기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 질병 진행의 기능적 및 병리학적 분석을 위해 마우스 모델에서 실험적 자가면역 신경염 또는 EAN을 성공적으로 유도하는 것입니다. EAN 모델은 말초 신경병증과 관련된 주요 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 새로운 치료제의 효능을 잠재적으로 조사할 수 있는 훌륭한 모델이기도 합니다.

이 접근 방식의 주요 장점은 마우스에서 EAN 모델을 사용할 때 적용할 수 있는 간단하고 객관적인 기능 테스트 패러다임을 제공한다는 것입니다. 오늘 저와 함께 시연을 해주신 분은 멜버른 대학교(University of Melbourne)의 신경영양호르몬 및 미엘린 생물학 연구실의 학부생인 유이상원(Sang Won Yoo) 교수님입니다. 질병 유도 3일 전에 운동 기능 평가 장치를 켜고 조명 버튼을 켭니다.

마우스를 들어 빨간 식용 염료 용기 위에 내립니다. 마우스를 보행실에 넣고 트레드밀 속도를 초당 15cm로 설정합니다. 트레드밀을 켜고 기록을 클릭하여 보행 기능 이미징 시스템을 사용하여 36초 동안 마우스의 달리기 동작을 캡처합니다.

36초 후 녹화와 러닝머신을 중지하고 연습 런 비디오 파일을 지정된 폴더에 연습 런 비디오 파일에 저장합니다. 첫 번째 면역 접종 하루 전, 30-1/2 게이지 바늘이 장착된 0.5ml 주사기를 사용하여 6주에서 8주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 마취시킨 마우스 등장성 PBS IP 250마이크로리터에 1밀리리터당 1.6마이크로그램의 백일해 독소를 투여합니다. 그런 다음 표에 따라 0에서 4까지의 척도로 EAN의 임상 징후에 대해 마우스를 점수화하고 방금 설명한 대로 운동 기능 평가를 수행합니다.

다음 날, 갓 준비한 펩타이드 용액 0.9%와 Mycobacterium tuberculosis 밀리리터당 20mg을 동일한 부피의 용매 혼합물에 완전한 Freund's adjuvant에 비드 비더로 넣고 용액을 실온에서 1분 동안 최대 속도로 혼합합니다. 23게이지 바늘이 장착된 주사기에 접종물을 장전하고 주사기 샤프트 내의 공기를 배출하기 전에 주사기를 뒤집고 흔듭니다. 접종을 하기 전에 견갑골 사이의 정중선 바로 옆쪽에 있는 모발을 제거하고 노출된 피부를 70% 에탄올로 소독합니다.

그런 다음 한 쌍의 Adson 집게를 사용하여 피부를 잡고 피하 주사를 통해 백일해 독소를 주입한 마우스에 50마이크로리터의 용액을 전달합니다. 다음 날 아침, 방금 시연한 바와 같이 250마이크로리터의 PBS IP에 1밀리리터당 1.2마이크로그램의 백일해 독소를 투여한 후, 48시간 후에 밀리리터당 1.2마이크로그램의 백일해 독소 IP를 추가로 주입합니다. 세 번째 백일해 주사 후 3일 후, 이전과 동일한 주사 부위에 새로 준비한 접종물 50마이크로리터를 더 투여하고 실험이 끝날 때까지 일주일에 두 번 동물의 임상 점수와 운동 기능을 모니터링합니다.

C57BL/6 마우스에서 P0 180-199 펩타이드 유도 EAN은 첫 번째 면역 후 6일부터 임상 점수가 시작되고 첫 번째 면역 후 25일째에 최대 점수 중증도가 나타나는 단상 질환을 유발하며, 첫 번째 면역 후 40일째에 약간의 임상 점수 개선이 뒤따릅니다. 생쥐는 첫 번째 예방 접종 후 6일 이내에 간단한 달리기 작업에 실패하기 시작하며, 예방 접종 후 35일까지 간단한 러닝머신 달리기 작업을 완료할 수 있는 능력이 거의 없으며 첫 번째 예방 접종 후 55일이 지나도 달리기 능력이 향상되지 않습니다. 펩타이드 유도 EAN 마우스의 좌골 신경의 반박막 부분을 검사한 결과, 연령에 맞는 건강한 대조군의 좌골 신경과 비교하여 탈수초 영역이 드러났습니다.

고출력 투과 전자 현미경 이미지를 통해 탈수초화, 미엘린 층상 손상, 미토콘드리아 팽창과 같은 축삭 스트레스 징후와 같은 특정 신경 병리학적 특징을 식별할 수 있습니다. 이 동물들은 또한 나이에 맞는 건강한 대조군 조직에서는 관찰되지 않는 좌골 신경에서 외상으로 상승된 베타-아밀로이드 전구체 단백질 발현에 의해 입증된 급성 축삭 손상을 나타냅니다. 노드의 확장과 파라노드의 중단도 관찰됩니다.

일단 숙달되면, 피하 주사는 마우스 한 마리당 약 5분에서 10분 이내에 시행될 수 있으며, 주입 오류가 발생할 가능성을 최소화할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 주사 부위를 관찰하여 모든 접종물이 주사 부위 내에 남아 있고 누출되지 않는지 확인하는 것이 정말 중요합니다. 트레드밀 보행의 비디오 캡처는 스윙 단계 또는 보폭과 같은 다른 매개변수를 계산할 수 있기 때문에 훌륭하며, 이러한 측정은 새로운 치료법의 효능을 테스트할 때 중요해질 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 C57BL/6 수컷 마우스에서 EAN을 유도하는 방법을 정말 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 피하 주사를 안전하고 정확하게 주사하는 방법을 잘 이해하고 주입 오류가 없는지 확인해야 합니다. 바늘과 접종물로 작업할 때 특히 날카로운 도구를 사용할 때 부상의 위험이 있다는 것을 잊지 마십시오.

따라서 부상의 가능성을 피하기 위해 항상 집게를 사용하고 피부나 조직을 손으로 잡지 말고 일회용 주사기를 사용하는 것이 좋습니다.