Name: 라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 학습하세요 라이브 세포에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경을 이용한 1차 섬모의 단백질 수송 경로 매핑 방법. NIH-3T3 세포를 사용하여 정상 및 기능 장애 섬모의 수송 경로 차이를 분석하고 세포 신호 전달 메커니즘을 규명합니다.

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우리가 제공 하는 일부 플라스 미드에 대 한 박사 순 영 Verhey (미시간 대학, 앤 아 버)와 닥터 그레고리 Pazour (매사 추세 츠 대학의과 대학) 감사 합니다. 프로젝트는 건강의 국가 학회 (NIH GM097037, GM116204 및 W.Y. GM122552)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 재고에서 속도입니다 NIH-3T3 세포 준비
<ol><li>실험에 앞서 1.5 주 37 ° C에 녹고 고 3 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 110 mg/mL와 함께 보완으로 25 cm2 셀 문화 플라스 크에 세포를 전송 하 여 냉동된 재고에서 NIH-3T3 세포의 신선한 문화를 복구 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 및 1% 페니실린/스.</li>
	<li>5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>분할 매 2 일에 대 한 80 %confluency 세포의 세포 주기를 위해 실험 하루 전에 적어도 세 번. 37 ° C에서 2 분 동안 0.25 %trypsin 셀 trypsinize, 트립 신을 발음 하 고 매체의 2 mL와 함께 그것을 대체. 피펫은 반복 셀 클러스터 헤어, 원하는 셀 수를 제거 하 고 미디어의 전체 볼륨을가지고 매체 3 mL를 다시. 참고: NIH-3T3 NPHP-4, localizes는 TZ26, mCherry에는 C에 융합 단백질을 표현 하기 위해 유전자 설계 이전 했다. mCherry 이다 fluorophore 561 nm 조명을 양적 TZ 선택도 배리어를 지역화 하 고 기본 속눈썹 방향으로 흥분 될 수 있는.</li>
	<li>2 일 전에 실험, 접시 35 m m 유리 하단으로 셀 단계 1.1 같은 매체의 1.5 mL와 60-70 %confluency 접시 고 인큐베이터에 셀을 반환 합니다.</li>
	<li>하루는 실험 전에 화학적으로 원하는 플라스 미드와 셀 transfect. 500-1000 원하는 플라스 미드의 ng (아래 참고 참조) transfection 시 약 30 분에서 35 Aspirate 미디어에 대 한 항생제 없이 감소 된 혈 청 미디어의 0.25 ml에서 1:2.5 비율에 m m 유리 하단 접시를 혼합 하 고 0.25 mL 플라스 미드 / transfection 시 믹스 플러스 항생제 없이 감소 된 혈 청 미디어의 여분의 1.25 mL. 감소 된 혈 청 미디어 성공적인 transfection를 촉진, 기본 속눈썹 성장 유도를 살려 셀 충분히 실험을 수행 하는 목적을 제공. 다음 날에 실험에 대 한 보육을 셀을 반환 합니다. 참고: IFT20의 단일 분자 추적을 수행할 때 사용된25는 유전자 변형 IFT20 GFP에의 C에 융합을 포함 하는 플라스 미드. 단일 분자를 수행할 때 SSTR3의 추적 수락자 펩 티 드 (AP) 도메인에는 N에 융합 하는 유전자 변형 SSTR3를 포함 하는 플라스 미드 이며 C terminus GFP 사용된22. SSTR3 구문 이외 biotin 리가 BirA를 포함 하는 플라스 미드를 공동 표현 해야 합니다 및 transfection 미디어 10 µ M biotin으로 보충 해야 합니다. BirA biotin 응급실의 수준에서 새로 합성된 AP-SSTR3-GFP 분자의 AP 도메인에 다음 연결합니다. Alexa647 3 streptavidin에 있는 4 개의 biotin 바인딩 사이트 활용 된 평균 수 있습니다 다음 보완 될 AP-SSTR3-GFP 분자는 셀22,27의 외부 표면에 붙일 라벨을 이미징 이전 미디어 . GFP와 AlexaFluor647;이 방법에 사용 됩니다. 그러나, 만약 그들이 마찬가지로 높은 사진-안정성과 양자 항복 다른 형광 프로브를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>외부에서 표시 된 SSTR3 구문, 유리 바닥에서 미디어 실험 하기 전에 1 시간을 요리, 세척 5 회 인산 버퍼 (PBS), 염 분의 1 mL와 함께 셀 및 감소 된 혈 청 미디어의 1 mL 1 µ M와 보충 추가 제거를 사용 하는 경우 Alexa647 활용 streptavidin입니다.</li>
