Name: Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 생정소관 스쿼시 기술을 이용한 마우스 정자형성 과정의 세포학적 분석 방법을. 이 기술은 감수분열 중인 정자세포를 관찰하고 남성 생식 생물학의 이해를 높이는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품 NIGMS (R01GM11755) P.W.J.에 의해 및 훈련 그랜트 친목에서 미국 국립 암 연구소 (NIH) (CA009110) S.R.W. 하 재 혁에 의해 지원 되었다

마우스를 사용 하 여 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었다. 실험 청소년 (20-26 일 산 후, dpp)에서 수행한 C57BL/6J 마우스, spermatogenesis 반동기 첫 번째 물결의 활용. 그러나,이 기술은 또한 수행할 수 있습니다 성인 쥐를 사용 하 여.
1. 해 부 및 마우스 seminiferous tubules의 절연
<ol><li>수정/세포 솔루션 및 항 체 희석 버퍼 (ADB) 표 1 및 표 2에 설명 된 준비.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (1 x PBS, pH 7.4), x 1의 3 mL와 함께 한 35 mm 페 트리 접시와 마우스 당 수정/세포 솔루션의 2 mL와 함께 또 다른 35 m m 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>자 궁 경관 탈 구 또는 CO2 질을 통해 마우스를 희생 하 고 70% 에탄올과 복 부 복 부를 스프레이. 살 균가 위, V 자형 오프닝 만들기를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. Testes, 집게를 사용 하 여 epididymal 지방 패드를 제거 그리고 tunica albuginea방해 하지 마십시오. 1 x PBS를 포함 하는 35 mm 페 트리 접시에 testes를 놓습니다. 참고: 관심14의 풍부한 세포 인구를 관찰 하기 위해 spermatogenesis의 첫 번째 파도 이용 한다. Spermatogenesis의 특정 단계 다른 마우스 연령대 (표 3)에 농축 된다.</li>
	<li>날카로운 흘린된 집게와 조직 puncturing 의해 tunica albuginea 고환 제거 하 고 느슨한 seminiferous tubules를 수집. 새로운 35 mm 페 트리 접시 수정/세포 솔루션의 2 개 mL를 포함 하는 tubules를 전송 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 수정/세포 솔루션에서 tubules를 품 어.</li>
</ol>2입니다. seminiferous tubules의 준비
<ol><li>액체 차단 펜으로 슬라이드의 가장자리를 표시 하 여 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드를 준비 합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드 중심에 수정/세포 솔루션의 100 µ L를 적용 됩니다.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여와 위를 부드럽게 떨어져 seminiferous tubules 애타게. 오래 개별 관 절단 길이 약 20 m m를 세그먼트화합니다. 참고: centrosomes와 같은 장기간된 통 노출에 민감한 구조를 시각화, 1 x PBS에는 tubules를 먼저 분리 후 직접 말하다 tubules의 표면에 폴 리 리 신 슬라이드 수정 세포 솔루션의 100 µ L에 코팅.</li>
	<li>수정/세포 솔루션을 포함 하는 준비 된 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드에 5 개의 20 밀리미터 긴 seminiferous 관 세그먼트를 전송 합니다.</li>
	<li>1.5에서 3.0 m m 세그먼트로 살 균가 위 말하다 seminiferous tubules를 사용 하 여.</li>
	<li>사용 하 여 살 균 겸 정렬할 관 세그먼트를 유리 슬라이드에 없습니다 조직을 중복, tubules는 균등 하 게 배포. 참고: 유리 슬라이드에 관 세그먼트의 최적의 번호 20와 40 사이입니다.</li>
</ol>3. 부 수 seminiferous tubules의
<ol><li>분산된 seminiferous 관 세그먼트는 벤치탑에 포함 된 유리 슬라이드를 전송 합니다. 스쿼시 단계 조직 손실을 방지 하려면 실험실 지우기를 사용 하 여 과잉 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드 위에 coverslip (22 x 60-1.5 m m)를 적용 하 고 10-20 초에 대 한 손바닥의 발뒤꿈치와 압력을 적용. 그것은 seminiferous tubules에서 spermatocytes를 분산 하도록 충분 한 힘을 적용 해야 합니다. 참고: 해 부 현미경 사용 하 여 모든 관 세그먼트 중단은 퇴치 단계를 최적화 하는 tubules를 관찰 합니다.</li>
	<li>슬라이드 집게를 사용 하 여, 즉시 플래시 동결 액체 N2 의 작은 dewar의 유리 슬라이드 15 초, 또는 액체 거품 중단 될 때까지. Immunolabeling는 즉시, 직선 모서리 면도날으로 coverslip 제거, 좋은 팁 집게 또는 21-게이지 바늘. 참고: 최적의 결과 immunolabel에 대 한 즉시 슬라이드 (4 단계 참조). 그러나,이 시점에서 슬라이드 수 유지-80 ° C에서 최대 2 주 동안. 단백질 및 세포 구조물의 수명을 최대화 하기 위해 즉시 드라이 아이스 또는-80 ° C 냉장고에 슬라이드를 저장 하 고 슬라이드에는 coverslip 유지. Immunolabeling 슬라이드를 저장 하는 경우 단계 3.3에에서 설명 된 대로 15 초 동안 액체 N2 에서 슬라이드를 immersing 하 여는 coverslip을 제거 합니다.</li>
</ol>4입니다. 마운트 seminiferous tubules의 Immunolabeling
<ol><li>공영 방송, 그리고 세 번 1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분 동안 세척 x 1에 슬라이드를 담가. 참고: 결코 허용 슬라이드 immunolabeling 동안 완전히 건조.</li>
	<li>1-2 h 습도 챔버에 차단 유리 슬라이드에 항 체 희석 버퍼의 1 mL를 적용 합니다.</li>
	<li>항 체 희석 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 항 체 희석 버퍼 습도 챔버에에서 희석의 100 µ L를 적용. 참고: 최상의 결과 얻으려면 기본 항 체 4 ° c.에 하룻밤을 품 어 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예: 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다. 유효성을 검사 하 고 기본 항 체15최적화.</li>
	<li>1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분에 대 한 세 번 슬라이드를 씻어. 참고: 을 강화 하기 위해 세척 Coplin 단지 작은 자석 저 어 막대를 사용 하 여 선동 낮은 속도로 자기 저 어 접시에 장소 또는 낮은 속도로 탁상 믹서에 Coplin jar를 배치.</li>
