 게 밖으로 건조 하실 수 있습니다. 이 단계 동안 드롭 볼륨의 감소를 관찰 하는 경우 습도 높이기 위해 우물 사이 공간에 PBS를 추가 합니다.</li>
		<li>부드럽게 연결 되지 않은 세포를 제거 하는 두 번 문화 매체의 1 mL와 웰 스 워시. 각 잘을 1 mL 문화 매체를 추가 합니다. 체크는 거꾸로 한 현미경 인 부동 셀 유지, 그렇지 않으면 다시 우물을 씻어. 37 ° C, 5% CO2, 잘 정의 된 셀 시트를 습도 분위기에서 하룻밤 셀을 품 어. 참고: 부동 셀 플레이트에 재연결 하 고 원치 않는 셀 식민지를 형성 하는.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 자극 세포 (3 일)
<ol><li>모든 우물 식민지 제대로 성장 하는 셀을 위해 역 현미경을 사용 하 여 확인 합니다. 필요 하다 면, 부적 절 한 우물을 표시 하 고 그들을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>레이블을 적절 하 게 각 조건에 대해 조사 플레이트의 각 잘. 또는 3 중에서 각 상태를 실행 합니다.</li>
	<li>DMEM/F12 0.1% 말 혈 청 (굶주린 중간)를 포함 하는 셀을 굶 어 매체 변경 3 h 세포 자극 하기 전에.</li>
	<li>EGF (최종 농도 5 ng/mL)의 추가 또는 다른 원하는 중재자에 의해 세포를 자극 하 고 부드럽게 1 mL micropipettor를 사용 하 여 매체를 혼합 하거나 접시를 소용돌이.</li>
	<li>4.1 섹션에 설명 된 대로 가장자리 변위 및 가장자리 윤곽을 관찰 하는 것 1-4 일 동안 접시를 품 어 또는 시간 경과 영상 섹션 4.2에에서 설명 된 대로 수행.</li>
</ol>4. 셀 식민지 및 셀의 시각화
<ol><li>
Hematoxylin-오신 (그) 얼룩 식민지 성장 (하루 4-7)를 측정 하
	<ol>
<li>~ 2 분 동안 70% 에탄올 (1 mL/음)에서 셀을 수정 합니다.</li>
		<li>되며 (1 mL/음), ~ 2 분으로 핵을 얼룩.</li>
		<li>핵까지 수돗물 (1 mL/잘) 세척 셀은 파란색, 5-10 분.</li>
		<li>세포질 오신 (1 mL/음), ~ 2 분으로 얼룩.</li>
		<li>이온을 제거 된 물 (1 mL/음)로 씻어. 참고: Hematoxylin 및 오신 솔루션 수집 고 희미 한 되는 얼룩 때까지 여러 번 사용 될 수 있습니다.</li>
		<li>공기가 건조 플레이트입니다.</li>
		<li>접시를 플립 하 고 통치자를 가진 점 직경을 측정 한다. 또는, 카메라, 접시의 사진을 찍어 고 ImageJ에 점 직경을 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시간 경과 현미경 (3 일)
	<ol>
<li>인큐베이터 현미경에 전환 하 고 37 ° c 온도 조정 DH2O. 조정 5% CO2 는 가습기를 채우십시오. 인큐베이터 챔버 습도 전동된 스테이지를 자유롭게 이동할 수 확인 하십시오. 인큐베이터 챔버를 닫고 37 ° c.를 조정 하는 현미경을 허용 참고: 현미경 사용 (재료의 표 참조) 여기 한다가 열 될 적어도 3 h 동안 37 ° C에 셀 초점의 표류를 방지 하는 몇 군데는 전에.</li>
		<li>인큐베이터 현미경의 스테이지에 접시를 놓고 무대 목록을 설정 합니다. 이미지 두 반대 가장자리 그리고 각 셀 점 (그림 1A)의 센터.</li>
		<li>걸릴 이미지 10 X 목표를 사용 하 여 15-24 h에 대 한 모든 3 분. 데이터를 다운로드 하 고 프로그램 선택, 이미지 분석 진행 예, ImageJ 또는 Matlab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Weiger, M. C., Vedham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+motion+analysis+reveals+cell+directionality+as+an+indicator+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression.</a> PLOS ONE. 8 (3), 58859(2013).</li>
<li>Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).</li>
<li>Sunyer, R., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li>
<li>Bazellières, E., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+tumor-fibroblast+interactions+increase+tumor+cell+malignancy+by+a+TGF-Beta+mediated+mechanism+in+a+mouse+xenograft+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer.</a> PLOS ONE. 5 (3), 9832(2010).</li>
<li>Normanno, N., De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366 (1), 2-16 (2006).</li>
<li>Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA%2C+HGF%2C+and+EGF+utilize+distinct+combinations+of+signaling+pathways+to+promote+migration+and+invasion+of+MDA-MB-231+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 13, 501(2013).</li>
<li>Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).</li>
<li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li>
<li>Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2057-1739/2/2/025001/meta">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001(2016).</li>
<li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration%5BTitle%5D)+AND+%22New+J+Phys%22%5BJournal%5D)">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li>
<li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li>
</ol>

저자는 공개 상관이 있다.

