Name: 기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 배우세요 C57BL/6 쥐에서 실험 자가 면역 신경 염을 유도하는 방법을 통해 말초 신경 병증의 기능적 및 병리학적 분석을 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 새로운 치료제 효능 연구에 활용됩니다.

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DGG은 NHMRC 피터도 허 티와 다 발성 경화 증 연구 호주 (MSRA) 초기 경력 연구원입니다. JLF는 MSRA 박사 친교에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 호주 국민 건강에 의해 지원 되었다 고 의료 연구 위원회 (NHMRC) 프로젝트 JX를 #APP1058647을 부여 합니다.

여기에서 설명한 모든 절차 Florey 연구소 신경 과학 및 정신 건강 (멜버른 두뇌 센터) 동물 윤리 위원회 승인 했다 고 과학에 대 한 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습을 따라 목적.
 1. EAN 유도 참고: EAN 남성 C57BL/6 쥐 세 6-8 주 사이에서 성공적으로 유도 될 수 있다. 유도 프로토콜 총에서 9 일이 걸린다. 0 첫 번째 면역의 날을 말합니다. 이 프로토콜에 대 한 주사 마 취 실시 했다 (단계 1.1.2 아래 참조).
<ol><li>일에-1: <ol><li>백 일 해 독 소를 준비 (재료의 표 참조) 솔루션의 1.6 µ g/mL의 멸 균 0.1 m M 마우스 isotonic 인산 염을 사용 하 여 식 염 수 (MT-PBS) 버퍼링.</li>
		<li>Isoflurane와 anesthetization: <ol><li>anesthetization 챔버에 마우스 (C57BL/6, 남성, 6-8 주)를 놓고 1 L/분에 산소 흐름을 조정</li>
			<li>Isoflurane 기화 기 설정, anesthetization, 및 호흡 하는 모니터에 대 한 2.5%로 조정 하 고 대기 2 분, 또는 때까지 기본 반사 (각 막 및 뒷 다리)는 더 이상 반응</li></ol>
		</li> <li>Anesthetization 상공에서 마우스를 제거 하 고 0.5 mL 주사기를 사용 하 여 30 1/2 G 바늘으로 복 (i.p.) 주사를 통해 위의 백 일 해 독 소 솔루션의 250 µ L 관리.</li>
		<li>면역 주사 inoculum 준비: <ol><li>P0 180-199 펩 티 드의 2 mg/mL 해결책을 사용 하 여 준비 솔루션 (와 함께 &#62; 98% 순도, 시퀀스 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) 0.9% 염 분에서.</li>
			<li>준비 솔루션 B 결핵균의 20 mg/mL 해결책을 사용 하 여 참조 테이블의 재료 Freund에 &#39; s 완전 한 보조 (FCA, 구성: 15% mannide monoolate + 파라핀 오일 0.5 mg/mL의 85% desiccated 살해와 말린 M 진 균 butyricum)의.</li>
			<li>주입, 최종 inoculum을 비드 때리는에 해결책 A와 B의 동일 볼륨 부분을 결합 하 고 실내 온도에서 1 분 동안 최대 속도로 혼합. 
			참고: 솔루션 A와 B 재고 유지 및 수 최대 한 달에 4 ° C에서 저장 된 있지만 결합 된 최종 inoculum 갓 마우스 주입의 일에 대비해 야 합니다.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Inoculum (준비 단계 1.1.4에서에서 설명)의 50 µ L를 관리 하는 일에 0, 23 G 바늘을 사용 하 여 피하 주사를 통해 마우스에. 
	참고: 주사 수 수 위에 양 어깨 사이 또는 뒷 다리와 꼬리 사이 꼬리 등.</li>
	<li>하루 1에 1.2 µ g/mL의 백 일 해 독 소 솔루션 (MT-PBS)에서 만들고 i.p. 주입 30 1/2 G 바늘으로 0.5 mL 주사기를 사용 하 여 통해 마우스에 250 µ L 관리.</li>
	<li>에 3 일, 반복 단계 위의 1.3. 
	참고: 재고 솔루션 A와 B 구성 고 1 달 최대 4 ˚C에 저장 될 수 있습니다. 그러나, A와 B, 재고 솔루션을 결합 하 여 생산 최종 주사 inoculum 주사의 일에 이루어져야 합니다.</li>
	<li>8 일에 관리 inoculum (준비 단계 1.1.4에서에서 설명)의 50 µ L 피하 주사를 통해 마우스에 (단계 위의 1.2 참조), (각 동물)에 대 한 1.2 단계 에서처럼 동일한 사출 사이트</li></ol>
 2. 임상 점수 <ol><li>하루 0에 시작 하는 매일 밖으로 임상 점수 수행.</li>
	<li>각 마우스의 0, 1, 2, 3, 또는 4 4 게시 된 기준 따라 점수를 제공합니다. EAN 임상 점수 표 1을 참조 하십시오. 
	참고: 일관성을 위해 노력 하 여야 한다 동시에 쥐를 매일 같은 연구원에 의해.</li>
</ol> 3. 기능 평가 모터 참고: 동물의 동일한 코 호트에 대 한 임상 점수와 병렬로 모터 성능 평가. 모터 기능 평가 기구는 걸음 걸이 기능 이미징 시스템 (재료의 표 참조) 설치 되어 있는지 컴퓨터에 연결 되어야 합니다. 또한 평가 될 모든 쥐를 EAN 유도 전에 실행 중인 작업 익숙해져 한다는 것이 좋습니다. 이렇게 하려면 연습 실행 (마우스 당 2 테스트 실행) 3 일전 질병 유도 (하루-3) 수행 됩니다.
<ol><li>모터 기능 평가 장치 및 조명 버튼 스위치 설정.</li>
	<li>아저씨 마우스 단단히 고 꼬리를 잡고 빨간 잉크 가득 컨테이너에 그것을 낮추는 방법으로 발 잉크. 
	참고:이 단계는 C57BL/6 스트레인에 대 한 필요 하지만 마우스 스트레인 흰색 코트 색상으로 사용 하는 경우 건너뛸 수 있습니다.</li>
	<li>걷는 구획에 마우스 고 15 cm에서 디딜 방 아의 속도 설정/미</li>
	<li>디딜 방 아와 클릭은 &#34; 기록 &#34; 이미징 시스템 걸음 걸이 기능을 사용 하 여 마우스의 실행 모션 캡처 버튼 (재료의 표 참조).</li>
	<li>타이머를 사용 하 고 36 각 실행 측정 s. 36 s, 정지 녹음 및 중지 디딜 방 아 후. 
	참고: 성공적으로이 36 s 간격에 실행 중인 작업을 완료할 수 없는 쥐 실패 한 것으로 간주 됩니다.</li>
	<li>지정 된 폴더에 비디오 파일을 저장.</li>
	<li>평가를 각 마우스에 대 한 위의 단계를 반복 합니다. 3 일 마다 같은 실행 작업 마우스 테스트.</li>
	<li>걸음 걸이 함수 매개 변수 (자료의 표 참조)에 대 한 소프트웨어를 사용 하 여 편집 된 비디오 파일을 분석. 
	참고: 다른 모터 매개 변수를 분석 하는 방법의 세부 사항을 다 소프트웨어 사이 그렇게 제조 업체를 참조 하십시오 &#39; 분석 전에 s 지시. Axonal의 조직학 증거를 얻기 위해 immunohistochemistry 또는 전자 현미경 검사 법, 동물 조직 어떤 단계 게시물 모터 기능 평가 특정 목표에 따라 연구에 반입할 수 있습니다 통해 수 초 손상.</li>
</ol>

