셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여

점 분석의 전반적인 목표는 미세환경적 단서에 반응하여 부착된 응집력 있는 세포 시트의 이동 표현형을 평가하는 것입니다. 이 방법은 사이토카인 또는 성장 인자(growth factor)가 종양 세포의 운동성을 어떻게 변화시키는지와 같은 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 점 분석의 주요 장점은 쉽게 수행되고 재현성 있는 결과를 위해 사용된다는 것입니다.

이 방법은 세포 운동성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 성장 집락 형태 및 세포 산란을 평가하기 위한 세포 염색, 면역 염색, 단백질 및 DNA 또는 RNA 분석, 동물에 세포 주입과 같은 다양한 후속 분석에도 적합합니다. 먼저 얼음에서 마우스 콜라겐 4를 해동하고 50마이크로몰 HCL로 희석하여 10마이크로그램/밀리리터 콜라겐 4용액 3ml를 준비합니다. 250마이크로리터의 콜라겐 4용액을 12웰 유리 바닥 플레이트의 웰에 넣고 적절한 크기의 단단히 닫히는 플라스틱 상자에 넣습니다.

젖은 종이 타월을 접시 위와 주위에 놓아 습한 챔버를 만들고 상자를 닫습니다. 그런 다음 실온에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음날 아침, 흡수되지 않은 콜라겐과 완충액을 이동하려면 탈이온수를 사용하여 플레이트를 두 번 헹구고 가장자리 바닥과 덮개 슬립에 의해 형성된 가장자리가 아닌 플레이트 웰의 가장자리로 물을 보냅니다.

층류 후드에서 플레이트를 자연 건조하고 즉시 사용하거나 최대 5일 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오. 세포 현탁액을 준비하려면 60mm 조직 배양 접시에서 성장한 세포를 DMEMF12 배지에 5% 호스 세럼에서 80% 합류점으로 보충한 세포를 사용합니다. 칼슘 및 마그네슘이 없는 DPBS를 사용하여 세포를 한 번 헹군 다음 500마이크로리터의 실온 트립신 EDTA를 첨가하고 3-5분 동안 가습된 분위기에서 5%CO2의 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

분리된 세포를 4.5ml의 배양 배지에 현탁시켜 트립신 활성을 중단하고, 혈구계를 사용하여 세포 현탁액의 20μL 부분 표본을 계수합니다. 50ml 원뿔형 튜브에 있는 나머지 세포를 200배 중력에서 3분 동안 원심분리하여 빼냅니다. 그런 다음, 상등액을 흡인하고, 배양 배지에서 세포를 10 배의 3 배에서 밀리리터 당 6 개의 세포로 다시 현탁시킨다.

콜라겐 4 코팅 12 웰 유리 바닥 플레이트의 각 커버 슬립 중앙에 세포를 플레이트하려면 코팅을 만지거나 긁지 않도록주의하면서 10 마이크로 리터의 세포 현탁액을 떨어 뜨립니다. 비원형 드롭을 도금하면 원형 셀 시트가 생성되지 않으며 코팅을 만지거나 긁으면 세포가 잘 부착되는 것을 방지할 수 있습니다. 세포가 부착될 수 있도록 섭씨 37도의 가습 분위기에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 도립 현미경으로 부착 사항을 확인합니다. 1ml의 배양 배지로 웰을 부드럽게 두 번 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한 다음 각 웰에 1ml의 배양 배지를 추가합니다. 도립 현미경으로 떠 있는 세포가 남아 있지 않은지 확인하고, 그렇지 않으면 우물을 다시 씻으십시오.

잘 정의된 세포 시트를 얻기 위해 가습된 분위기에서 섭씨 37도의 5%CO2에서 밤새 세포를 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 모든 웰을 확인하여 세포 군집이 제대로 성장했는지 확인합니다. 필요한 경우 적합하지 않은 우물을 표시하고 사용하지 마십시오.

