Name: Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 배우세요 생체세포 내 단백질-단백질 상호작용을 바이오틴화 세포 관통 펩티드와 풀다운 분석으로 연구하는 방법을. G166 교모세포줄기세포에서 신호전달 경로를 탐색할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리가 그들의 자신의 풀 다운 프로토콜에 대 한 CPPs 및 제 아리 발로의 디자인에 대 한 M. 모 랄 레 스와 제이 브라 보 감사합니다. 우리는 토니 델 레이의 기술 지원에 대 한 감사입니다. 이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad, 스페인;에 의해 지원 되었다 페더 BFU2015-70040-R, 군부 de Castilla y León, 스페인; 페더 SA026U16와 Fundación 라몬 Areces입니다. M. Jaraíz-로드리게스와 A. 곤살레스-산체스는 군부 de Castilla y León에서에서 친목과 유럽 사회 기금 받는 사람.

모든 실험 절차 살라 망 카 대학에서 실행 되었다.
1입니다. 셀
<ol>
	<li>절차를 시작 하기 전에 2 일 실험의 하루 confluent 되도록 필요한 밀도에 세포 격판덮개. 플라스 크 또는 접시에 셀 접시 그러나, 단백질 추출 접시에서 쉬울 것입니다. 그것은 준비 하 78 c m2 의 4 접시 또는 2 플라스 크 실험, 당 조건 당 150 c m2 의 확실 하 게 일관 된 결과 편리 합니다.</li>
	<li>이 연구에서는 150 cm2, 2 %1 %N2, B27 20 ng/mL EGF와 b-FGF 폴라 드 외.22에 설명 된 대로 보충 RHB A 줄기 세포 매체에 경작의 4 플라스 크에 인간의 G166 GSCs 플레이트. 프로세스 합류에 도달 했다입니다. 예를 들어, 5 x 106 G166 셀 150 c m2 플라스 크에 도금 했다 때 그들은 도금 후에 2 일을 처리 했다.</li>
</ol>
2. Biotinylated CPPs
<ol>
	<li>8200 x g 30에 동결 건조 된 biotinylated CPPs (BCPPs)를 포함 하는 튜브를 회전을 뚜껑에 남은 가루 중 일부를 피하기 위해 s. 컨트롤 BCPP 상호 작용 발견 대상 시퀀스의 특정 확인을 포함 합니다. 이 연구에서는 컨트롤 BCPP 문신-비오 틴 (문신-B) 이었고 치료 BCPP 문신 Cx43266-283. 다른 컨트롤 biotin 문신 스크램블 또는 돌연변이 융합된 조각 본드 같은 사용 될 수 있습니다.</li>
	<li>재고 솔루션 제조 업체;로 표시에 해당 문화 매체에서 BCPPs를 분해 예를 들어, 2 mg/mL의 재고 솔루션을 얻기 위해 BCPP GSCs를 치료 하는 BCPP의 1mg을 포함 한 유리병에 GSC 문화 매체의 0.5 mL을 추가 합니다. 소용돌이 펩 티 드 잘 녹는 다는 것을 확인 하 고.</li>
</ol>
3입니다. 튜브
참고: 섹션 7에 필요 조건 당 적어도 12 1.5 mL 튜브 준비.
<ol>
	<li>조건 당 처음 3 튜브를 표시 합니다. 그들은 단계 6.4에서에서 얻은 세포 lysates의 총 볼륨을 있을 것 이다.</li>
	<li>조건 당 3 관에서 A를 표시 합니다. 이러한 튜브 lysing 및 세포 lysates 회전 단계 7.2 후 얻은 첫 번째 supernatants 있을 것 이다.</li>
	<li>조건 당 3 튜브에 B를 표시 합니다. 이러한 튜브는 첫 번째 supernatants의 작은 약 수가 있을 것 이다. 이러한 lysates 단계 7.3에서에서 서쪽 오 점 샘플 될 것입니다.</li>
	<li>표시 조건 당 3 관에서 C. 이러한 튜브는 NeutrAvidin, 단계 7.7와 풀 다운 후 얻은 supernatants 있을 것 이다. 참고: 이것이 중요 한 경우에 서쪽 오 점 보였다 단백질, 단백질 내려 오게 하지 했다 또는 절차의 어떤 단계에서 분실 된 의미에 대 한 신호. 만약이 상황이 라면, 풀 단백질 다운 프로세스를 반복 합니다.</li>
</ol>
4. 세포 치료는 BCPPs
<ol>
	<li>문화 매체 발음</li>
	<li>신선한 매체 품 어 부 화 시간에 따라 매체의 가장 작은 가능한 볼륨에 BCPPs 하는 데 필요한의 해당 볼륨을 교체 합니다. 그것은 매우 중요 한 그 어떤 경우에, 매체 커버 완전히 접시/플라스 크의 표면 전체를 셀 밖으로, 예를 들어, 6 mL 30 분 부 화에 대 한 150 c m2 당 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>효과가 입증 된 농도 도달 하는 세포 배양에 BCPP의 재고 솔루션의 볼륨을 추가 합니다. 이 연구 50 µ M 문신-Cx43266-283-B는 GSC 확산을 줄이기 위해 입증 되었다.
	<ol>
		<li>따라서, 문신-Cx43266-2832 mg/mL의 92.8 µ L를 추가-B (MW = 3723.34 g/mol) 50 µ M 문신-Cx43266-283의 최종 농도를 문화 매체의 mL 당. 추가 볼륨 컨트롤 펩 티 드에 대 한 다른 경우 동일한 최종 볼륨까지 배양 완료. 예를 들어, 49.1 µ L 문신 B (MW = 1914.31 g/mol) 43.7 µ L GSC 매체 플러스 50 µ M의 최종 농도를 문화 매체의 mL 당 추가 된 문신.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BCPP와 세포내 파트너 간의 상호 작용 일어난다 되도록 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 세포를 놓습니다. 상호 작용 오래 걸리면, 더 긴 시간 품 어 하거나 실험 한 시간 코스의 구성 하는 경우에 시간을 조정 합니다. 또한, 관심의 상호 작용 승진 수 있다 또는 자극 다른 세포내 신호 통로 의해 방해.</li>
</ol>
5. 버퍼 및 솔루션.
<ol>
	<li>PBS pH 7.4: 136 m m NaCl; 준비 2.7 m m KCl; 7.8 m m 나2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2포4.</li>
	<li>단백질 세포의 용 해 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1% 사용, IGEPAL, 사전에 다음 추가: 1/100 (v/v) 프로 테아 제 억제 물 칵테일, 1mm 나트륨 불 소, 1 m m Phenylmethanesulfonyl 불 소 (PMSF) 및 0.1 m m 나트륨 orthovanadate.</li>
	<li>Laemmli 버퍼 준비: (4 배: 0.18 M Tris HCl pH 6.8; 글리세롤 5 M; 3.7 %SDS (p/v), 0.6 M β-mercaptoethanol 또는 9 mM DTT; 0.04% (v/v) bromophenol 블루 (BB)).</li>
</ol>
6. 단백질 추출
참고: 앞에서 설명한20,23으로 단백질 추출 수행 되었다. 이 모든 섹션 4 ° c.에 절차의 수행
<ol>
	<li>문화 매체를 완전히 발음.</li>
	<li>워시 3 x 10 mL의 얼음 처럼 차가운 인산 염으로 세포 분리를 피하기 위해 매우 신중 하 게 염 분 (PBS) 150 c m2 당을 버퍼링 합니다.</li>
	<li>세포 lysate를, 세포의 용 해 버퍼 150 c m2 당 3 mL를 추가 하 고 철저 하 게 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 표면을 긁어. 약 45도 접시/플라스 크를 기울이기 쉽게 자신의 해당 튜브에 세포 lysates 수집 하.</li>
	<li>3 1.5 mL 튜브에 세포 lysate 관 당 1 mL를 붓는 다. 이러한 튜브 상태와 복제 단계 3.1에에서 표시 된 대로 표시 됩니다.</li>
</ol>
7. 풀-다운
<ol>
	<li>1.5 mL 튜브 4 ° c.에서 10 분 11000 x g 에서 원심</li>
	<li>새로운 튜브 (A)는 supernatants 전송.</li>
	<li>다른 튜브 (B), 즉 50 µ L 튜브 당 조건 당이 상쾌한의 약 수 가져가 라. 4 x Laemmli 버퍼 (lysate의 50 µ L에 대 한 16.6 µ L)를 추가 하 고-20 ° c.에 동결 이러한 lysates 평소 서쪽 오 점 샘플을 될 것입니다.</li>
	<li>부드러운 진동에 의해 잘 NeutrAvidin Agarose 균질. 그들의 직경을 증가 하 고 구슬의 pipetting 향상 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li></ol>셀 (A) 튜브에 lysate의 mL 당 NeutrAvidin Agarose의 50 µ L를 추가 합니다.
	<li>NeutrAvidin BCPPs 그들의 세포내 파트너에 바인딩된 상호 작용할 수 있도록 매우 부드러운 떨고와 하룻밤 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>3000 x g 단백질 NeutrAvidin의 복합 수집 하 4 ° C에서 1 분 동안에 원심.</li>
	<li>조심 스럽게는 supernatants 제거 하 고 깨끗 한 관 (C)에 그들을 전송. 풀 다운은 성공 하는 경우에 그들을 사용 하는 그들을 유지.</li>
	<li>세척 단계: 펠 릿 (튜브 A)를 신선한 세포의 용 해 버퍼를 추가, 반전에 의해 resuspend 및 반복 단계 7.6) 및 7.7) 5 번 이상에 대 한. 이러한 모든 supernatants 삭제 될 수 있습니다.</li>
	<li>supernatants 제거 하 고 원하는 마지막 볼륨 (confluent 셀 150 c m2 플라스 크에서 얻은 펠 릿에 대 한 1.5 mL 튜브에 40 µ L) 2 x Laemmli 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>단백질 및 원심 분리기 30 사이의 상호 작용을 해리를 5 분 동안 100 ° C에 elute 8,200 x g 작은 NeutrAvidin 구슬에서 s.</li>
	<li>새로운 관 (D)에 모 세관 팁 천연된 단백질을 포함 하는 supernatants 가져가 라. 구슬 필요한 차입 단계를 반복 하는 경우에 보관할 수 있습니다. 참고: supernatants (D 관) 준비가 지금 서쪽 오 점에 로드할 수 또는-20 ° c.에 동결</li>