	<li>실험을 하기 전에 더 이상 15 분 유리 하단 접시에서 미디어를 제거 하 고 5 번 1 mL의 PBS로 레이블이 transfected 세포를 씻어.</li>
	<li>이미지 버퍼 (20 mM HEPES, 110mm KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1mm EGTA, pH 7.3)의 1 mL 유리 하단 접시에 놓습니다. 참고: 이미지 버퍼에 셀은 3 h 보다 더 이상에 대 한 가능한. 따라서, 각 요리에만 2 시간 실험의 수행 됩니다.</li>
</ol>2. 속도 현미경 검사 법
참고: 속도 현미경 설치 포함 1.4 나 100 × 기름 침수 apochromatic 목표, 35 mW 633 nm 그-Ne 레이저, 50 mW 고체 488 nm 및 561-nm 레이저, 온-칩 곱셈 이득 거꾸로 형광 현미경 충전 결합 장치 카메라와 데이터 수집 및 처리 (그림 1)에 대 한 현미경 소프트웨어 패키지. 개별 채널 이미징, GFP, mCherry, 및 Alexa647 흥분 488 nm, 561, 또는 633 nm 레이저, 각각. 단일 분자 추적에 대 한 단일 지점 조명 개별 붙일 표시 된 분자를 추적 하는 데 사용 됩니다. Epifluorescence 이미징, 오목 렌즈는 빔 조명 유니폼 분야에 확장 레이저 조명 경로에 배치 됩니다. 형광 방출 동일한 목적에 의해 수집 된, (405/488/561/635) dichroic 필터와 배기 필터 (405/488/561/635), 필터링 및 단일 분자 추적에 대 한 500 Hz 또는 대 한 2 Hz에서 위의 CCD 카메라와 함께 몇 군데 epifluorescence 이미지입니다.
<ol><li>현미경의 단계로 유리 하단 플레이트를 부착 하 고 원하는 구문을 제대로 표현 하는 셀을 찾습니다. 일단 적당 한 셀을 발견 했습니다, 레이저의 단일 지점 조명에 해당 하는 영상 평면에 위치와 함께 기본 속눈썹의 기지에서 NPHP4 mCherry 자리를 맞춥니다.</li>
	<li>Epifluorescence NPHP4-mCherry IFT20-GFP 및 AP-SSTR3-GFP 디지털 현미경 소프트웨어 패키지를 사용 하는 경우 "포커스 컨트롤" 창의 "카메라" 탭에서 "스냅" 기능을 사용 하 여 이미지를 캡처합니다 ( 재료의 표참조). 참고:이 이미지는 이후 단일 분자 위치에 대 한 참조로 작동할 것 이다.</li>
	<li>참조 이미지는 얻은 로컬 레이블이 단일 분자의 농도 줄일 수 있습니다. 사진-블리치 20에 대 한 1 mW 레이저 조명 TZ s 또는 형광 강도 배경 형광의 가까이까지. 참고: 때 정확한 농도 통제 될 수 있다, 0.1-1 nM 단일 분자를 레이블이 사용 됩니다.</li>
	<li>단일 분자 추적에 대 한 준비, 레이저 조명 전력 ~0.15 mW GFP와 함께 표시 하는 단일 분자 또는 분자 Alexa647 표시에 대 한 ~0.5 mW를 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>최대한 빨리 레이저 파워 및 이미징 매개 변수 설정, 최대 이득 및 강화 및 2 ms 프레임 속도, 단일 분자 이미징, 적절 한 조명 레이저 고 비-photobleached, 그들은 이송으로 단일 분자를 표시 기록 통해 "포커스 컨트롤" 창의 "카메라" 탭에서 "스트림" 버튼을 클릭 하 여 TZ의 photobleached 지역. 참고: 비디오의 2 분 더 이상 무시할 수준으로 속눈썹 드리프트의 효과 최소화 하기 위해 캡처할 수 해야 합니다.</li>
	<li>단일 분자 비디오를 캡처 후 정확 하 게 중심의 관심 (아오이)의 각 단일 분자의 여기 PSF 포괄 영역에서 localizes Gelles 랩, 망원경 등의 2D 가우스 피팅 알고리즘을 사용 하 여 비디오를 처리 합니다.</li>
	<li>모든 단일 분자 위치 정밀도를 선택 < 10 nm 단일 분자 위치 2D 가우스 기능 장착의 분포에 따라 속눈썹의 센터 수정. 참고: 사용 하 여 2D 3D 변환 알고리즘, IFT20-GFP와 AP SSTR3 노선의 3D 전송 노선 명확 하 게 표시 됩니다 속눈썹 또는 속눈썹 axonemal 막에 각각.</li>
</ol>3입니다. 2D 3D 변환
<ol><li>일단 몇 천 지역화는 cilium에서 분자 (신호 소음 비율 > 11를) 환승에 대 한 수집, X 차원으로는 cilium의 긴 축을 선택 합니다. 위치 Y 차원 히스토그램을 확인 하 고 10 nm 단위로 빈 합계를 얻을. 참고: 2D 3D 변환 손 또는 어떤 소프트웨어 또는 프로그래밍 언어에 의해 평가 될 수 있습니다. 저자는 성공적으로 Matlab에 파이썬 2.7 변환을 구현 했습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