	<li>실내 온도에 습도 챔버에 1 ~ 1.5 h에 대 한 항 체 희석 버퍼에 희석 이차 항 체의 100 µ L를 적용 합니다. 사진 fluorophore 활용 된 항 체의 표백 피하기 위해 어두운 상자에서 슬라이드를 품 어. 참고: 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예: 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다.</li>
	<li>1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분에 대 한 두 번 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>장착 매체 포함 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5 µ g/mL)에서 슬라이드를 탑재 하 고 coverslips (22 x 60-1.5 m m)를 적용 합니다.</li>
	<li>슬라이드를 보존 하는 coverslips 이동에서 방지 투명 매니큐어와 슬라이드 coverslips 인감.</li>
</ol>5. 분석 및 이미징 관 스쿼시 준비
<ol><li>Epifluorescence 현미경을 사용 하 여 정확한 z 축 이동 하 고 이미지 캡처에 대 한 고해상도 카메라 자동 무대. 또는 사용 하는 레이저 confocal 현미경. 참고: 이 단계에 대 한 모든 사용 가능한 하드웨어와 소프트웨어를 사용 합니다. 예를 들어 그림 1 과 그림 2 에 표시 된 이미지를 자이 스 셀 관찰자 Z1 오카-플래시 4.0 CMOS 카메라에 연결 하 고 Zeiss 선 2012 블루 에디션 이미지 소프트웨어와 함께 분석을 사용 하 여 점령 했다.</li>
	<li>스쿼시 준비의 품질을 결정 하는 20 X 목표를 사용 하 여 슬라이드를 평가 합니다. 좋은 품질 슬라이드는 균등 하 게 배포 되는 핵의 단층. 참고: 슬라이드의 일부 섹션은 다른 사람 들 보다 더 있을 수 있습니다, 그리고 어디 슬라이드의 최고의 지역 높은 확대를 사용 하 여 추가 분석을 위해 찾을 수 있습니다의 좌표를 참고 것이 좋습니다.</li>
	<li>높은 확대 목표 (예: 63 X 또는 X 100), 핵의 일관 된 단층 되는 슬라이드의 캡처 영역을 사용 하 여. 영역 선택 위쪽을 설정 하 고 Z-스택 모든 초점에 빛을 캡처 되도록 낮은. 참고: Z-스택 위와 더 낮은 한계 사이 촬영의 최적의 수 이미지 수집 소프트웨어에 의해 일반적으로 지정 하 고 각 목표에 대 한 다른.</li>
	<li>이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 컴파일하려면 깊이 확장된 초점 이미지. 소프트웨어 스택에서 각 Z-, 초점에 빛을 결합 하 고 관 스쿼시 준비의 최적의 이미징에 대 한 필수적입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+all+germ+cells+are+created+equal%3A+Aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li>
<li>Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+meiotic+prophase+I+to+metaphase+I+transition+in+mouse+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes.</a> Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+method+to+preserve+three-dimensional+chromatin+architecture+of+testicular+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells.</a> J Vis Exp. (83), e50819(2014).</li>
<li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li>
<li>Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+spermatogenesis%3A+how+far+from+clinical+application%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Urol+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?</a> Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).</li>
<li>Staub, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+mammalian+male+germ+cell+meiotic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro.</a> J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).</li>
<li>Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Squash+procedure+for+protein+immunolocalization+in+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells.</a> Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Xu, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+cryosection+method+for+mouse+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">A modified cryosection method for mouse testis tissue.</a> Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).</li>
<li>Hess, R., Moore, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+methods+for+evaluation+of+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Histological methods for evaluation of the testis.</a> Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).</li>
<li>Bellvé, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat%3A+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).</li>
<li>Bellvé, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+the+mouse+testis+and+characterization+of+isolated+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells.</a> J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination%2C+pairing%2C+and+synapsis+of+homologs+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination%3A+the+essence+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination: the essence of heredity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere+and+telomere+movements+during+early+meiotic+prophase+of+mouse+and+man+are+associated+with+the+onset+of+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing.</a> J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leptotene-zygotene+transition+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The leptotene-zygotene transition of meiosis.</a> Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).</li>