8. 서쪽 오 점
참고: 앞에서 설명한24로 수행 되었다 서 부 럽.
<ol>
	<li>Midi-셀 전기 시스템에서 두번째-트리 스 (4-12%) midigels에 차선 당 각 샘플의 동일한 볼륨을 로드 합니다.</li>
	<li>Transblot 단백질 니트로 일반 스택으로 건조 더 럽 히 시스템을 사용 하 여.</li>
	<li>10% 막 얼룩 Ponceau 10 분.</li>
	<li>TTBS의 5 mL와 함께 3 x 5 분 막 씻으십시오.</li>
	<li>부드러운 튜브 또는 작은 상자에 떨고와 1 시간에 대 한 TTBS에서 7% 우유와 함께 막 차단 합니다. 사용 하는 볼륨 멤브레인을 커버 하기에 충분 하 고는 그들은 건조 하지 마십시오, 즉 전체 midi 막 당 40 mL 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>TTBS의 5 mL와 함께 3 x 5 분을 씻어.</li>
	<li>부드러운 진동으로 관심사의 단백질에 대 한 1 차적인 항 체와 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>TTBS의 5 mL와 함께 3 x 5 분을 씻어.</li>
	<li>특 파 원 과산화 효소 활용 된 이차 항 체 TTBS에 1 시간에 대 한 실내 온도에서 막 품 어.</li>
	<li>TTBS의 5 mL와 함께 3 x 5 분을 씻어.</li>
	<li>화학 시스템 chemiluminescent 기판으로 개발.</li>
</ol>
9. 문제 해결
<ol>
	<li>개발 후 서쪽 모든 단백질을 위한 신호를 보여준 샘플의 오 점는 Ponceau 확인. 레인을 따라 수많은 밴드 로드 및 참고: Ponceau에 막 정의 되지 않은 표시 한다. 밴드 매우 눈에 띄는 경우, 로드 하는 단백질의 양이 충분 하지 않을 수 있습니다 또는 올바르게 사라 하는 전이 할 수 있습니다. 서쪽 오 점 반복 되는 것이 좋습니다.</li>
	<li>모든 레인에 Ponceau 막에 전혀 아무 얼룩 경우, (C) 튜브에서 7.4 단계에서 전체 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>서쪽 오 점 개발 후 단백질 신호는 매우 약한 경우는 Ponceau 보였다 단백질, 긴 시간에 대 한 1 차 항 체로 막을 다시 품 어. 신호가 여전히 다소 약한 경우에, 다시 실 온에서 품 어.</li>
</ol>
10. 기타 기술 사용 하는이 기사에서
<ol>
	<li>BCPPs의 Immunocytochemistry
	<ol>
		<li>20 분 동안 4 %paraformaldehyde (0.2 mL c m2당)에 있는 셀을 수정 합니다.</li>
		<li>PBS (0.2 mL c m2당)를 가진 3 x 5 분을 씻어.</li>
		<li>하룻밤 4 ° c.에 대 한 관심의 단백질에 대 한 제조 업체의 지정 된 농도에서 항 체 용액에 희석 해당 항 체 (c m2당 0.15 mL 이상) 적용</li>
		<li>fluorophore 활용 된 이차 항 체 (c m2당 0.15 mL) 실 온에서 2 h와 함께 품 어.</li>
		<li>관심사의 단백질에 대하여 다른 항 체와 단계 10.1.2-10.1.4를 반복 합니다. 다른 기본 항 체 또는 이차 항 체에 대 한 동일한 파장 fluorophores 같은 종족을 사용 하지 않기 위하여 주의 해야 합니다.</li>
		<li>Antifade 시 약 (c m2당 0.005 mL)을 사용 하 여 셀을 탑재 합니다.</li>
		<li>디지털 카메라에 연결 된 형광 현미경에 분석.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTT 분석 결과
	<ol>
		<li>24-잘 접시에서 37 ° C에서 세포 문화.</li>
		<li>셀 MTT 0.5 mg/mL를 포함 하는 c m2 당 문화 매체의 0.15 mL와 75 분 동안 어둠 속에 품 어.</li>
		<li>매체를 발음 하 고 디 메 틸 sulfoxide (c m2당 0.25 mL) 가벼운 동요와 함께 어둠 속에서 10 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>570의 파장에서 흡 광도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+avidin-biotin+technology%3A+literature+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Applications of avidin-biotin technology: literature survey.</a> Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).</li>
<li>Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+molecular+mechanism+for+the+cellular+uptake+of+guanidinium-rich+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules.</a> J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).</li>
<li>Ramsey, J. D., Flynn, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides+transport+therapeutics+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells.</a> Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).</li>
<li>Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+stabilize+cell+penetrating+peptides+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Deliv%22%5BJournal%5D)">Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications.</a> Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).</li>
<li>Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+HIV-1+Tat+protein+basic+domain+rapidly+translocates+through+the+plasma+membrane+and+accumulates+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.</a> J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).</li>
<li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+peptide-mediated+cellular+delivery%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).</li>
<li>Cuesto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-3-kinase+activation+controls+synaptogenesis+and+spinogenesis+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).</li>
<li>Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine-rich+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Arginine-rich cell-penetrating peptides.</a> FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).</li>
<li>Sorgen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+carboxyl+terminus+of+the+gap+junction+protein+connexin43+indicates+signaling+between+binding+domains+for+c-Src+and+zonula+occludens-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1.</a> J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).</li>
<li>Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+c-Src+with+gap+junction+protein+connexin-43.+Role+in+the+regulation+of+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).</li>
<li>Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+connexin43-Src+interaction+in+astrocytomas%3A+A+molecular+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle.</a> Neuroscience. 323, 183-194 (2016).</li>
<li>Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+networks%3A+a+step+further+in+neuroglial+and+gliovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).</li>
<li>Shinoura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+messenger+RNA+expression+of+connexin43+in+astrocytomas%3A+implications+in+brain+tumor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy.</a> J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).</li>
<li>Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+expression+of+connexin-43+and+functional+gap+junction+coupling+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas.</a> Glia. 33, 107-117 (2001).</li>
<li>Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+Cx43+in+astrocytic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurol+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors.</a> Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).</li>
<li>Crespin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+gap+junction+protein%2C+connexin43%2C+in+a+large+panel+of+human+gliomas%3A+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights.</a> Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).</li>