<ol><li>Newswanger, D. L., Warren, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).</li>
<li>Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+Guillain-Barre+syndrome+mortality+in+Spain+from+1999+to+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013.</a> Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).</li>
<li>Walling, A. D., Dickson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).</li>
<li>Gonsalvez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+and+Neuropathological+Testing+Paradigm+Reveals+New+Disability-Based+Parameters+and+Histological+Features+for+P0180-199-Induced+Experimental+Autoimmune+Neuritis+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).</li>
<li>Berg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%3A+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+treatment+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis.</a> Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).</li>
<li>Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy--update+on+pathogenesis%2C+diagnostic+criteria+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy.</a> Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).</li>
<li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+the+motor-sensory+axonal+Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome.</a> Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).</li>
<li>Taylor, W. A., Hughes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+neuritis+induced+in+SJL+mice+by+bovine+P2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2.</a> J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).</li>
<li>Zou, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0+protein+peptide+180-199+together+with+pertussis+toxin+induces+experimental+autoimmune+neuritis+in+resistant+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice.</a> J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).</li>
<li>Miletic, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0%28106-125%29+is+a+neuritogenic+epitope+of+the+peripheral+myelin+protein+P0+and+induces+autoimmune+neuritis+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).</li>
<li>Hafer-Macko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+motor+axonal+neuropathy%3A+an+antibody-mediated+attack+on+axolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma.</a> Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).</li>
<li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+nodal+changes+in+the+acute+motor+axonal+neuropathy+pattern+of+the+Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome.</a> J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).</li>
</ol>

저자는이 작품에 대 한 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 보고서는 EAN C57BL/6 마우스에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여, EAN으로 유도 된 쥐에 있는 주요 neuropathological 및 기능적인 적자의 정량화를 활성화를 유도 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 EAN 유도 프로토콜에 고유한 면역 주사를 수행 하는 동안 마 취를 사용 하 여가입니다. Isoflurane 마 취의 사용은 크게 inoculum의 총 볼륨 최소한의 오류 및 스트레스 동물을 원하는 위치에 피하 주입 되도록 기능을 향상 시킵니다.
마우스 6 dpi4 EAN 유도의이 방법을 사용 하 여 질병의 임상 증상을 표시 하기 시작 합니다. 그러나, 임상 평가 점수에 의해 측정 된 질병 발병 이전 ~ 10 dpi9,10에서 발생할 수 보고 되었습니다. 질병 발병 임상...