종양 진행 셀 동안 주변 조직 침입 하 고 먼 사이트15전이 기원의 조직에서 마이그레이션하십시오. 셀 서식에서 셀의 마이그레이션 점 분석 결과에서 관찰할 수 있습니다. 여기, 점 분석 결과에 EGF 인간 유방암 세포의 철새 형을 분석 하 여 그림입니다.
결과 얻기 위해 정확 하 고 복제할 도트의 설정에서 몇 가지 단계 분석 실험은 중요 합니다. 첫째, 접시의 코팅 방법 강한 세포 플레이트에 고착 할 수 있다 고 셀 마이그레이션할 경우 결정 합니다. 케어는 콜라겐 IV 또는 다른 기질을 가진 격판덮개의 코팅은 실험적인 변화를 최소화 하기 위해 균질 성 취해야 한다. 또한, 그것을 조사 하는 세포를 연결 하 고 코팅된 접시에 마이그레이션 여러 농도에 다른 매트릭스와 함께 여러 실험 선택한 셀 라인의 코팅 조건을 최적화 해야 할 수 있습니다 보장 되어야 합니다. 둘째, 세포의 정확한 도금은 재현성에 대 한 중요 합니다. 셀 드롭의 발자국 모양...

마이그레이션 분석 널리 종양 세포에서 생체 외에서의 침략과 전이성 잠재력을 평가 하는 데 사용 됩니다. 가장 일반적으로, 상처 또는 스크래치 분석 결과 상피 시트의 셀 허가 지역1,2,3로 마이그레이션 평가 하는 데 사용 됩니다. 스크래치 시험을 수행 하기 위해 세포는 단층으로는 도금 고 "처음" 또는 셀 자유로운 지역 피 펫 팁으로 만들어집니다. 스크래치 분석 결과 일반적으로 사용 가능한 조직 문화 공급 설정 쉽게 이며 여러 샘플의 처리에 대 한 수 다 잘 접시에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 스크래치로 세포는 단층에서 물리적으로 제거 되 고 종종 세포의 죽음을 받 다. 또한, 접시에 부착 된 세포 외 기질 자주 긁 과정에서 손상 되었습니다. 마찬가지로, 실리콘의 사용 (예: Ibidi 챔버4) 삽입 또는 스텐실의5,,67 이어질 수 있는 세포의 기계적 파괴 및 코팅에 사용 되는 매트릭스 단백질의 부분적인 제거는 접시입니다. 다른 상처 나 긁힌의 폐쇄를 모니터링 분석 실험의 단점은 그들의 한정 된 시간 코스 스크래치 닫힐 때까지 셀 마이그레이션 분석만 수 있습니다.
수행 점 분석 결과, 세포는 코팅 또는 코팅 접시8에 원형 식민지로 도금. 이 도금 전략에 대 한 근거는 셀 이나 삽입의 제거로 문화를 방해 하지 않고 주변 셀 자유로운 지역으로 침공 하거나 마이그레이션할 수 있는 정의 된 가장자리와 셀 시트를 얻을 것입니다. 점 분석 결과의 전반적인 목표 셀 시트 지 변위 또는 식민지, 뿐만 시간 경과 영상 spatio 시간적 해상도에 셀의 철새 표현 형 분석을 수행 하 여 측정으로의 마이그레이션을 관찰 하는 것입니다.
셀 마이그레이션 microenvironmental 신호 발산, cytokines, EGF 등 성장 요인 등의 다양 한 영향을 받을 수 있습니다. EGF는 그것의 수용 체, EGF 수용 체9, 바인딩을 통해 그것의 생물학적 효과 행사 하 고 침략과 전이성 종양 세포4,,910의 행동을 증가 하는 성장 인자. 점 분석 결과 사용 하 여 공부 하는 여기, EGF 셀 마이그레이션 인간의 침략, 폐 식민지 형성 유 방 암 세포 선 (MCF10CA1a)8,,1112에 자극.