<li>Scherthan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bouquet+makes+ends+meet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A bouquet makes ends meet.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).</li>
<li>Turner, J. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/134/10/1823">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Royo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+acts+stage+specifically+to+regulate+multiple+aspects+of+mammalian+meiotic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing.</a> Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).</li>
<li>Turner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+unsynapsed+meiotic+chromosomes+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse.</a> Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).</li>
<li>Marjanović, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP63+deficiency+promotes+p53-dependent+microcephaly+and+reveals+a+role+for+the+centrosome+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination.</a> Nat Commun. 6, 7676(2016).</li>
<li>Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Centrosome-autonomous+signal+that+involves+centriole+disengagement+permits+centrosome+duplication+in+G2+phase+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage.</a> Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).</li>
<li>Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+mammalian+sperm+cells+identifies+new+components+of+the+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).</li>
<li>Fukuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transacting+factor+CBF-A%2FHnrnpab+binds+to+the+A2RE%2FRTS+element+of+protamine+2+mRNA+and+contributes+to+its+translational+regulation+during+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003858(2013).</li>
<li>Lahn, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Previously+uncharacterized+histone+acetyltransferases+implicated+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).</li>
<li>Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+association+of+histone+macroH2A1.2+in+embryonic+stem+cells+and+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells.</a> Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).</li>
<li>Shanmugam, M., Hernandez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+for+SNAP45%2C+a+subunit+of+the+small+nuclear+RNA-activating+protein+complex+SNAPc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).</li>
<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Amory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+spermatogenesis+by+bisdichloroacetyldiamines+is+mediated+by+inhibition+of+testicular+retinoic+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis.</a> J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).</li>
<li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami%3A+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18%2C446%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biol Reprod. 88 (2), 40(2013).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li>
<li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li>
<li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF%2FTRF2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li>
<li>Henriksén, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat%3A+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