주변 neuropathies 일 수 있다 근원에서 유전 인수, 인수 neuropathies 있는 어느 대사, ischaemic, 염증, 또는 독성 침. 이 질병도 유용 하 게 axonal 또는 근원에서 demyelinative로 분류 됩니다. 가장 일반적인 주변 neuropathies는 급성 염증 성 Demyelinating 증 (AIDP, Guillain-바레 증후군, GBS 라고도) demyelinating 인수 및 만성 염증 Demyelinating 증 (CIDP)1, 2 , 3 , 4. 둘 다 pathogenetically의 주변 신경 demyelination 일으키는 myelin 칼 집에 대 한 지시 자가 면역 반응에 의해 특징 이다. 이 질병에서 활성화 된 T 세포 혈액 신경 방 벽을 교차 하 고 PNS 내 면역 반응을 생성. 다음은 신경 내에서 대 식 세포의 활성화 demyelination phagocytic 공격을 통해 직접 또는 간접적으로 통해 분 비 염증 성 중재자, 마비 및 감각 부전5등 임상 장애의 결과로 발생 합니다. Demyelinated 축 삭 demyelination 다음 remyelinated 수 있는 능력을 유지 하는 동안 remyelination 자주 지연 또는 불완전, 돌이킬 수 없는 손상을, 벌 거 벗은 axons의 민감성에 따른 임상 영구의 주요 원인 장애입니다. 현재 가장 효과적인 치료는 immunomodulatory, 하지만 그들의 효 험에도 불구 하 고 많은 경우에는 복구는 종종 느린 고 25% 환자 크게 줄일 그들의 삶의 질6, 잔여 기능적인 적자를 경험할 것 이다 7.
EAN demyelinating pathogenesis 및 비 발한 치료 대리인4를 평가 하는 수단으로 귀중 한 통찰력을 제공 하고있다 주변 신경 병의 널리 사용 되는 동물 모델 이다. 이 모델은 토끼, 다른 종에서 유도 될 수 있다 쥐, 쥐 및 기니 피그와 neurogenic 항 원 가진 면역에 의해 유발 됩니다. 그러나, 궁극적으로 성공적인 EAN 유도 발생 하는 질병에 대 한 적절 한 면역 반응에 따라 다릅니다. 면역 기능에 종 (및 남북 species/스트레인) 변화를 감안할 때, 항 원 및 adjuvants의 여러 조합은 성공적으로 EAN을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. Murine 유전 도구 점에서 C57BL/6은 가장 널리 사용 되 고; 그러나, 전통적인 P2 단백질 펩타이드 57-81 (P257-81) 취약 SJL 마우스 스트레인8 질병에서 발생 하는 불법 pathogenesis C57BL/6 스트레인에 기능적인 적자를 선도를 수 없습니다. 보조 결합에 민감 화 패러다임 P0106-125 또는 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 전달 하는 다행히도, 백 일 해 주사와 함께 독 소 정교한 유전자 도구에 활용 될 수 있도록이 장애물을 극복할 수 있는 murine EAN 모델입니다.
여기, C57BL/6 쥐에 EAN의 감 응 작용을 위한 간단한 방법을 제시 합니다. 또한, 질병과 관련 된 기능 및 neuropathological 적자를 평가 하는 포괄적인 상세한 접근 제공 됩니다. P0180-199 펩 티 드9 P057-81 대체10우선 선정 되었다. P0180-199 모델 생산 P057-81 대체10에 비해 덜 심각한 임상 증상을 설명 및의 소개를 잠재적으로 견딜 것 이므로 해로운 유전자 섭, (와 같은 삼 투 펌프 이식) 수술에서 회복 이며 의무가 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트4. 그러나, 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트 및 여기서 설명 하는 조직학 프로토콜 수 쉽게 적용할 P057-81 유발 변종에 질병을 공부 하는 때.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6, 수컷, 6-8주 된</td><td>Australian Bioresources Cenre, WA, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pertussis toxin</td><td>List Biological Laboratories, Inc., CA, USA#</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 마우스 등장성 인산염 완충 식염수(MT-PBS)</td><td></td><td></td><td>실험실에는 자체 프로토콜이 있습니다.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pharmachem, QLD, Australia</td><td></td><td>Laboratories는 투여를 위한 자체 프로토콜을 가지고 있습니다.</td></tr><tr><td>P0180&ndash; 199 펩타이드</td><td>Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN</td><td></td><td>P0180&ndash; 199, 시퀀스 S&ndash; S&ndash; K&ndash; R&ndash; 지앤대시; R&ndash; Q&ndash; T&ndash; P&ndash; V&ndash; L&ndash; Y&ndash; A&ndash; M&ndash; L&ndash; D&ndash; H&ndash; S&ndash; R&ndash; S</td></tr><tr><td>Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)</td><td>Difco, MI, USA</td><td>#231141</td><td></td></tr><tr><td>Freund's complete adjuvant (FCA)</td><td>Difco, MI, USA#</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>#15710</td><td>조직 채취의 날을 4% PFA로 희석합니다.