<li>Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-penetrating+peptide+based+on+the+interaction+between+c-Src+and+connexin43+reverses+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death & Disease. 5, (2014).</li>
<li>Gonzalez-Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+recruits+PTEN+and+Csk+to+inhibit+c-Src+activity+in+glioma+cells+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes.</a> Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).</li>
<li>Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).</li>
<li>Yu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regulation+of+NGF-mediated+functions+by+Nedd4-2+ubiquitination+of+TrkA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA.</a> J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).</li>
<li>Herrero-Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+inhibits+the+oncogenic+activity+of+c-Src+in+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells.</a> Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).</li>
<li>Cooper, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+GM+%22The+Cell%3A+A+Molecular+Approach%22">The Cell: A Molecular Approach</a>. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).</li>
<li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+lipid+rafts+mediate+caveolar+endocytosis+of+HIV-1+Tat+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).</li>
<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+the+cancer+stem+cell+hypothesis+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large.</a> Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nbt/journal/v6/n10/abs/nbt1088-1204.html">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Benard, V., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Cdc42%2C+Rac%2C+and+Rho+GTPase+activation+by+affinity+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods.</a> Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).</li>
<li>Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Penetrating+Peptides%3A+From+Basic+Research+to+Clinics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+therapy+using+tumor+homing+and+penetrating+peptide-functionalized+PEG-PLA+nanoparticles+loaded+with+paclitaxel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel.</a> Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).</li>
<li>Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+disordered+proteins%3A+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsically disordered proteins: regulation and disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).</li>
<li>Anthis, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+integrin+tyrosine+phosphorylation+is+a+conserved+mechanism+for+regulating+talin-induced+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation.</a> J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 많은 방법이 있다. 이 연구에서 제시 하는 방법 biotinylated 미끼와 상호 작용의 설립을 허용 하도록 세포 lysates incubated 널리 biotin avidin 풀 다운 시스템을 기반으로 합니다. 이 연구에서 제시 하는 수정이이 기술은 세포 관통 시퀀스의 조합을 포함 합니다. 우리는 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 알을 품 수 세포 관통 미끼 디자인을 제안 하 고 따라서 발견 상호 작용 세포 컨텍스트 내에서 발생 하는 그 반영 됩니다.
여기 우리 풀 다운 태그와 인간 GSCs에 세포 상호 작용을 찾을 대상으로 아미노산 266-283 사이 구성 하는 Cx43의 지역으로 세포 관통 시퀀스, biotin 문신 사용 합니다. Cx43와 c-Src 간의 상호 작용에 대 한 구조적으로 잘 알려진11,12입니다. 이것은 중요 한 상호 작용 그것은 c-Src glioma 셀24,13의 종양 활동을 억제 하기 때문에. 사실, 포함 하는이 지역 (문신-Cx43266-283) CPPs glioma 셀19,,2021에 Cx43의 antioncogenic 속성 모방. 쥐 glioma C6 셀에는 문신-Cx43266-283 c Src 억제 메커니즘 생 억제제 CSK와 PTEN20c-Src의 채용을 포함 한다. 그것은 GSCs 그들은 기존의 치료에 저항 하 고 그러므로27이 악성 뇌 종양 재발에 대 한 책임 부분 모집단을 구성 하기 때문에 매우 흥미로운 glioma 치료에서 대상으로는 언급 한다. 또한, 그들은 하드 transfect 세포 그리고 그러므로 세포 상호 작용의 연구 더 어려워집니다. CPPs는 신속 하 고 효율적으로 내 면 GSCs19 세포내 상호 작용의 학문을 위한 그들의 사용을 선호. 이에 연구, 우리 Cx43266-283 시퀀스의 c-Src의 내 생 억제제 CSK 및 인간 GSCs에 PTEN 함께 상호 작용을 확인 CPPs biotin에 융합을 사용 하 여.
이 메서드는 매우 강력한 생리 활성 화합물의 세포내 기계 장치를 공부 하. 그러나, biotinylated 세포 관통 미끼의 생물학적 효과 비-biotinylated 하나 얻은 다른는 것인지 매우 중요 하다. 이 단계는 생리 활성 화합물의 효과 함께 발견 하는 상호 작용을 연결 해야 합니다. 더하여, 프로 테아 제에 의해 그것의 가능한 저하 뿐만 아니라 그것의 가능한 독성 화합물의 안정성 해야 될 신중 하 게 테스트 및 실험을 계획 하기 전에 고려. 예에서 제시 G166 인간 GSCs에 문신-Cx43266-283 의 안티 증식 효과 이전 문서화20되었습니다. 이 연구에서 우리가 확인 문신 Cx43266-283의 안티 증식 효과-B 이며 문신-Cx43의266-283 매우 유사. 또한, 세포 형태학의 분석을 α-tubulin 밝혀 및 문신 Cx43266-283치료 G166 GSCs F 걸 배포 매우 비슷합니다.-B 또는 문신 Cx43266-283. 이러한 결과 문신-Cx43266-283 의 c-말단에 biotin의 포함 인간 GSCs에이 화합물의 효과 수정 하지 않은 나타냅니다. 그러나, biotin bioactive 분자의 효과 수정 것 이다 단백질 정화에 대 한 다른 태그 시험 될 수 있다, 플래그 octapeptide (DYKDDDDK)28, 인간의 인플루엔자 조류 파생 태그 하 (YPYDVPDYA) 또는 티 등 S-전이 효소 (GST)29 마찬가지로, 문신의 셀 인구 대상 하지 않는, 다른 penetratin, MPG (검토,30참조)에 대 한 같은 관통 시퀀스 셀 또는 셀 특정 시퀀스 사용된31일 수 있다.
구체적으로 대상 시퀀스와 상호 작용 하는 연구 단백질 이외에, 모두 컨트롤 및 대상 시퀀스와 상호 작용 하는 단백질 및 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 그들 상호 작용 하지 않는 단백질의 존재 해야 합니다. 해결. 이런이 의미에서 우리가 컨트롤에 기갑 부 대-1를 발견 하 고 같이 그것은 되었습니다 이전26는 caveolae 국제화의 메커니즘에 관여 제안 처리 상황. 또한, 팍, c-Src와 상호 작용 하지만 하지 Cx43 c 단자와 상호 작용 하도록 되어, 결 석 했다 제어 및 치료 상황에. 이러한 결과 문신-Cx43266-283-B, c-Src, CSK와 PTEN 사이 상호 작용의 특이성을 강화합니다. 이 프로토콜으로 얻은 결과 확인 하려면 상호 작용 단백질의 분포를 시각화 하 고 그들의 공동 지역화 연구 confocal 현미경 검사 법을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리는 그 문신 Cx43266-283-B와 c-Src 전시 풀 다운 실험으로 얻은 결과 확인 하는 공동 지역화의 몇 가지 포인트와 유사한 세포내 분포를 발견. 사실, 문신-Cx43266-283-B는 화물,이 연구 Cx43266-283, 지시 분자 세포내 파트너를 제안 하는 원형질 막 가까이 배포 됩니다.
제안된 된 방법의 한계 중 하나는 미끼 제대로 접어 하는 데 실패할 수 있습니다 사용 하는 분자와 예상된 효과 것입니다 찾을 수 없습니다입니다. 이 상황에서 발견 하는 상호 작용 수 없습니다 효과에 연결. 그러나,이 방법 때문에 그들은 일반적으로 본질적으로 무질서 지역32 에 의해 실행, 따라서 필요 없습니다 주문 접는 특히 신호 전달 경로에 관련 된 상호 작용에 대 한 흥미로운 수 있습니다. 또한, 제안된 된 방법의 장점 중 하나는 상호 작용의 시간 과정 지켜질 수 있다,이 특히 과도 상호 작용에 대 한 관련입니다. 또한, 상호 작용에 각 잔류물의 관련성은 쉽게 공부 될 수 있다. 실제로, 그것은 떠들고 또는 트레오닌 조미료의 phosphomimetic 대체 하 여 단백질 단백질 상호 작용, 예를 들어,에 posttranslational 수정의 관련성을 연구 수 있습니다. 마찬가지로, 떠들고 또는 알라닌에는 트레오닌, 페닐알라닌을 위한 티로신의 대체 비 phosphorylatable 떠들고, 트레오닌 또는 티로신. 의 효과 테스트를 수합니다인 티로신을 모방 하는 가장 정확한 방법은 p Tyr33Tyr의 대체입니다.
마지막으로,이 프로토콜의 범위는 단백질 단백질 상호 작용 보다 훨씬이 시스템 RNA 시퀀스, 나노 입자, 바이러스 또는 biotin을 융합 하 고 공부 하는 CPP로 불리고 수 있는 다른 분자 같은 다른 생리 활성 화물에 적용 될 수 있기 때문에 세포내 메커니즘에 대 한 그들의 행동의.