마우스는 셀룰러 이벤트 spermatogenesis 동안 meiotic 진행을 제어 하는 공부에 대 한 유용한 모델 유기 체 입증. 또한, 그것 때문에 많은 이벤트와 같은 종료 meiotic 의향에서 내가 spermatogenesis의 연구 들만 하는 도구를 개발 하는 데 필요한, 성적으로 동종이 형. 이 프로토콜 seminiferous 관 스쿼시 방법을 시각화 및 서로 다른 단계의 마우스 spermatogenesis의 연구에 설명합니다. 이 방법은 세포 무결성을 보존 하며 그로 인하여 핵 및 세포질 구조의 상세한 분석 이 연구에서 묘사 하는 대표적인 결과 기본 spermatocytes meiotic 진행 진행 평가에서이 프로토콜의 유틸리티를 보여 줍니다. 또한,이 프로토콜 spermatogenesis, 확산 및 spermatogonia의 차별화와 spermiogenesis,2728의 단계를 포함 하 여 동안 다른 세포질 과...

감수 분열은 DNA 복제의 단일 라운드 세포 분열의 2 연속 라운드 뒤 복잡 한 세포 이벤트입니다. 여러 감수 분열-특정 이벤트는 정확한 염색체 분리 되도록 감수 분열의 초기 단계에서 조정 해야 합니다. 이러한 이벤트 등 동종 재결합, 자매의 공동 방향의 완료 첫번째 meiotic 사단 그리고 homologs 사이 chiasmata 해결 하려면 cohesin 복합물의 stepwise 손실 동안 kinetochores. 이러한 프로세스의 정확한 규정은 비 옥도 유지 하 고 유전 발달 장애 및 자연 유산1발생할 수 있습니다 염색체 missegregation 이벤트를 방지 하기 위해 필요 합니다.
감수 분열의 주요 이벤트는 남성과 여성 모두에서 자리를 차지할 하는 동안 중요 한 시간적 및 기계적 차이 spermatogenesis 및 oogenesis2사이 존재 한다. 예를 들어 여성 감수 분열, 의향 배아 개발 하는 동안 발생 하 고 dictyate 단계에서 사춘기까지 체포 중 반면, spermatogenesis 사춘기와 체포 하지 않고 성인 생활 내내 파도에 진행 개시. 남성과 여성의 감수 분열의 차이 특히 spermatocytes에 oocytes 이러한 프로세스 평가 쪽으로 음식을 장만 하는 방법을 개발 하는 필요를 강조 한다. 현재, chromatin 스프레드3,,45의 사용에 의존 meiotic 진행을 주로 평가 합니다. Chromatin 스프레드 meiotic 염색체를 공부 하는 데 유용 동안, 그들은 세포 구조 스핀 들 microtubules, centrosomes, 핵 봉투, telomere 첨부 파일 등의 평가 방지 하는 세포 무결성을 유지 하 실패. 라이브 이미징 및 장기 자란 기술을 크게 고급 여성 감수 분열;에 대 한 우리의 이해 그러나 전체 그대로 셀 시각화를 유사한 방법, 자주 spermatogenesis6,7의 연구에 대 한 구현 됩니다. 남성 감수 분열을 통해 동적 이벤트를 시각화 하기 위해 우리 빠르게 마우스 spermatocytes8,9개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해 설립 된 관 스쿼시 기술을 적응 시켰다. 여기 설명 하는 방법을 spermatogenesis의 다른 단계 동안 여러 세포 구조의 연구를 활성화 하는 세포의 무결성을 유지 합니다.
이 관 스쿼시 기술은 면역 형광 현미경을 통해 세포 구조의 평가 대 한 허용 하는 전체 셀 접근 이다. Haematoxylin 오신 파라핀 포함 testes, 및 cryosections의 immunofluorescent 라벨의 얼룩 등 남성 쥐에서 meiotic 진행을 시각화 하기 위해 일반적인 조직학 접근 허용 meiotic 진행에 대 한 광범위 한 개요. 그러나, 이러한 기술을 감수 분열10,11에 걸쳐 발생 하는 이벤트의 자세한 분석을 위해 필요한 범위 내에 단일 셀을 해결 하기 위해 실패 합니다. 대체 기술을 meiotic 프로세스를 시각화 하는 격리 하 고 수정 핵 자료3,,45spermatocyte 중요 한 chemiosmotic 중단에 의존 합니다. 이러한 화학 치료 기본 spermatocytes 다른 세포 유형의 관찰을 방해. Namekawa에 의해 최근에 설명된 방법 격리 spermatocytes의 핵 건축을 보존 하기 위해 연구 커뮤니티 활성화 하지만 cytospin 및 일부 실험실4쉽게 사용할 수 없을 수 있는 액세서리를 사용 해야 합니다. 대조적으로, 관 스쿼시 기술에는 대부분 세포 생물학 실험실에서 일반적으로 표준 장비를 필요 합니다.
여기 설명 하는 관 스쿼시 방법은 시각화 sertoli 세포, 등 spermatogonia, 기본 및 보조 spermatocytes spermatids seminiferous 관 내의 다양 한 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여 청소년 쥐에서 spermatogenesis 근처 동기 첫 번째 물결에이 기술을 결합해, 그들은 감수 분열12진행 spermatogenic 세포의 풍부한 인구를 가능 하다. 이 프로세스는 spermatogenesis 초기 의향 이벤트 등을 통해 프로세스의 상세한 분석, g 2/미와 분열 anaphase 전환 및 spermiogenesis를 허용합니다. 또한, 관 스쿼시 준비 시각화 염색체 (예: interchromatid 도메인 (Icd) 및 kinetochores)와 centrosomes (centrioles 및 pericentriolar 재료/행렬)의 cytological 기능을 사용할 수 있습니다. 스쿼시 메서드 chromatin 확산과 단백질 추출 등 다른 실험 방법 동시에 손쉽게 수행할 수 있습니다. 또한,이 기술은 성공적으로 수정 되었습니다 직접 시각화13슬라이드에 생활 spermatogenic 셀을 입금.
여기 설명 하는 방법을 야생-타입 C57BL/6J 마우스에서 g 2/미 전환 분석 전체 셀 seminiferous 관 스쿼시 기술을 포함 한다. 첫 번째 meiotic 부문 입력 기본 spermatocytes의 cytological 기능 관찰 meiotic 스핀 들에 면역 형광 검사 현미경 검사 법으로 시각화 했다. 이 다재 다능 한 기술은 다른 meiotic 단계와 다른 세포 유형 시각화를 쉽게 수정할 수 있습니다. 기술은 의무가 DNA와 RNA 물고기 접근 등 대체 시각화 전략 이기도합니다.