<table><tbody><tr><td>MCF10CA1a 세포</td><td>Karmanos Research Institute</td><td>N/A</td><td>세포는 마우스</td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>BD Biosciences</td><td>플레이트</td><td>를 코팅하는 데 사용되는</td></tr><tr><td>354233 트립신 / EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>조직 배양 플레이트에서 세포를 제거하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. DPBS&nbsp;</td>세포 DMEM / F12 세포<td>를 세척하는 데 사용되는</td> <td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>말 혈청</td>으로 사용 <td>Thermo Fisher</td><td>26050088</td> 배양 배지 12 웰 유리 바닥 플레이트를 <td>보충하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td>EGF</td></tr><tr><td>(표피 성장 인자, 인간 재조합)</td> 이미징을위한 세포 성장에 사용 <td>Peprotech</td><td>세포</td><td>를 자극하는 데 사용되는</td>AF-100-15</tr><tr><td>지방산이 없는 BSA</td><td>시그마</td><td>A8806-1G</td>, <td>EGF</td></tr><tr><td>헤마톡실린</td><td>시그마</td>, <td>HHS32</td>, <td>식민지를 염색하는 데 사용되는</td></tr><tr><td>에오신</td><td>전자 현미경 과학</td><td>26051-10</td>, <td>식민지 37</td></tr><tr><td>&#176을 염색하는 데 사용됩니다. C, 5% CO2 인큐베이터</td><td>Sanyo</td><td>모델 MCO-18AIC(UV)</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver(인큐베이터 챔버 및 전동 스테이지 포함</td>) <td>Zeiss</td><td>모델 Axio Observer.Z1</td><td>타임랩스 이미징에 사용</td></tr><tr><td>ORCA 플래시 LT sCMOS 카메라</td><td>BioVision</td><td>C11440-42U-KIT</td><td>Zeiss AxioObserver</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>BioVision</td><td>MMACQMIC</td><td>타임 랩스 이미징</td></tr><tr><td>도립 현미경</td>에 사용되는 소프트웨어 <td>Olympus</td><td>모델 IX70</td>은 <td>세포를 계수하고 조직 배양 플라스틱 상자에서 콜로니를 확인하는 데 사용됩니다</td></tr>.<tr><td></td><td> Lock</td><td>N/A</td>는 <td>습한 챔버로 사용됨(플레이트에 맞는 단단히 닫히는 플라스틱 상자를 사용할 수 있음)</td></tr></tbody></table>

셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

복잡 한 유기 체 정적 표시, 그들의 조직의 지속적인 매출을 받고 있다. 세포 나이, 다이, 그리고 새로운 세포로 대체 셀 이동 조직 내의 긴밀 하 게 조율 된 방식. 종양 개발 하는 동안이 균형을 방해 하 고 종양 세포 두고 침공 지역 microenvironment, 먼 사이트에 여행 하 고 궁극적으로 먼 사이트에서 전이성 종양을 형성 하는 근원의 상피. 점 분석 결과 간단 하 고, 2 차원 무제한 마이그레이션 분석 결과, 셀 무료 영역에 셀 시트의 net 움직임을 평가 하 고 셀 마이그레이션 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 매개 변수를 분석 하는. 여기, 점 분석 결과 셀 표 피 성장 인자 (EGF), 유방암 세포의 악성 가능성을 높이기 위해 알려진 철새 응답을 분석 하는 인간의 침략, 유 방 암 세포 선, MCF10CA1a, 형성 하는 폐 식민지를 사용 하 여 증명 되 고 변경 셀의 철새 형 하.

(그림 1)을 여기에 제시 된 점 분석 결과 침략를 사용 하 여 수행한 모델 시스템으로 유방암 세포 (MCF10CA1a)를 형성 하는 폐 식민지. 점 분석 결과 수익률 편리는 초보자의 손에 에서도 높은 재현성 셀 점 분석 결과 (그림 1D) 실행 하기 쉬운. 점 분석 결과 그 얼룩, 또는 시간 경과 영상 결합 및 후속 입자 이미지 velocimetry (PIV) 수의 상피 가장자리, 셀 속도 및 가장자리에 셀으로 셀 방향 변위를 포함 하 여 다양 한 마이그레이션 매개 변수 연구 상피 시트의 셀 자유로운 지역으로 마이그레이션하십시오. 처음, 셀 점 들의 위상 대비 영상 그 침략, 폐 식민지 형성 유방암 세포 (MCF10CA1a) 유지 엽 형 EGF와 자극 후 공개 했다. 그러나, 단일 셀 시트를 떠나는 자극 하는 EGF 셀 점 (<str...