단백질 단백질 상호 작용 다양 한 세포질 과정을 위해 필수적입니다. 완벽 하 게 이해 하려면 이러한 프로세스, 환경 내에서 복잡 한 세포내 단백질 상호 작용을 식별 하기 위한 방법이 제시해 주셔야 합니다. 단백질의 상호 작용 협동자를 식별 하기 위해 가장 많이 사용 된 방법 중 하나는 단백질 또는 그 단백질으로 선호도 풀 다운 실험 뒤에 바인딩 단백질의 검출에에서 미끼의 일부의 모방 펩 티 드를 사용 하는. Avidin 비타민 b 복합체 시스템은 높은 선호도, 특이성 및 avidin 비타민 b 복합체1,2간의 안정적인 상호 작용 때문에 자주 사용 됩니다. 일반적으로, 비오 틴 (단백질 또는 펩 티 드) 미끼에 바인딩되어 covalently 및 상호 작용의 설립을 허용 하는 세포 lysates 가진 외피의 기간 후 세포내 파트너에 바인딩된 biotinylated 미끼 avidin 또는 avidin 내려 오게 됩니다. 파생 상품 활용 지원 구슬. 다음, 미끼-단백질 상호 작용은 서쪽 오 점 순이 전기 이동 법을 변성 시키기 의해 세척, 차입, 및 분석 후 검색 됩니다. 이 기술은의 문제 중 하나는 관심사의 단백질 및 세포내 파트너 간의 상호 작용 세포 컨텍스트 외부 자리 하고있다입니다. 이 때문에 그들은 특정 세포내 위치에서 그들은 과도 하 고 그들은 일반적으로 풍부 하지 단백질에 의해 실행 신호 변환 통로에 관련 된 상호 작용에 대 한 특히 중요 하다. 따라서, 세포 lysates 내에서 이러한 상호 작용 수 수 마스크 다른 더 풍부한 단백질 또는 단백질 일반적으로 가까이 하지 않습니다.
세포 관통 펩 티 드 (CPPs) 짧은 펩 티 드 (≤40 아미노산), 거의 모든 셀3에 다양 한 분자를 수송 할 수 있다 양이온 아미노산에 의해 주로 구성 되어 있습니다. 단백질, 플라스 미드 DNA, siRNA, 바이러스, 이미징 에이전트, 다양 한 나노 입자 같은 화물 CPPs을 효율적으로 내 면된4,5활용 되어 있다. 이 수송 능력 때문에 그들은 또한로 알려져 있습니다 단백질 변환 도메인 (PTDs), 막 translocating 시퀀스 (MTSs), 그리고 트로이 펩 티 드. CPPs, 중 문신6 중 하나 되었습니다 가장 널리 HIV transactivator 단백질에서 문신 펩타이드 7,,89공부. 문신은 6 아르기닌과 2 리 진 잔류물을 포함 하 고 결과적으로 높은 양이온은 nonapeptide 이다.입니다. 대체 연구 문신의 순수한 양 전은 진 핵 세포와 그 이후의 국제화10의 플라즈마 멤브레인과 정전기 상호 작용에 필요한 증명 하고있다. 마찬가지로 다른 CPPs에 긍정적으로 위탁 문신 강하게 결속 정전 다양 한 부정 청구 종 세포 외 표면에 세포 막 지질 머리 그룹, proteoglycans3 , glycoproteins 등의 , 10. 생리 화물 문신에 의해 수송 될 그들의 세포내 파트너에 도달 cytosol에서 즉시 무료.
여기 선물이 biotin 세포내 상호 작용을 공부 하는 문신 CPP를 결합 하는 방법. 목표 대상 biomolecule 문신 biotin을 융합 하 여 세포 관통 미끼를 디자인 하는. 이 제안서의 주요 장점은 미끼와 파트너 간의 상호 작용 세포의 컨텍스트 내에서 자리를 차지할 것 이다입니다. 이 방법의 효능 표시 하려면 우리가 사용 미끼 proto-oncogene c-Src11,,1213침 작용할 것으로 보고 되었습니다 Cx43 단백질의 작은 순서. Cx43는 완전 한 막 단백질 이다 이다14널리 표현 하 고 고급 gliomas 아래로 통제 되는 중앙 신 경계15,16,17의 가장 일반적인 악성 종양 ,18. 그것은 되었습니다 이전 c-Src (266-283에에서 아미노산 인간 Cx43;와 상호 작용 하는 Cx43 지역 표시 Pubmed: P17302) 문신 (문신-Cx43266-283)을 융합 c Srcin glioma 세포의 종양 활동을 억제 및 glioma 줄기 세포 (GSCs)19,,2021. 세포내 미끼 디자인, Cx43266-283 는 되었습니다 융합 C-말단에 biotin을 N-말단 (문신-Cx43266-283)에서 문신 (문신-Cx43266-283-B). 이 전략은 성공적으로 사용 되었습니다 쥐 glioma C6 셀 라인에에서 c-Src, c 터미널 Src 키 (CSK)와 인산 가수분해 효소 및 Cx4320의이 지역의 세포내 파트너로 체 (PTEN) tensin 식별 하. 여기, 우리는 매우 관련 된 glioma 치료 하지만 훨씬 더 비 줄기 glioma 셀 보다 transfect에 인간 GSCs에 그 효능을 테스트 하는이 메서드를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>G166 GSC 라인</td><td>BioRep</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RHB-A 줄기 세포 배지</td><td>Takara</td><td>Y40001</td><td></td></tr><tr><td>라미닌 마우스 단백질</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>10 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>B-27 무혈청 보충제 (50X)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>2%</td></tr><tr><td>N-2 보충제 (100x)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>재조합 인간 b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 : 탈 이온수에서 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4 &middot; 2H2O ; 1.7 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10 동결 보존 매체</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>TAT</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>TAT-B</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>맞춤형 제작</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283-B</td><td>GenScript-Custom</td><td></td> <td>made</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A1275737</td><td>1/20</td></tr><tr><td>Monoclonal &alpha;-tubulin mouse antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1/500</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>1.25 mg/ml</td></tr><tr><td>피어스&트레이드; NeutrAvidin&trade; Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>단백질 용해 완충액: 5mM Tris-HCl(pH 6.8), 2%(w/v) SDS, 2mM EDTA, 2mM EGTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 세트 III. EDTA 무함유</td><td>Calbiochem, Bionova</td><td>539134</td><td>1/100 (v/v)</td></tr><tr><td>불화나트륨</td><td>PanReac AppliChem</td><td></td><td>141675 1 mM</td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드 (PMSF)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7626</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>오르토바나데이트</td>나트륨 <td>시그마-알드리치</td><td>S6508</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>Laemmli 완충액 : (4x : 0.18 M Tris-HCl pH 6.8, 5 M 글리세롤, 3.7 % (w / v) SDS, 0.6 M &beta; - 메르 캅토 에탄올 또는 9 mM DTT, 0.04 % (v / v) 브로 모페놀 블루 (BB).</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Xcell 4 SureLock Midi-Cell 전기영동 시스템</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WG1402box</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td>1X</td></tr><tr><td>NuPAGE 전송 버퍼 20x</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0006</td><td>1X</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>물 속 10% Ponceau S 용액(5% 아세트산(v/v) 중 0.1% Ponceau(w/v))</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>FAK 다클론 토끼 항체</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>AHO0502</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Src 다클론 토끼 항체</td><td>세포 신호(WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Csk 다클론 토끼 항체</td><td>세포 신호(WERFEN)</td><td>4980</td><td>1/500</td></tr><tr><td>PTEN 다클론 마우스 항체</td><td>세포 신호전달 (WERFEN)</td><td>9552</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Caveolin-1 다클론 토끼 항체</td><td>Abcam</td><td>ab2910</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG-HRP 항체</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-2005</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG-HRP 항체</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2030</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅 루미놀 시약</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>Src 폴리클로날 토끼 항체</td><td>세포 신호전달(WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>항체 솔루션: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% 아지드화</td><td></td><td></td><td></td>나트륨</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Cy2-conjugated streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-220-089</td><td>1/500</td></tr><tr><td>MicroChemi 발광 시스템</td><td>DNA 바이오 이미징 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Alexa Fluor&reg가 포함된 데드 셀 세포사멸 키트; 488 & 프로피듐 요오드화물(PI)</td><td>분자 프로브, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>V13241</td><td>1/500</td></tr><tr><td>SlowFade Gold 퇴색 방지 시약</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>UV 분광법용 디메틸 설폭사이드, >=99.8% (GC)</td><td>Honeywell</td><td>41641-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appliskan 2001</td><td>Thermo Electron Corporation, 써모 사이언티픽</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