<table><tbody><tr><td>16% 파라포름알데히드 수성</td><td>전자 현미경 과학(EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>품질 생물학</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>시그마</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm 페트리 접시, 멸균, 비처리</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 코팅 유리 슬라이드</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>액체 차단제 펜</td><td>전자 현미경 과학(EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>습도 상자</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin 유리 염색 접시 5 또는 10 슬라이드용</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 슬라이드가 있는 매체(22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>투명 매니큐어</td><td>아마존</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microsopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호 </td><td>Comments</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 블루 에디션 이미지 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Human anti-Centromere Protein</td><td>항체 Incorporated</td><td>15-235</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>마우스 안티 알파 튜불린</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>마우스 anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>마우스 안티-&감마; H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1/500</td></tr><tr><td>마우스 anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1/200</td></tr><tr><td>토끼 anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-REC8</td><td>제공&nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1/1000</td></tr></tbody></table>

spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 cytological 분석을 위한 seminiferous 관 스쿼시 기술

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

남성에서 meiotic 진행 높은 규제 셀룰러 이벤트 수의 공동된 작업을 필요로 하는 프로세스입니다. 감수 분열 중 발생 하는 오류는 불 임, 임신 손실 또는 유전자 결함이 발생할 수 있습니다. 사춘기와 성인 기 통해 계속의 개시에 개시, spermatocytes의 연속 반동기 파도 spermatogenesis 받아야 하 고 궁극적으로 단일 정자를 형성 한다. 마우스 spermatocytes meiotic 개시 진행의 첫 번째 파도 (10 dpp) 산 10 일 후에 나타납니다 하 고 35 dpp에서 성숙한 정자로 seminiferous tubules의 루멘으로 해제 됩니다. 따라서, 그것은 관심의 매우 풍부한 인구를 얻기 위하여이 발달 시간 창 내에서 마우스를 이용 하입니다. 희귀 세포 단계의 분석 이전 마우스는 tubules 내 세포 인구의 다양성을 증가 하는 연속 spermatogenic 파도의 기여 금 때문에 더 어렵습니다. 여기 설명 하는 방법을 spermatogonia, spermatocytes, 및 spermatids를 포함 하 여 쥐의 seminiferous tubules 내 세포의 cytological 평가 위한 쉽게 구현 된 기술입니다. 관 스쿼시 기술 격리 된 남성 생식 세포의 무결성을 유지 하 고 세포 구조를 다른 기술로 쉽게 시각화 하지의 시험 있습니다. 설명 하기 위해이 관 스쿼시 기술의 가능한 애플 리 케이 션, 스핀 들 어셈블리 spermatocytes 내가 전환 분열에 의향을 통해 진행 (g 2/미 전환) 모니터링 했다. 또한, centrosome 중복, meiotic 섹스 염색체 비활성화 (MSCI), 및 염색체 꽃다발 형성이 관 스쿼시 메서드를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 cytological 구조의 사례로 평가 됐다. 이 기술은 spermatogenesis 동안 돌연변이 또는 외 인 섭 동에 의해 발생 하는 특정 결함을 정확 하 게 사용할 수 있습니다 따라서, 우리의 분자 spermatogenesis 이해에 기여.