이 프로토콜 속도 현미경의 기본 cilium, 셀룰러 신호 세포 기관이 매우 효율적인 단백질 수송에 의존 하는 응용 프로그램을 설명 합니다. 속도 현미경 단일 지점 조명은 TZ에 중심을 통과 높은 해상도 (< 10 nm) 위치 붙일 표시 된 분자를 제공할 수 있습니다. 이전 그것은 전인대6,,78매매 단백질 연구에 적용 되었다. 그러나, 그것은 어떤 하위 회절 셀룰러 구멍을 통해 밀매 공부를 확장할 수 있습니다. 이 기술은 장점이 다른 고해상도 이미징 기술을 통해 공간 및 시간 해상도 라이브 셀 시스템에서 단일 단백질 수송의 역학을 캡처할 수 있는 < 10 nm 그리고 < 2 ms, 각각. 또 다른 장점은 이다 하나만 붙일 레이블 관심사의 단백질을 해야 합니다 transfection, 단백질 지 방화, 속도 현미경을 수행 하려면 공부 하는 일반적인 분자 생물학 접...

1873 년에 Ernst Abbe를 정한 이후 기존의 가벼운 현미경의 해상도 때문에 객관적인1,2에서 빛 회절 제한 약 200 nm 될 믿고 되었습니다 있다. 현재, 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법 기술을 휴식이 제한 하 고 하위 회절 (< 200 nm) 해상도와 동적 이미지 캡처를 허용. 기술은 일반적으로 두 개의 광범위 한 범주로을: 자극 방출 소모 (호텔 위치) 현미경 기반으로 접근, 샘플3; fluorophores의 비선형 광학 반응으로 인해 하위 회절 조명 볼륨을 생성 하는 photoactivated 가벼운 현미경 검사 법 (팜) 그리고 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)-지역화 fluorophores의 중심을 다음 reconstitute 이러한 중심 수학 함수를 활용 하는 슈퍼 해상도 기법을 기반으로 양식 슈퍼 해상도 이미지4,5. 현재, 상대적으로 단순한 광학 설치 인해 손바닥과 폭풍 광범위 하 게 채택 된다만 생물학 준비의 긴 비디오의 각 프레임에 fluorophores의 작은 하위 집합을 활성화 하 여. 이로써 더 정확 하 게 지역화, 형광의 2D 가우스 피팅 하 여 불리 포인트 확산 기능 (PSF), 비디오의 각 프레임에 놓여있는지 표시 된 단백질의. 다음 생물 준비1,2의 슈퍼 해상도 이미지를 단일 이미지 비행기 각 붙일 표시 된 분자의 2D 위치 위에 수 있습니다. 이러한 단일 분자 지역화 슈퍼 해상도 현미경에 접근을 확실히 생물 샘플의 영상 이었다 수행 하는 방법을 혁명, 아직도 도전을 극복할 수 있다. 예를 들어 폭풍 팜 수 생물 샘플의 고정 후 그들의 최고의 공간 해상도 달성 고 따라서 현재의 붙일 표시 된 단백질의 정적 표현 전자 현미경의 비슷한 제한입니다. 또한, 라이브 셀에 각 붙일 표시 된 단백질에 대 한 높은 공간적 해상도 달성 하기 위해 샘플 해야 될 몇 군데 단백질 역동성을 캡처 수 있는 매우 긴 프레임에. 따라서, 그것은 이러한 주요 기술 장애물을 극복 하기 위해 필요입니다.
라이브 셀에 빠르게 움직이는 단백질 또는 RNAs를 감지 하는 데 적합된 한 높은 spatiotemporal 해상도 얻으려면, 우리가 개발한 슈퍼 해상도 속도 현미경 우리의 실험실 (그림 1)6,7, 8. 속도 현미경에서 몇 가지 주요 기술 발전 이전 성공적으로 작은 분자의 nucleocytoplasmic 전송 추적을 설정한, 단백질 mRNA, 바이러스 핵 아메리카를 통해 기 공 단지 (Npc)6, 7 , 8. 