여기 우리는 널리 biotin avidin 풀 다운 시스템을 기반으로 하는 세포내 단백질-단백질 상호 작용 연구 프로토콜을 제시. 제시 하는 수정이이 기술은 세포 관통 시퀀스의 조합을 포함 합니다. 우리는 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 알을 품 수 세포 관통 미끼 디자인을 제안 하 고 따라서 상호 작용 발견 됩니다 반영 세포내 컨텍스트 내에서 발생 하는. Connexin43 (Cx43), 갭 정션 채널 및 hemichannels를 형성 하는 단백질은 고급 gliomas에서 아래로 통제. 구성 아미노산 266-283 Cx43 지역 c-Src glioma 세포에서의 종양 활동의 억제에 대 한 책임 이다. 여기 우리 풀 다운 태그와 아미노산 266-283 transfect 하드 인간의 glioma 줄기 세포에서 세포 상호 작용을 찾을 대상으로 사이 구성 하는 Cx43의 지역으로 세포 관통 시퀀스, biotin 문신 사용 합니다. 제안된 된 방법의 한계 중 하나는 분자 사용 미끼는 제대로 하 고, 결과적으로 접어 하는 데 실패할 수 있습니다, 발견 하는 상호 작용 수 없습니다 효과와 관련입니다. 그러나 그들은 일반적으로 본질적으로 무질서 지역에 의해 실시 하 고, 따라서, 그들은 정렬 된 접는 필요 하지 않습니다 때문에,이 방법은 특히 신호 전달 경로에 관련 된 상호 작용에 대 한 흥미로운 수 있습니다. 또한, 제안된 된 방법의 장점 중 하나입니다 상호 작용에 각 잔류물의 관련성 쉽게 공부 될 수 있다. 이것은 모듈식 시스템; 따라서, 다른 세포 관통 시퀀스, 다른 태그와 다른 세포내 표적을 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜의 범위는 단백질 단백질 상호 작용 보다 훨씬 RNA 시퀀스, 나노 입자, 바이러스 또는 세포 관통 시퀀스 불리고 수 있는 어떤 분자 같은 다른 생리 활성 화물에이 시스템을 적용할 수 있습니다 때문에 고 활동의 그들의 세포내 기계 장치를 공부 하기 풀 다운 태그에 융합.