여기, 우리가 분열 하는 의향을 겪고 일시적인 세포 인구를 시각화 하 관 스쿼시 메서드 사용 난 (G2/MI) 청소년 야생-타입 마우스 spermatogenesis (24의 첫번째 파를 겪고에서 testes를 수확 하 여 농축 된 전환 민 진 당)입니다. 그림 1 관 스쿼시 메서드를 사용 하 여 구상 될 수 있다 다양 한 셀 단계의 대표 이미지를 묘사. 분열의 농축 내가 spermatocytes 알파-tubulin (그림 1A)에 대하여 항 체를 사용 하 여 시각화 했다. 초반과 후반 감수 분열에 대 한 마커를 활용 하는 우리 나 무대 meiotic 진행. 관 스쿼시 준비 했다 synaptonemal 복잡 한 단백질, SYCP3의 의향 I. Leptotene/zygotene 단계를 시각화 하는 항 체를 immunolabeled 하 고 pachytene/diplote...

이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

이 정액 세뇨관 스쿼시 기술의 전반적인 목표는 세포 무결성을 유지하면서 마우스 정자증, 정자 세포 및 정자류의 세포학적 특징을 시각화하는 것입니다. 이 시연에서는 감수분열을 겪고 있는 정세포의 분석에 중점을 둡니다. 이 방법은 정자 줄기 세포 분화, 감수분열 염색체 분리, 둥근 정자의 감수분열 후 분화와 같은 남성 생식 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 수컷 생식 세포의 세포 무결성이 유지되어 다른 기술로는 쉽게 시각화되지 않는 세포 구조를 검사할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 모든 판금에서 불임의 부계 원인에 대한 이해를 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 그리고 그것은 쥐 또는 장기 기증자 유래 고환과 같은 포유류 시스템에 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 좋은 스쿼시를 만드는 데 어려움을 겪을 것입니다. 충분한 힘을 가하고 세뇨관을 적절하게 배열하는 것은 균일한 단층의 세포를 생성하는 데 중요한 요소입니다. 각 마우스를 해부할 때마다 35mm 페트리 접시 2개, 하나는 3밀리리터의 PBS로, 다른 하나는 2밀리리터의 갓 만든 고정액 용해 용액을 넣습니다.정자 형성의 첫 번째 물결을 겪고 있는 마우스를 선택하여 풍부한 관심 집단을 관찰합니다. 마우스를 희생 한 후 70 % 알코올로 복부를 청소한 후 수술을 진행합니다. 복부 골반강에 V자형 구멍을 만들고 집게를 사용하여 부고환 지방 패드를 당겨 고환을 제거하되 tunica albuginea를 방해하지 않습니다.PBS가 들어 있는 접시에 고환을 옮깁니다. 거기에서 날카로운 집게로 조직을 뚫어 고환 tunica albuginea를 제거하고 느슨한 정액 세뇨관을 수집합니다. 그런 다음 Fixative Lysis 용액을 사용하여 세뇨관을 접시에 옮기고 실온에서 5분 동안 반응을 진행합니다.배양하는 동안 액체 차단 펜으로 슬라이드의 가장자리를 윤곽을 그린 다음 테두리 내에서 100마이크로리터의 고착 용해 용액으로 슬라이드를 채워 폴리-L-라이신 코팅된 유리 슬라이드를 준비합니다. 5분 배양 후 멸균 집게와 가위를 사용하여 20mm의 개별 세그먼트를 얻을 수 있도록 정세관을 부드럽게 떼어내고 자릅니다. 다음으로, 5개의 20mm 세뇨관 세그먼트를 준비된 슬라이드로 옮깁니다.그런 다음 가위를 사용하여 세그먼트를 1.5-3mm 길이로 계속 나눕니다. 이제 겸자를 사용하여 세그먼트가 겹치지 않도록 정렬합니다. 슬라이드 전체에 균등하게 분배합니다.이상적으로는 20-40개의 짧은 길이가 하나의 슬라이드를 차지합니다. 흡수성 티슈를 사용하여 슬라이드 준비물에서 과도한 액체를 제거하는 것으로 시작합니다. 이제 커버 슬립을 바르고 10-20초 동안 손바닥 뒤꿈치의 압력을 사용하여 세뇨관을 짓밟습니다.목표는 정세관에서 정세포를 분산시킬 수 있을 만큼 충분한 힘을 가하는 것입니다. 해부 현미경을 사용하여 분절이 호박에 의해 파괴되었는지 확인합니다. 그런 다음 작은 듀어에 약간의 액체 질소를 붓고 15초 동안 또는 액체가 거품을 멈출 때까지 슬라이드를 급속 동결합니다.아미노 블로팅을 진행하려면 즉시 날카로운 포인트나 모서리를 사용하여 커버 슬립을 제거하십시오. 이상적이지는 않지만 얼어붙은 슬라이드는 섭씨 영하 80도에서 즉시 보존할 수 있으며 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. 나중에 커버 슬립을 제거하려면 슬라이드를 액체 질소에 15초 동안 담그고 커버 슬립을 들어 올립니다.아미노 라벨링을 진행하려면 50ml Coplin 용기를 사용하여 세탁당 5분 동안 PBS에서 슬라이드를 세 번 세척합니다. 