조사된 각 조건에 대해 플레이트의 각 웰에 적절하게 레이블을 지정합니다. 각 조건을 중복 또는 삼중으로 실행합니다. 세포가 자극되기 3시간 전에 0.1% 말 혈청을 함유한 DMEMF12의 세포를 굶주리도록 매체를 변경합니다.

그런 다음 EGF 또는 기타 원하는 매개체를 추가하여 세포를 자극합니다. 1마이크로리터 피펫을 사용하거나 플레이트를 부드럽게 휘저어 매체를 혼합합니다. 플레이트를 1일에서 4일 동안 배양하여 가장자리 변위와 가장자리 윤곽을 관찰합니다.

H 및 E 염색을 수행하려면 PBS로 세포를 두 번 세척하고 약 2분 동안 고정합니다. 헤마톡실린을 약 2분 동안 첨가하여 핵을 염색합니다. 핵이 파란색이 될 때까지 5-10분 동안 수돗물로 세포를 씻습니다.

그런 다음 세포질을 에오신으로 2분 동안 염색한 후 탈이온수로 세포를 헹굽니다. 접시를 자연 건조시킨 다음 뒤집고 자를 사용하여 점 직경을 측정합니다. 또는 카메라로 플레이트의 사진을 찍고 ImageJ를 사용하여 점 직경을 분석합니다.

타임랩스 현미경 검사를 수행하려면 인큐베이터 현미경을 켜고 온도를 섭씨 37도로 조정하십시오. 가습기에 DH2O를 채운 다음 CO2를 5%로 조정합니다.인큐베이터 챔버가 가습되고 전동 스테이지가 자유롭게 움직일 수 있는지 확인하십시오. 그런 다음 인큐베이터 챔버를 닫고 현미경이 섭씨 37도로 조정되도록 합니다.

플레이트를 인큐베이터 현미경의 스테이지에 놓고 스테이지 목록을 설정한 다음 두 개의 반대쪽 가장자리와 각 셀 점의 중심을 이미지화합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 15시간에서 24시간 동안 3분마다 이미지를 촬영합니다. 데이터를 다운로드하고 Matlab과 같은 원하는 프로그램에서 이미지 분석을 진행합니다.

초기에 세포 점의 위상차 이미징은 침습적이고 폐 집락을 형성하는 유방암 세포가 EGF로 자극한 후 중간엽 표현형을 유지한다는 것을 밝혔습니다. 그러나 시트를 떠나는 단일 세포는 EGF 자극 세포 점에서 더 자주 관찰됩니다. EGF에 대한 폐 집락을 형성하는 유방암 세포의 반응은 4일 동안 EGF로 자극된 배양액의 H 및 E 염색으로 추가로 평가되었습니다.

실제로, EGF 자극은 콜로니 직경을 증가시켰으며, 이는 EGF가 자극된 세포의 이동이 변경될 수 있음을 나타냅니다. 이 점 분석에서는 EGF로 집락을 형성하는 유방암 세포를 자극한 후 시트 가장자리의 세포를 9시간 동안 이미지화했습니다. PIV는 EGF가 대조 세포에서 세포 속도를 분당 0.45마이크로미터에서 분당 0.63마이크로미터로 증가시켰다고 밝혔습니다.

또한 EGF는 대조군 배양에서 세포 방향성 또는 각도 확산의 변동성을 EGF 자극 배양에서 0.79로 줄였습니다. 또한, 4일 후 H 및 E 염색에서 관찰된 바와 같이, EGF는 9시간 동안 상피 가장자리의 방사형 변위를 257마이크로미터에서 356마이크로미터로 증가시켰습니다. 이 기술을 마스터하면 실습 시간이 몇 시간 걸립니다.

이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 타임 랩스 이미징, 면역 염색, DNA 및 RNA 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질이 빠르게 이동하거나 느리게 이동하는 세포에서 다르게 발현되는지 또는 세포가 주변 환경으로 이동할 때 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 점 분석을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이를 사용하여 미시환경 신호에 반응하여 부착된 응집력 세포 시트의 이동 표현형을 평가하는 방법을 이해할 수 있을 것입니다.