짧게, 속도 현미경의 다음 기능 것입니다 사용을 추적할 수 라이브 셀, Npc 등 기본 속눈썹에에서 서브 마이크로미터 회전 대칭 구조를 통해 빠른 속도로 움직이는 고분자: (1) 한 경사 또는 수직 조명 PSF 수 있습니다 (그림 1); 초점면에서 작은 회절 제한 볼륨 내에서 단일 분자의 여기를 (2) 경사 PSF 크게 밖의 초점 형광을 방지 하 고 따라서 신호 대 잡음 비율을 향상 시킬 수 있습니다. (3) 100-500 kW의 광학 밀도 / cm2 조명 PSF에서에서 빠른 검색 속도 (> 500 Hz)와 단일 fluorophores에서 수집 하는 광자의 수천 수 있습니다. (4) 빠른 탐지 속도 또한 크게 감소 단일 분자 공간 지역화 오류 (< 10 nm) 분자 확산 주요 요인 중 하나입니다 있기 때문에 살아있는 세포에서 형광 성 분자를 이동의 공간 궤도 결정 분자를 이동 하는 것에 대 한 단일 분자 지역화의 결점을 일으키는. (5) 음 2D 3d 변환 알고리즘 NPC 또는 기본 cilium 분자에 대 한 3D 공간 확률 밀도 지도 전송 경로 제공을 통해 있습니다. 그것은 우리의 변환 프로세스는 직교 및 원통형 조정 시스템 간의 3D 공간 확률 밀도 보다는 3D 지도 단일 분자 추적 (그림 2)를 생성 하는 데 사용은 주목 된다. 이전, 전자 현미경 검사 법 데이터 NPC9,10 및 기본 cilium11 둘 다 회전 대칭 구조를가지고 계시 했다. 원칙적으로, 임의로 NPC 또는 기본 cilium 통해 이동 하는 분자 확산 회전 대칭 배포판 또한 있어야 한다. 무작위로 실린더 내부 분자 확산의 높은 숫자 더 결과 대략 균일 한 NPC에 그만큼 횡단면 보기에서 회전 대칭 배포판 생성 그림 2에서 같이, 공간 두 개의 이웃 링 (그림 2E) 사이 각 매우 작은 하위 영역 내에서 배포. 이 균일 한 분포 지도 원통형 시스템에서 θ 차원 공간 분포는 일정. 다음 3 차원 좌표 (R, X, θ) 2D 좌표 (R, X, 상수) 수를 단순 수 있습니다. 사실, 우리의 변환 프로세스는 직교 및 원통형 시스템 간의 2D (R, X, 상수)를 2 차원 (X, Y)에서입니다. 상수 θ, 방정식 A를 사용 하 여 계산 됩니다 그림 2E에서 공간적 밀도 p 말합니다<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
궁극적으로, 단일 분자 추적 생물학 연구에서 광범위 한 응용 프로그램은, 따라서, 그것은 자연 기술의 과다 특정 생물 학적 틈새12,13,14을 채우기 위해 개발 될 것 이다. 이러한 속도 현미경의 경우 이다입니다. 이전에 3D 변환 알고리즘으로 사용할 경우,이 기술은 환승 NPCs, 하위 diffraction 크기와 회전 대칭 생물학 구조6통해 분자의 3D 전송 경로 해결 하기 위해 개발 되었다. 이 논문에서는, 기본 속눈썹 우수한 모델 세포도 표시 됩니다. 기본 속눈썹은 대부분 포유류 세포15,16,17의 표면에서 프로젝트는 원통형, 안테나 모양의 세포 (~ 125 nm radius). 그들은 외부 신호를 수신 하 고 성장 및 대사15,16와 일반적으로 관련 된 세포내 응답 전송에 대 한 책임이 있습니다. 따라서, 구조 단백질의 플럭스, 막 횡단 수용 체와 세포내 메신저의 전송의 재활용 기본 속눈썹의 중요 한 책임입니다. 셀 몸과 기본 속눈썹 사이 접합에는 전환 영역 또는 TZ,이 통해이 모든 단백질 전송 발생11,,1819, 중요 한 선택도 장벽 20. TZ의 제어 기능 이외에 두 개 이상의 전송 프로세스, intraflagellar 전송 및 수동 확산이 지역16,21, 를 통해 단백질의 움직임에 대 한 책임 것으로 생각 22. 인간의 건강 관점에서 기본 속눈썹의 손실 및 다운스트림 신호의 후속 규제 많은 암의 특징입니다. 또한, Bardet-Biedl 증후군, polycystic 신장 질환 등 많은 유전 질환, 불완전 단백질 전송23와 연결 됩니다. 하위 회절 제한 크기와는 TZ 통해 선택적 단백질 수송의 복잡 한 과정 기본 속눈썹이이 기술에 대 한 주요 대상으로 확인합니다. 이 방법은 종이에 속눈썹 막 횡단 단백질, somatostatin 수용 체 3 (SSTR3)의 추적을 시연할 예정 이다 우리24, 알 렉 사 Fluor 647 IFT, IFT2025, 융합된 GFP 분자와 표시의 구성 요소와 외부 표시.