세척 후 각 슬라이드에 1ml의 항체 희석 완충액을 도포하여 블록 역할을 합니다. 가습 챔버에서 블록 반응이 1-2시간 동안 실행되도록 합니다.이 절차를 수행하는 동안 슬라이드가 마르지 않도록 하십시오. 그런 다음 슬라이드를 종이 타월에 두드려 버퍼를 부드럽게 제거하고 가습실로 되돌립니다. 그런 다음 각 슬라이드에 100마이크로리터의 희석된 1차 항체를 적용하고 결합 반응이 하룻밤 동안 실행될 수 있는 섭씨 40도로 옮깁니다.항체 용액이 프리미엄인 경우, 커버 슬립 또는 파라필름으로 덮여 있으면 부피의 절반을 사용할 수 있습니다. 다음 날, PBS를 세 번 세척하여 1차 항체를 제거합니다. 다음으로, 희석된 2차 항체 100마이크로리터를 적용하고 이 반응을 실온에서 1시간에서 1시간 30분 동안 방치합니다.광표백을 피하려면 이 배양 동안 슬라이드를 어두운 가습 챔버에 보관하십시오. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 두 번 씻습니다. 이제 DAPI가 포함된 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 점을 찍습니다.그런 다음 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하고 이미징을 진행합니다. 이미지를 촬영하려면 정밀한 z축 이동을 가능하게 하는 자동화된 스테이지가 있는 에피형광 현미경을 사용하십시오. 또한 고해상도 카메라를 사용하여 이미지를 캡처하십시오.이제 20x 목표를 사용하여 슬라이드를 평가합니다. 스쿼시 준비의 품질을 결정합니다. 좋은 품질의 호박은 고르게 분포된 핵의 단층을 가지고 있습니다.스쿼시의 일부 지역은 다른 지역보다 더 나을 수 있습니다. 더 높은 배율에서 쉽게 찾을 수 있도록 최상의 영역의 좌표를 기록해 두십시오. 이제 배율을 최대 100배까지 높일 수 있습니다.그런 다음 일관된 핵 단층이 있는 언급된 영역에서 이미지를 캡처합니다. 위쪽 및 아래쪽 z 스택을 설정하여 초점이 맞는 모든 조명이 캡처되도록 합니다. 최적의 z-스택 수는 일반적으로 이미지 획득 소프트웨어에 의해 지정되며 각 목표에 따라 다릅니다.이미지에서 처리 소프트웨어를 사용하여 확장된 깊이 이미지를 컴파일합니다. 이 소프트웨어는 각 z-stack의 초점이 맞는 빛을 결합하며, 이는 세뇨관 스쿼시 제제의 최적 이미징에 필수적입니다. 설명된 세뇨관 스쿼시 방법을 사용하여 전단계(prophase)에서 중기 1(metaphase one)로의 전이를 겪는 일시적 세포 집단을 시각화했습니다.metaphase one 정세포의 풍부한 집단은 알파 튜불린에 대한 항체를 사용하여 시각화되었습니다. prophase one의 세포를 시각화하기 위해 세뇨관 스쿼시 제제는 Synaptonemal Complex Protein 3에 대한 항체로 면역 표지되었습니다. 렙토텐(Leptotene), 접합자(zygotene) 및 파키텐 디플로텐(pachytene diplotene) 병기 정모세포가 모두 확인되었습니다.세포주기 키나아제 오로라 B(Aurora B)에 대한 항체를 사용하여 감수분열 1의 이후 이벤트를 시각화했습니다. 이 키나아제는 중기 동안 내부 중심체에 국한된 다음 아나페이즈 동안 방추체 중간 영역으로 재국소화하고, 마지막으로 사이토키네시스 동안 분열 고랑으로 재국소화됩니다. 세포 무결성을 유지함으로써 세뇨관 스쿼시 기법은 1단계와 관련된 구조에서 세포 내 조직을 시각화할 수 있습니다.염색체 꽃다발 역학은 prophase one을 통해 추적할 수 있습니다. 중심솜 분리(centrosome disjunction)의 중심소체 중복(centriole duplication)도 시각화할 수 있습니다. 초기 디플로텐 단계에서 중심소체 복제 후 중심체 분리를 겪는 정모세포를 중심주위 기질의 단백질 구성 요소인 페리센트린에 대한 항체와 중심소체를 표시하는 센트린-3에 대한 항체로 시각화했습니다.이 동영상을 시청한 후에는 세포 무결성을 유지하면서 발달 중인 마우스 정세포의 세포학적 특징을 신속하게 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 스쿼시를 통한 해부는 마우스 한 마리당 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정액 세뇨관에서 정자 세포를 분산시킬 수 있는 충분한 힘을 가해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.또한, Fixative 농도 및 배양 시간은 연구할 세포 구조에 따라 최적화될 수 있습니다. DNA 및 RNA 물고기 접근법과 같은 대체 시각화 전략은 이 기술을 사용하여 쉽게 구현할 수 있습니다. 세뇨관 스쿼시를 다운스트림 생화학적 분석법으로 보완함으로써 성공적인 감수분열 진행의 기계론적 결정 요인을 평가할 수 있습니다.