</td></tr><tr><td>25% 글루타랄데이드</td><td>ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia</td><td>#11-30-8</td><td>2.5% 글루타르알데히드로 묽게 고정합니다.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td><td>SL189</td><td>0.1M MT-PBS에 10%(w/v) 주식을 생성합니다. 0.03%(v/v)에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td><td>SA030</td><td>30%(w/v)에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>최적 절단 온도(OCT) 매체</td><td>Sakura Finetek, CA, USA#</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>Merck Millipore, MA, USA</td><td>#S30-100</td><td>자체 실험실에서 결정한 10%(v/v) 또는 기타 농도의 항체 희석제로 사용합니다.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma Aldrich, MI, USA</td><td>#90o2-31-1</td><td>0.3%(v/v) 또는 자체 실험실에서 결정한 기타 농도의 항체 희석제에 사용합니다.</td></tr><tr><td>rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)</td><td>Invitrogen (Life Technologies), CA, USA</td><td>S12700</td><td>자체 실험실에서 1:400 또는 적정에 사용.</td></tr><tr><td>토끼 안티 콘택트In-associated protein-1 (Caspr)</td>이스라엘 <td>Wiezmann Institute of Science의 Elior Peles 교수로부터의 선물</td><td>1:500 또는 자신의 실험실에서 적정액으로 사용됩니다.</td><td></td></tr><tr><td>적절한 Alexa Fluor 접합 2 차 항체</td><td>Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA</td><td>1</td><td>:200에서 다양하게 사용하거나 자체 실험실에서 적정합니다. 항체가 형성된 종과 Alexa Fluor의 선택은 각 실험실의 재량에 따라 결정됩니다.</td></tr><tr><td>수성 마운팅 솔루션</td><td>Dako (Agilent), CA, USA</td><td></td>#S3023 <td>각 실험실은 자체 선호도가 있습니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 주사기, 301/2 g 바늘</td><td>BD#</td><td>326105</td><td></td></tr><tr><td>23g 바늘</td><td>BD#</td><td>305143</td><td></td></tr><tr><td>빨간 잉크 패드</td><td></td><td></td><td>빨간 잉크 패드나 빨간 식용 염료를 사용하여 동물의 발을 표시할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DigiGate 장치(트레드밀 포함)</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DigiGate 이미징 시스템</td><td>eMouse Specifics Inc. 프레이밍햄, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스톱워치</td><td></td><td></td><td>모든 타이머를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DigiGait 8 Software</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>적절한 해부 현미경을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>충전된 슬라이드</td><td>Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd</td><td>SF41296SP</td><td></td></tr><tr><td>Cyrostat</td><td>Leica</td><td></td><td>적절한 cyrostat를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>관류 장비 및 해부 기구</td><td></td><td></td><td>실험실에는 자체 관류 프로토콜이 있습니다.</td></tr><tr><td>불투명 부식 챔버</td><td></td><td></td><td>실험실은 불투명 플라스틱 용기를 사용하여 자체 생산할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PAP pene</td><td>GeneTex (USA)</td><td></td><td>왁스 연필 또는 표면 장력을 사용하여 조직 섹션 주위에 웰을 만들 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeis LSM780</td><td></td><td>적절한 레이저 라인이 있는 모든 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>FIJI/Image J</td><td>National Institues of Health</td><td></td><td>from www.fiji.sc</td></tr></tbody></table>