셀 마이그레이션 개발, 조직 유지 보수 및 수리, 및 tumorigenesis, 필수적 이며, 성장 요인, 발산, 및 cytokines에 의해 규제 됩니다. 이 프로토콜 점 분석 결과를, microenvironmental 신호에 연결 된, 응집력 있는 셀 시트의 철새 형을 평가 하기 위해 2 차원, 무제한 마이그레이션 분석 결과 설명 합니다.

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

점 분석의 전반적인 목표는 미세환경적 단서에 반응하여 부착된 응집력 있는 세포 시트의 이동 표현형을 평가하는 것입니다. 이 방법은 사이토카인 또는 성장 인자(growth factor)가 종양 세포의 운동성을 어떻게 변화시키는지와 같은 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 점 분석의 주요 장점은 쉽게 수행되고 재현성 있는 결과를 위해 사용된다는 것입니다.이 방법은 세포 운동성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 성장 집락 형태 및 세포 산란을 평가하기 위한 세포 염색, 면역 염색, 단백질 및 DNA 또는 RNA 분석, 동물에 세포 주입과 같은 다양한 후속 분석에도 적합합니다. 먼저 얼음에서 마우스 콜라겐 4를 해동하고 50마이크로몰 HCL로 희석하여 10마이크로그램/밀리리터 콜라겐 4용액 3ml를 준비합니다. 250마이크로리터의 콜라겐 4용액을 12웰 유리 바닥 플레이트의 웰에 넣고 적절한 크기의 단단히 닫히는 플라스틱 상자에 넣습니다.젖은 종이 타월을 접시 위와 주위에 놓아 습한 챔버를 만들고 상자를 닫습니다. 그런 다음 실온에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음날 아침, 흡수되지 않은 콜라겐과 완충액을 이동하려면 탈이온수를 사용하여 플레이트를 두 번 헹구고 가장자리 바닥과 덮개 슬립에 의해 형성된 가장자리가 아닌 플레이트 웰의 가장자리로 물을 보냅니다.층류 후드에서 플레이트를 자연 건조하고 즉시 사용하거나 최대 5일 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오. 세포 현탁액을 준비하려면 60mm 조직 배양 접시에서 성장한 세포를 DMEMF12 배지에 5% 호스 세럼에서 80% 합류점으로 보충한 세포를 사용합니다. 칼슘 및 마그네슘이 없는 DPBS를 사용하여 세포를 한 번 헹군 다음 500마이크로리터의 실온 트립신 EDTA를 첨가하고 3-5분 동안 가습된 분위기에서 5%CO2의 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.분리된 세포를 4.5ml의 배양 배지에 현탁시켜 트립신 활성을 중단하고, 혈구계를 사용하여 세포 현탁액의 20μL 부분 표본을 계수합니다. 50ml 원뿔형 튜브에 있는 나머지 세포를 200배 중력에서 3분 동안 원심분리하여 빼냅니다. 그런 다음, 상등액을 흡인하고, 배양 배지에서 세포를 10 배의 3 배에서 밀리리터 당 6 개의 세포로 다시 현탁시킨다.콜라겐 4 코팅 12 웰 유리 바닥 플레이트의 각 커버 슬립 중앙에 세포를 플레이트하려면 코팅을 만지거나 긁지 않도록주의하면서 10 마이크로 리터의 세포 현탁액을 떨어 뜨립니다. 비원형 드롭을 도금하면 원형 셀 시트가 생성되지 않으며 코팅을 만지거나 긁으면 세포가 잘 부착되는 것을 방지할 수 있습니다. 세포가 부착될 수 있도록 섭씨 37도의 가습 분위기에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.그런 다음 도립 현미경으로 부착 사항을 확인합니다. 1ml의 배양 배지로 웰을 부드럽게 두 번 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한 다음 각 웰에 1ml의 배양 배지를 추가합니다. 도립 현미경으로 떠 있는 세포가 남아 있지 않은지 확인하고, 그렇지 않으면 우물을 다시 씻으십시오.잘 정의된 세포 시트를 얻기 위해 가습된 분위기에서 섭씨 37도의 5%CO2에서 밤새 세포를 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 모든 웰을 확인하여 세포 군집이 제대로 성장했는지 확인합니다. 필요한 경우 적합하지 않은 우물을 표시하고 사용하지 마십시오.조사된 각 조건에 대해 플레이트의 각 웰에 적절하게 레이블을 지정합니다. 각 조건을 중복 또는 삼중으로 실행합니다. 세포가 자극되기 3시간 전에 0.1% 말 혈청을 함유한 DMEMF12의 세포를 굶주리도록 매체를 변경합니다.