BCPPs를 사용 하 여 세포 상호 작용을 공부를 하기 전에 BCPP vs BCPP으로 얻은 결과 확인 하는 CPP의 효과 비교 하 여 중요 하다. 따라서, 공부 하 고 대상 시퀀스의 활동을 수정 하는 비오 틴의 포함 여부, 우리가 먼저 분석 문신 Cx43266-283의 효과-B 문신 Cx43266-283 G166 GSCs 형태에 비해. 이렇게 하려면, 우리는 F-말라와 α-tubulin 치료의 24 시간 후 cytoskeletal 단백질의 일부 면역 형광 분석을 수행. 그림 1 보여줍니다 G166 GSCs 50 µ M 문신-Cx43266-283 또는 문신 Cx43266-283있을 때-B 인수 문신 (문신 B) 컨트롤에 표시 된 길쭉한 및 확장 된 셀룰러 연장에 비해 더 둥근된 모양. 사실, 그림 1b 걸 필 라 멘 트 셀 문신 Cx43266-283 또는 문신 Cx43266-283로 치료 했다 때 말라 네트워크로 조립 대부분은 보여줍니다-그들은 더 많은 걸 번들 컨트롤 셀에 형성 하는 동안 B (문신 치료 또는 TAT-B)25. 대조적으로, α-tubulin 배포 다른 조건 사이 다 하지 않습니다. 이 결과 biotin의 존재 G166 GSCs의 형태에 대상 시퀀스의 효과 수정 하지 않았다 보여주었다. 이전 연구20,21, 우리는 문신-Cx43266-283 G166 GSCs 확산 감소 다는 것을 보였다. 이 연구에서 우리는 조사 여부 문신 Cx43266-283-B 문신 Cx43266-283로 성장에 동일한 효과 발휘 한다. 이렇게 하려면, 우리가 치료의 72 h 후 MTT 분석 결과 의해 G166 GSCs 확산 분석. MTT 분석 결과 세포 신진 대사 활동을 평가 하기 위한 색도계 분석 결과가 이다. MTT는 존재 가능한 셀의 수를 반영 하는 미토 콘 드리 아에 NAD (P) H oxidoreductase 효소에 의해 물질 대사로 변화. 그림 2 는 G166 GSCs 세포 생존 능력에 있는 감소 아니다는 것을 크게 다른 때 셀 50 µ M 문신-Cx43266-283 또는 50 µ M 문신-Cx43266-283로 치료 했다. 사실, 둘 다 크게 컨트롤, 문신 또는 문신 B에 비해 G166 GSCs 확산 감소
일단 우리가 우리의 대상 시퀀스 G166 GSCs (문신-Cx43266-283)에서 효과 C-말단에 biotin의 포함에 의해 수정 되지 않았음을 확인 (문신-Cx43266-283-B), 우리이 시퀀스의 세포내 파트너 조사 프로토콜에 따라이 연구 (그림 3)에서 설명 합니다. Caveolae 문신 국제화26의 메커니즘에 참여 하고있다, 때문에 우리 분석 caveolin-1 (기갑 부 대-1) 풀-다운에서의 존재를 했다. 서쪽 오 점 분석 (그림 4) 보였다 그 문신 B와 문신 Cx43266-283-B 기갑 부 대-1 상호 작용. 그러나, 문신-Cx43266-283의 능력-B c-Src, PTEN, CSK 모집 문신 b 발견 보다 강하다 초점 접착 키 니 아 제 (팍) Cx43 상호 작용을 표시 하지 c Src의 기판입니다. 실제로, 팍 문신 B 또는 문신 Cx43266-283와 어떤 중요 한 상호 작용을 보여 주지 않았다.
문신-Cx43266-283사이의 상호 작용을 확인 하려면-B와 c-Src, G166 GSCs incubated 했다와 50 µ M 문신-Cx43266-283-B 30 분 및 그들의 지역화에 대 한 선행 되었다 형광 streptavidin과 confocal 현미경 검사 법 (그림 5 ). 우리의 결과 세포내 분포를 보여 문신 Cx43266-283의-B (phosphatidylserine 얼룩이 표시) 원형질 막 가까이 c-Src의 일치. 공동 지역화 분석 사이 문신 Cx43266-283공동 지역화 (흰색)의 몇 가지 포인트를 공개 하는 사실, B-와 c-Src 병합 이미지에. 따라서, confocal 현미경 검사 법 학문 BCPP 풀 다운 프로토콜 설명 하는이 연구에서 얻은 결과 확인 합니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig1.jpg"> 
그림 1: GSC 형태학에 BCPP 및 CPP의 효과. G166 GSCs 낮은 밀도에서 도금 했다 (2 x 104 의 세포 / cm2) 그들은 50 µ M 제어 CPP (문신) incubated 했다 24 h 후 BCPP (문신-B), CPP (문신-Cx43266-283) 치료 또는 치료 BCPP 제어 (문신-Cx43266-283-B) . a) F-말라 (빨강), α-tubulin (녹색)와 병합 + DAPI G166 GSCs 형태를 표시 하는 동일한 필드의 immunostaining. 바 = 50 µ m. b) F 걸 immunostaining F-말라 G166 GSCs 50 µ M와 24 h에 대 한 부 화 후에 다른 분포를 보여 주는 CPP (문신)를 제어 하거나 50 µ M 치료 CPP (문신-Cx43266-283) 비해 BCPP (문신-B) 또는 BCPP (문신-Cx43 제어 266-283-B). 바 = 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig2.jpg"> 
그림 2: GSC 생존에 BCPP 및 CPP의 효과. G166 GSCs 5500 셀/cm2 24 multiwell 격판덮개 도금 되었고 50 µ M 컨트롤 펩 티 드, CPP (TAT) 또는 BCPP (문신-B), 또는 50 µ M 치료 펩 티 드, CPP (문신-Cx43266-283) 또는 BCPP incubated (문신-Cx43266-283-B). 세포 생존 능력 72 h 후 MTT 분석 결과 사용 하 여 분석 했다. 결과 MTT absorbances로 표현 되며 3 실험 평균 ± s.e.m. (+ + p˂0.01 vs 통제. * * p˂0.01, * * * p˂0.001 대 문신 또는 문신 B; 일방통행 ANOVA 테스트 withTukey는 후). CPPs 대 BCPPs.의 효과 사이의 중요 한 차이 없는 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig3.jpg"> 
그림 3: 프로토콜 다이어그램입니다. Eluted BCPPs 및 그들의 상호 작용 단백질 obtained.1 때까지 BCPPs의 섹션은 부 화에서 "프로토콜"에서 설명한 대로 절차의 단계적으로 그래픽 묘사) 문화에 대 한 원하는 농도에서 BCPPs 셀을 품 어는 필요한 시간입니다. 2) 동안 보육는 BCPPs 내 면 하 고 그들은 그들의 세포내 파트너와 상호 작용 합니다. 3) 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 얼음에 세 번 셀 세척. 4) 단백질을 추출 하는 세포를 lyse. 5) 튜브에 세포 lysates 전송.6) 4 ° c.에서 10 분 11000 x g 에서 회전 7) 전송 새로운 튜브 (A)와 일반 부로 처리 하려고 lysates의 작은 약 수를 계속 supernatants 얼룩에 샘플 튜브 (B). 8) resuspend NeutrAvidin Agarose 구슬 고 컷된 피 펫 팁을 사용 하는 각 관에 50 µ L를 추가 합니다. 9) NeutrAvidin agarose 구슬 BCPPs 및 그들의 파트너와 상호 작용할 수 있도록 4 ° C에서 12 h 동안 부드럽게 흔들어 함께 품 어. 10)는 biotinylated와 구슬 펠 렛을 3000 x g 에서 1 분 동안 회전 미끼 그리고 그들의 상호 작용 단백질 그들에 바인딩된. 11) 새로운 관 (C)에 supernatants 전송 및 풀-다운 반복 해야 하는 경우에 사용 하는 그들을 유지. 12) 세척 5 회 신선한 세포의 용 해 버퍼와 펠 릿, 반전, 3000 x g 에서 1 분 동안 회전 급강하에 의해 resuspend 하 고는 상쾌한 삭제. 13) 모든 상쾌한 신중 하 게 제거 합니다. 14) 추가 원하는 양의 Laemmli 버퍼 x 4 하 고 5 분 15 100 ° C에서 단백질을 elute) 8200 x g 30에 스핀 s 작은 구슬. 16) 상쾌한 새로운 관 (D)에 모 세관 팁에 eluted 단백질 전송. 17) 서쪽 오 점 분석을 위한 젤에 로드 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig4.jpg"> 
그림 4: 연구-풀 다운에 의해 G166 GSCs B 서쪽 오 점 뒤에 문신-Cx43266-283의 세포 상호 작용의. G166 GSCs 50 µ M 문신 B 또는 문신 Cx43266-283와 알을 품을 했다. 후 30 분 셀 lysed 했다 및 문신 B 또는 문신 Cx43266-283-B 그들의 세포내 파트너에 연결 된 NeutrAvidin 구슬 내려 오게 했다. Eluted 단백질 로드 되었고 팍, c-Src, CSK, 레벨을 공부 하는 서쪽 오 점 분석 PTEN 및 기갑 부 대-1. 기갑 부 대-1 두 문신 B와 상호 작용 하 고 문신 Cx43266-283-B, c-Src, PTEN, CSK 여기서 우선적으로 문신 Cx43266-283-B와 팍 문신 B 또는 문신 Cx43266-283와 어떤 상호 작용을 보여 주지 않았다-B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig4large.jpg" target="_blank">하시기 바랍니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig5.jpg"> 
그림 5: 문신-Cx43266-283-B 세포 상호 작용의 G166 GSCs에 confocal 현미경 검사 법에 의해 확인. G166 GSCs 50 µ M 문신-Cx43266-283와 알을 품을 했다. 30 분 후 셀 고정 되었고 문신 Cx43266-283지역화를 처리-면역 형광 (빨간색)와 phosphatidylserine annexin V (파란색)와 c-Src Cy2 Streptavidin (녹색), B. 문신-Cx43266-283사이 공동 지역화 (흰색)의 몇 가지 포인트를 참고-B와 c-Src 병합 이미지에 원형질 막 가까이. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이것은 세포내 단백질 단백질 상호 작용 세포 관통 시퀀스 결합의 참신과 함께 biotin avidin 풀 다운 시스템에 기초를 공부 하는 프로토콜 이다. 주요 장점은 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 대상 시퀀스를 incubated 하 고 따라서 상호 작용 세포 컨텍스트 내에서 발생 합니다.