기능과 neuropathological 평가 대 한 c57bl/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

실험적인 자기 면역 신경 염 (EAN) 자기 면역 주변 demyelinating 질병의 잘 평가 실험 모델 이다. EAN 질환 말 초 신 경계 (PNS)의 구성 요소에 대 한 선 동적인 공격을 직접 neurogenic 펩 티 드와 마우스를 면역에 의해 유발 됩니다. 최근 발전은 myelin 단백질 제로 (P0)106-125 또는 P0180-199 펩 티 드 백 일 해 독 소의 주사 함께 보조 제공을 사용 하 여 상대적으로 내성 C57BL/6 마우스 라인에서 EAN의 유도 활성화 했습니다. C57BL/6 스트레인에 EAN을 유도 하는 능력이 마우스 배경에 존재 하는 수많은 유전 도구 사용에 대 한 허용 하 고 따라서 질병 병의 정교한 연구 및 심문에 새로운 치료제의 기계 작업의 수 유전자 변형 접근 조합입니다. 이 연구에서는 EAN C57BL/6 쥐에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 성공적으로 유도 하는 간단한 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 neuropathological 기능의 배열과 함께,이 모델에서 발생 하는 기능적인 적자의 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 따라서,이 모델은 인간의 주변 demyelinating neuropathies의 병 인을 공부 하 고 myelin 복구를 촉진 하 고 면역에 신경 손상 으로부터 보호 하는 것을 목표로 하는 잠재적인 치료의 효능을 결정 하는 강력한 실험 모델 신경 염입니다.

P0180-199 펩 티 드에서 monophasic 질병 임상 점수 C57BL/6 마우스 리드 EAN 유도 첫 예방접종 (dpi), 그리고 최대한 점수 심각도 25에서 관찰은 6 일 게시물에서 발병 뒤 일부 임상 점수 40에서 개선 기간 (그림 1)4,9. 걸음 걸이 기능 측면에서 마우스 빠르면 6 dpi, 간단한 실행 중인 작업에 실패 35 dpi 마우스에 의해 간단한 디딜 방 아 실행 하는 작업을 완료 하는 데 작은 용량을가지고 시작 하 고 55 dpi4 (그림 1) 에서도 능력을 실행에 개선 하지 않으면. 마우스는 EAN 점차적으로 시간이 지남에 실행 작업을 수행 하는 기능에 거부를 유도 한다....