그런 다음 EGF 또는 기타 원하는 매개체를 추가하여 세포를 자극합니다. 1마이크로리터 피펫을 사용하거나 플레이트를 부드럽게 휘저어 매체를 혼합합니다. 플레이트를 1일에서 4일 동안 배양하여 가장자리 변위와 가장자리 윤곽을 관찰합니다.H 및 E 염색을 수행하려면 PBS로 세포를 두 번 세척하고 약 2분 동안 고정합니다. 헤마톡실린을 약 2분 동안 첨가하여 핵을 염색합니다. 핵이 파란색이 될 때까지 5-10분 동안 수돗물로 세포를 씻습니다.그런 다음 세포질을 에오신으로 2분 동안 염색한 후 탈이온수로 세포를 헹굽니다. 접시를 자연 건조시킨 다음 뒤집고 자를 사용하여 점 직경을 측정합니다. 또는 카메라로 플레이트의 사진을 찍고 ImageJ를 사용하여 점 직경을 분석합니다.타임랩스 현미경 검사를 수행하려면 인큐베이터 현미경을 켜고 온도를 섭씨 37도로 조정하십시오. 가습기에 DH2O를 채운 다음 CO2를 5%로 조정합니다.인큐베이터 챔버가 가습되고 전동 스테이지가 자유롭게 움직일 수 있는지 확인하십시오. 그런 다음 인큐베이터 챔버를 닫고 현미경이 섭씨 37도로 조정되도록 합니다.플레이트를 인큐베이터 현미경의 스테이지에 놓고 스테이지 목록을 설정한 다음 두 개의 반대쪽 가장자리와 각 셀 점의 중심을 이미지화합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 15시간에서 24시간 동안 3분마다 이미지를 촬영합니다. 데이터를 다운로드하고 Matlab과 같은 원하는 프로그램에서 이미지 분석을 진행합니다.초기에 세포 점의 위상차 이미징은 침습적이고 폐 집락을 형성하는 유방암 세포가 EGF로 자극한 후 중간엽 표현형을 유지한다는 것을 밝혔습니다. 그러나 시트를 떠나는 단일 세포는 EGF 자극 세포 점에서 더 자주 관찰됩니다. EGF에 대한 폐 집락을 형성하는 유방암 세포의 반응은 4일 동안 EGF로 자극된 배양액의 H 및 E 염색으로 추가로 평가되었습니다.실제로, EGF 자극은 콜로니 직경을 증가시켰으며, 이는 EGF가 자극된 세포의 이동이 변경될 수 있음을 나타냅니다. 이 점 분석에서는 EGF로 집락을 형성하는 유방암 세포를 자극한 후 시트 가장자리의 세포를 9시간 동안 이미지화했습니다. PIV는 EGF가 대조 세포에서 세포 속도를 분당 0.45마이크로미터에서 분당 0.63마이크로미터로 증가시켰다고 밝혔습니다.또한 EGF는 대조군 배양에서 세포 방향성 또는 각도 확산의 변동성을 EGF 자극 배양에서 0.79로 줄였습니다. 또한, 4일 후 H 및 E 염색에서 관찰된 바와 같이, EGF는 9시간 동안 상피 가장자리의 방사형 변위를 257마이크로미터에서 356마이크로미터로 증가시켰습니다. 이 기술을 마스터하면 실습 시간이 몇 시간 걸립니다.이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 타임 랩스 이미징, 면역 염색, DNA 및 RNA 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질이 빠르게 이동하거나 느리게 이동하는 세포에서 다르게 발현되는지 또는 세포가 주변 환경으로 이동할 때 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 점 분석을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이를 사용하여 미시환경 신호에 반응하여 부착된 응집력 세포 시트의 이동 표현형을 평가하는 방법을 이해할 수 있을 것입니다.

using-the-dot-assay-to-analyze-migration-of-cell-sheets

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

조기 내피 세포(EEC) 이동에 대한 조사는 특정 질병의 병태생리학을 이해하고 잠재적으로 치료 개입을 위한 새로운 전략을 식별하는 데 중요합니다. 다음 프로토콜은 EEC 조사에 맞게 조정된 세포 이동을 평가하는 기술을 설명합니다.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

과립 하이드로겔 내부 및 계면으로의 3D 세포 이동에 대한 정량적 평가를 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

배우세요 점 분석법을 사용하여 응집된 세포 시트의 이동 표현형을 평가하는 방법을 익히세요. 이 기술은 암 연구에서 세포 운동성에 대한 미세환경 신호의 영향을 이해하는 데 활용됩니다.

셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여

더 많은 동영상 탐색