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포 내 맥락에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 것입니다. 이는 자체 침투 염기서열과 결합된 비오틴-아비딘 풀다운 시스템을 통해 달성되며, 살아있는 세포와 함께 표적 염기서열에서 배양할 수 있습니다. 이 방법은 특정 신호에 의해 얻기 위한 생체 분자 간의 빠르고 역동적인 상호 작용과 같은 세포 신호 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 분자 상호 작용이 세포 내 맥락에서 발생한다는 것입니다. 이 연구에서는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 150제곱센티미터의 플라스크 4개에 인간 G166 신경교종 줄기세포 또는 GSC를 도금합니다. 합류점에 도달했을 때 세포를 처리합니다.500만 개의 G166 셀이 150제곱센티미터 플라스크에 도금되면 도금 후 2일 후에 처리됩니다. 동결건조된 비오틴화 세포 침투 펩타이드가 들어 있는 바이알을 8, 200회 g에서 30초 동안 회전시켜 뚜껑에 분말이 남아 있지 않도록 합니다. 검색된 상호 작용이 대상 염기서열에 특이적인지 확인하기 위해 제어된 BCPP를 포함합니다.그런 다음 제조업체가 지정한 원액에 해당하는 배양 배지에 BCPP를 용해시킵니다. GSC를 처리하기 위해 BCPP 밀리리터당 2밀리그램의 원액을 얻으려면 BCPP 1밀리그램이 들어 있는 바이알 하나에 0.5밀리리터의 GSC 배양 배지를 첨가합니다. 바이알을 와류로 만들고 펩타이드가 잘 용해되었는지 확인합니다.풀다운 분석에서 조건별로 최소 12개의 1.5ml 튜브를 준비하여 수행합니다. 조건별로 처음 3개의 튜브를 표시합니다. 그들은 세포 용해물의 총 부피를 가질 것입니다.다음으로, 조건별로 3개의 튜브에 A를 표시합니다. 이 튜브는 세포 용해물을 용해하고 회전시킨 후 얻은 첫 번째 상층액을 갖습니다. 그런 다음 조건별로 3개의 튜브에 B를 표시합니다.이 튜브에는 웨스턴 블롯 샘플에 대한 첫 번째 상등액의 작은 분취량이 있습니다. 마지막으로, 조건별로 3개의 튜브에 C를 표시합니다. 이 튜브에는 NeutrAvidin으로 풀다운 한 후 얻은 상층액이 있습니다.세포에서 배양 배지를 흡인한 후, 배양 시간에 따라 가능한 가장 작은 부피의 배지에서 BCPP를 배양하는 데 필요한 해당 부피의 새로운 배지로 교체합니다. 어떤 경우에도 매체가 플라스크의 전체 표면을 완전히 덮는 것이 매우 중요합니다. BCPP의 원액 부피를 세포 배양액에 추가하여 효과적인 것으로 입증된 농도에 도달합니다.따라서 TAT-connexin 43 266-283 배양 배지 밀리리터당 2밀리그램 92.8마이크로리터를 추가합니다. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 30분 동안 놓고 BCPP와 세포 내 파트너 간의 상호 작용이 일어나는지 확인합니다. 단백질 추출을 수행하려면 먼저 배양 배지를 완전히 흡인 한 다음 150cm당 10ml의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세포를 매우 조심스럽게 세척하여 자체 분리를 방지합니다.세포 용해물을 얻으려면 150제곱센티미터 플라스크당 3ml의 용해 완충액을 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 표면을 철저히 긁어냅니다. 플라스크를 약 45도로 기울이면 세포 용해물을 해당 튜브에 더 쉽게 모을 수 있습니다. 튜브당 1ml의 세포 용해물을 조건에 따라 표시된 3개의 1.5ml 튜브에 붓습니다.풀다운을 위해, 11, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 시간 g에 1.5 밀리리터 관을 원심 분리하십시오. 상등액을 A.I.Transfer라고 표시된 새 튜브로 옮깁니다.B.그런 다음 50 마이크로 리터의 용해물에 대해 16.6 마이크로 리터의 4x Laemmli 버퍼를 추가하고 섭씨 영하 20 도에서 동결합니다. 다음으로, 부드러운 쉐이킹으로 NeutrAvidin 아가로스를 매우 잘 균질화합니다.피펫 팁의 끝을 잘라 직경을 늘리고 비드의 피펫팅을 개선합니다. 그런 다음 A 튜브에 세포 용해물 1ml당 50마이크로리터의 NeutrAvidin 아가로스를 추가합니다. 세포를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 매우 부드럽게 흔들어 배양하여 NeutrAvidin이 세포 내 파트너에 결합된 BCPP와 상호 작용할 수 있도록 합니다.다음, 단백질을 가진 NeutrAvidin의 복합물을 모으기 위하여 3, 4 섭씨 온도에 1 분 동안 000 시간 g에 분리기. 상층액을 조심스럽게 제거하고 C.풀다운이 성공하지 못할 경우를 대비하여 사용할 수 있도록 C.라고 표시된 깨끗한 튜브로 옮깁니다. NeutrAvidin의 복합체를 단백질로 세척하려면 A 튜브의 펠릿에 새로운 용해 완충액을 추가합니다.반전으로 펠릿을 재현탁하고 원심분리를 반복합니다. 이 세척을 5회 더 반복합니다. 이러한 모든 상등액은 폐기할 수 있습니다.다음으로, 150제곱센티미터 플라스크의 융합 셀에서 얻은 펠릿에 대해 1.5밀리리터 튜브당 40마이크로리터의 2x Laemmli 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 100도에서 5분 동안 용리하여 단백질 간의 상호 작용을 분리합니다. 용리 후 8, 200 회 g에서 30 초 동안 원심 분리기하여 NeutrAvidin 비드를 펠릿으로 만듭니다.모세관 팁으로 해리된 단백질을 포함하는 상등액을 D.These 상등액이라고 표시된 새 튜브로 옮깁니다. 이 상등액은 이제 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웨스턴 블롯에 적재할 준비가 되었거나 섭씨 영하 20도에서 동결될 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 비오틴과 TAT-커넥신 43, 266-283의 융합이 신경교종 줄기세포 형태에 대한 세포 침투 펩타이드의 영향을 수정하지 않음을 보여주는 면역세포화학 이미지입니다. BCPP 또는 CPP로 처리한 GSC의 MTT 분석은 비오틴과 TAT-코넥신 43, 266-283의 융합이 GSC에 대한 TAT-코넥신 43, 266-283의 항증식 효과를 수정하지 않음을 보여줍니다.BCPP 풀다운 후 웨스턴 블롯의 대표적인 결과가 여기에 표시됩니다. 웨스턴 블롯은 TAT와 상호 작용하도록 기술된 단백질, 예를 들어 Cav-1이 두 조건 모두에서 나타나는 것을 보여줍니다. Cx43과 상호 작용한다고 설명된 단백질(예: c-Src 및 PTEN)은 TAT-커넥신 43 266-283 풀다운 직후에 나타나는 반면, Cx43 또는 TAT와 직접 상호 작용하지 않는 단백질(예: FAK)은 존재하지 않습니다.컨포칼 현미경 이미지는 BCPP와 함께 발견되는 세포 내 상호 작용을 확인합니다. 이미지는 G166 GSC의 원형질막에 가까운 c-Src와 TAT-connexin 43 266-283의 세포 내 공동 국소화를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 펩타이드를 추가하기 전에 시약과 원심분리기의 온도와 세포의 합류 정도를 확인하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 비오틴화된 세포 침투 펩타이드를 사용하여 세포 내 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후 이 기술은 세포 신호 전달 분야의 연구에서 배양 세포, 유기형 배양 및 생체 내 모델에서 세포 내 분자 메커니즘과 계통 특이적 경로를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 절차에 따라 세포 침투 펩타이드로 형질 주입되고 풀다운 TAT에 융합될 수 있는 RNA 염기서열, 나노 입자, 바이러스 또는 기타 분자와 같은 다른 생체 활성 화물을 사용하여 세포 내 작용 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 매우 위험한 물질이 포함되어 있지 않지만 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 실험복을 착용하는 것을 잊지 마십시오.