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

배아 세포 이식과 testis 조직 xenografting을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 배아 세포 이식받는 testes의 기증자 파생 spermatogenesis의 결과와 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs)의 식별을위한 기능성 reconstitution 분석을 나타냅니다. xenografting Testis 조직이받는 생쥐에서 다양한 공여 종의 testis 개발과 spermatogenesis를 재현한.

배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting

이 비디오는 고환의 구성 요소인 쥐 정세관에서 Sertoli 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 효소 분해 및 반복 세척은 Sertoli 세포가 용액으로 방출되는 것을 촉진하며, 이는 증식 및 성장을 위해 추가로 배양될 수 있습니다.

Isolation of Immune Regulatory Sertoli Cells from Mouse Seminiferous tubbules (쥐 정액 세뇨관에서 면역 조절 세르톨리 세포(Immune Regulatory Sertoli Cells) 분리

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.

후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

이 프로토콜은 반열성 상피 주기의 특정 단계를 나타내는 성인 마우스 반열혈구의 세그먼트의 과균 보조 미세 절부, 그리고 그 안에 있는 세포 모형, 그리고 스쿼시 제제 및 그대로 관 세그먼트의 후속 면역 염색을 설명합니다.

다운스트림 면역 염색 분석을 위한 마우스 반전상피 주기의 특정 단계의 경유-보조 해부

이 기사는 남성 감수 분열에 대한 귀중한 모델인 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통한 CENP-E의 생체 내 억제를 보고합니다. 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 CENP-E 억제가 마우스 정자세포에서 염색체 정렬 불량 및 게놈 불안정성을 초래한다는 것을 보여줍니다.

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

여기에서는 마우스에서 ROSI(round spermatid injection)를 수행하는 방법, 유망한 임상 응용 기술을 가진 기술이며 배아 발달의 기전을 조사하기 위한 유용성을 소개합니다.

마우스 라운드 Spermatid 주입

학습하세요 생정소관 스쿼시 기술을 이용한 마우스 정자형성 과정의 세포학적 분석 방법을. 이 기술은 감수분열 중인 정자세포를 관찰하고 남성 생식 생물학의 이해를 높이는 데 활용됩니다.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

더 많은 동영상 탐색