이 보고서는 성공적으로 유도 실험 자가 면역 신경 염 (EAN) myelin 단백질을 사용 하 여 0 (P0)180-199 펩타이드 Freund의 완전 한 보조 및 백 일 해 독 소와 함께 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 정확 하 게 기능적인 적자와이 상품에서 발생 하는 neuropathology의 정도 평가 정교한 패러다임 제시.

기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

이 절차의 전반적인 목표는 질병 진행의 기능적 및 병리학적 분석을 위해 마우스 모델에서 실험적 자가면역 신경염 또는 EAN을 성공적으로 유도하는 것입니다. EAN 모델은 말초 신경병증과 관련된 주요 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 새로운 치료제의 효능을 잠재적으로 조사할 수 있는 훌륭한 모델이기도 합니다.이 접근 방식의 주요 장점은 마우스에서 EAN 모델을 사용할 때 적용할 수 있는 간단하고 객관적인 기능 테스트 패러다임을 제공한다는 것입니다. 오늘 저와 함께 시연을 해주신 분은 멜버른 대학교(University of Melbourne)의 신경영양호르몬 및 미엘린 생물학 연구실의 학부생인 유이상원(Sang Won Yoo) 교수님입니다. 질병 유도 3일 전에 운동 기능 평가 장치를 켜고 조명 버튼을 켭니다.마우스를 들어 빨간 식용 염료 용기 위에 내립니다. 마우스를 보행실에 넣고 트레드밀 속도를 초당 15cm로 설정합니다. 트레드밀을 켜고 기록을 클릭하여 보행 기능 이미징 시스템을 사용하여 36초 동안 마우스의 달리기 동작을 캡처합니다.36초 후 녹화와 러닝머신을 중지하고 연습 런 비디오 파일을 지정된 폴더에 연습 런 비디오 파일에 저장합니다. 첫 번째 면역 접종 하루 전, 30-1/2 게이지 바늘이 장착된 0.5ml 주사기를 사용하여 6주에서 8주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 마취시킨 마우스 등장성 PBS IP 250마이크로리터에 1밀리리터당 1.6마이크로그램의 백일해 독소를 투여합니다. 그런 다음 표에 따라 0에서 4까지의 척도로 EAN의 임상 징후에 대해 마우스를 점수화하고 방금 설명한 대로 운동 기능 평가를 수행합니다.다음 날, 갓 준비한 펩타이드 용액 0.9%와 Mycobacterium tuberculosis 밀리리터당 20mg을 동일한 부피의 용매 혼합물에 완전한 Freund's adjuvant에 비드 비더로 넣고 용액을 실온에서 1분 동안 최대 속도로 혼합합니다. 23게이지 바늘이 장착된 주사기에 접종물을 장전하고 주사기 샤프트 내의 공기를 배출하기 전에 주사기를 뒤집고 흔듭니다. 접종을 하기 전에 견갑골 사이의 정중선 바로 옆쪽에 있는 모발을 제거하고 노출된 피부를 70% 에탄올로 소독합니다.그런 다음 한 쌍의 Adson 집게를 사용하여 피부를 잡고 피하 주사를 통해 백일해 독소를 주입한 마우스에 50마이크로리터의 용액을 전달합니다. 다음 날 아침, 방금 시연한 바와 같이 250마이크로리터의 PBS IP에 1밀리리터당 1.2마이크로그램의 백일해 독소를 투여한 후, 48시간 후에 밀리리터당 1.2마이크로그램의 백일해 독소 IP를 추가로 주입합니다. 세 번째 백일해 주사 후 3일 후, 이전과 동일한 주사 부위에 새로 준비한 접종물 50마이크로리터를 더 투여하고 실험이 끝날 때까지 일주일에 두 번 동물의 임상 점수와 운동 기능을 모니터링합니다.C57BL/6 마우스에서 P0 180-199 펩타이드 유도 EAN은 첫 번째 면역 후 6일부터 임상 점수가 시작되고 첫 번째 면역 후 25일째에 최대 점수 중증도가 나타나는 단상 질환을 유발하며, 첫 번째 면역 후 40일째에 약간의 임상 점수 개선이 뒤따릅니다. 생쥐는 첫 번째 예방 접종 후 6일 이내에 간단한 달리기 작업에 실패하기 시작하며, 예방 접종 후 35일까지 간단한 러닝머신 달리기 작업을 완료할 수 있는 능력이 거의 없으며 첫 번째 예방 접종 후 55일이 지나도 달리기 능력이 향상되지 않습니다. 펩타이드 유도 EAN 마우스의 좌골 신경의 반박막 부분을 검사한 결과, 연령에 맞는 건강한 대조군의 좌골 신경과 비교하여 탈수초 영역이 드러났습니다.고출력 투과 전자 현미경 이미지를 통해 탈수초화, 미엘린 층상 손상, 미토콘드리아 팽창과 같은 축삭 스트레스 징후와 같은 특정 신경 병리학적 특징을 식별할 수 있습니다. 이 동물들은 또한 나이에 맞는 건강한 대조군 조직에서는 관찰되지 않는 좌골 신경에서 외상으로 상승된 베타-아밀로이드 전구체 단백질 발현에 의해 입증된 급성 축삭 손상을 나타냅니다. 노드의 확장과 파라노드의 중단도 관찰됩니다.일단 숙달되면, 피하 주사는 마우스 한 마리당 약 5분에서 10분 이내에 시행될 수 있으며, 주입 오류가 발생할 가능성을 최소화할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 주사 부위를 관찰하여 모든 접종물이 주사 부위 내에 남아 있고 누출되지 않는지 확인하는 것이 정말 중요합니다. 트레드밀 보행의 비디오 캡처는 스윙 단계 또는 보폭과 같은 다른 매개변수를 계산할 수 있기 때문에 훌륭하며, 이러한 측정은 새로운 치료법의 효능을 테스트할 때 중요해질 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 C57BL/6 수컷 마우스에서 EAN을 유도하는 방법을 정말 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 피하 주사를 안전하고 정확하게 주사하는 방법을 잘 이해하고 주입 오류가 없는지 확인해야 합니다. 바늘과 접종물로 작업할 때 특히 날카로운 도구를 사용할 때 부상의 위험이 있다는 것을 잊지 마십시오.따라서 부상의 가능성을 피하기 위해 항상 집게를 사용하고 피부나 조직을 손으로 잡지 말고 일회용 주사기를 사용하는 것이 좋습니다.