biotinylated-cell-penetrating-peptides-to-study-intracellular-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

이 동영상은 비오틴화된 세포 침투 펩타이드를 사용하여 세포 내 단백질-단백질 상호 작용을 감지하는 기술을 보여줍니다. 세포 침투 펩타이드는 접합 펩타이드가 세포에 들어가 상호 작용하는 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 용이하게 합니다. 비오틴은 아비딘(avidin)에 결합한 후 세포 용해물에서 상호 작용하는 단백질 복합체를 정제할 수 있습니다.

단백질과 단백질의 상호작용을 검출하기 위한 Biotinylated Cell-Penetrating Peptide 프로브

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

단백질 기능, 시공간 세포 내 국소화 및 단백질-단백질 상호 작용 네트워크를 조사하기 위해 LAP(localization and affinity purification) 태그가 지정된 유도 가능한 안정 세포주를 생성하는 방법을 설명합니다.

조사 단백질 기능, 시공간 현지화 및 단백질 상호 작용 네트워크를위한 유도 LAP-태그 안정 세포주

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

이 프로토콜은 관심 단백질에 융합된 비오틴 리가아제에 대한 근접성을 기반으로 단백질에 비오틴의 생체 내 공유 결합 방법을 제시합니다. 이 변형을 통해 단백질 상호작용 연구에서 필요에 따라 스트렙타비딘 비드를 사용하여 단백질을 선택적으로 농축할 수 있습니다.

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

배우세요 생체세포 내 단백질-단백질 상호작용을 바이오틴화 세포 관통 펩티드와 풀다운 분석으로 연구하는 방법을. G166 교모세포줄기세포에서 신호전달 경로를 탐색할 수 있습니다.

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

더 많은 동영상 탐색