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연구

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Neuroscience

신경과학

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

이 비디오는 백일해 독소와 미엘린 모방 펩타이드 및 보조제를 함유한 접종을 통해 마우스 모델의 운동 기능 장애를 평가한 후 운동 기능을 평가하고 면역 활성화 및 탈수초화로 인한 신경 손상을 평가하기 위한 트레드밀 테스트를 수행하는 과정을 보여줍니다.

실험적 자가면역 신경염 마우스 모델에서 운동 기능 평가

신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가)의 이식은 재생 신경의 큰 약속을 보유하고 있습니다. 의 NPC의 전신 배달은 뇌와 중추 신경계의 실험 만성 염증성 손상에 의해 영향을 설치류 및 영장류의 척수에 줄기 세포를 제공하는 효과적인 침략 낮은 및 치료 매우 효과적인 프로토콜로 설정되어 있습니다.

만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

이 프로토콜은 실험적 자가면역 뇌척수염에 대한 약물 치료가 면역 세포 침투를 억제한 결과로 중추신경계 보호를 보여주는지 또는 면역 세포 침투의 맹공격 동안 신경 보호를 보여주는지 확인하는 방법을 설명합니다.

자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

우리는 생체 살아있는 생물 발광 및 근적외선 SJL / J 마우스에서 다발성 경화증에 대한 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시신경염과 뇌염의 이미징 기술을 보여준다.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.

실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법

배우세요 C57BL/6 쥐에서 실험 자가 면역 신경 염을 유도하는 방법을 통해 말초 신경 병증의 기능적 및 병리학적 분석을 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 새로운 치료제 효능 연구에 활용됩니다.

기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

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