<table><tbody><tr><td>25 cm2 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>VV-01936-00</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ThermoFisher</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염</td>수 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P35GCOL-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-conjugated streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>비오틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>633 nm He-Ne 레이저</td><td>Melles Griot</td><td>25-LHP-928-249</td><td></td></tr><tr><td>561 nm 고체 상태 레이저</td><td>Coherent</td><td>OBIS 561-50 LS</td><td></td></tr><tr><td>488 nm 고체 상태 레이저</td><td>Coherent</td><td>1185053</td><td></td></tr><tr><td>반전 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>1.4-NA 100&times; 오일 이멀젼 아포크로매틱 대렌즈</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100&회;</td><td></td></tr><tr><td>온칩 곱셈 이득 전하 결합 장치 카메라</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascade 128+</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 필터</td><td>Semrock</td><td>Di01- R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/561/635-25X5.0</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드북 6.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>디지털 현미경 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

라이브 주 cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

기본 cilium 많은 진 핵 세포의 표면에는 microtubule 기반 돌출 이며 포함 단백질의 독특한 보완 기능을 비판적으로 세포 운동 성 및 신호 합니다. 속눈썹 자신의 단백질을 합성 할 수 있다, 이후 약 200 독특한 속눈썹 단백질 cytosol와 기본 속눈썹 사이 매매 될 필요가 있다. 그러나, 그것은 여전히 전송 경로 라이브 기본 속눈썹 현재 존재의 제한 때문에이 단백질의 3 차원 (3D) 위치를 지도에 대 한 기술 도전 기법. 도전을 정복, 최근 우리가 발전 하 고 고속 가상 3D 슈퍼 해상도 현미경 검사 법, 단일 포인트에 지-여기 하위 회절 (속도) 현미경 검사 법의 전송 경로 대 한 3 차원 공간 위치를 결정 하 되 나를 고용 둘 다 cytosolic와 라이브 셀의 기본 속눈썹에 막 단백질. 이 문서에서는, 우리 속도 현미경 검사 법, 형광 단백질 분류 속눈썹 단백질, 라이브 cilium 개별 단백질의 실시간 단일 분자 추적 및 공적을 표현 하는 세포의 준비의 자세한 설치를 선보일 예정 이다 3D 공간 확률의 밀도 속눈썹 단백질에 대 한 전송 노선 지도.

이 섹션에서는 기본 속눈썹의 TZ SSTR3 Alexa647 하 ~ 15 nm 외부 링커로 연결의 전송 경로 연구에 속도 현미경 수행에서 얻은 데이터를 보여 줍니다 (그림 3A). 그것은 3D 변환 알고리즘을 확인 하는 이중 목적을 제공 합니다. Alexa647은 레이블 기본 cilium 따라서, 3D 수송 루트의 외부 표면 그 위치에서 고밀도 전송 경로 공개 해야만 한다. NIH-3T3 안정적으로 표현 하는 NPHP3-mCherry는 TZ에는 AP-SSTR3-GFP와 페 고 incubated streptavidin 활용 된 Alexa647와 위의 프로토콜에 따라 해야 합니다. MCherry 라벨의 넓은 필드 이미징은 GFP 셀 원하는 SSTR3 구문 표현 했다 보장 하기 위해 사용 하는 동안에 TZ를 지역화 하는 데 사용 됩니다. 또한 633 nm 광원을 사용 하 여 Alexa647 라...

최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

이 실험의 전반적인 목표는 1차 섬모에서 단백질 수송 경로를 확인하는 것입니다. 이 방법은 정상 섬모와 역기능 섬모의 단백질 수송 경로 차이와 같은 섬모 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 subdiffraction 단백질 수송 경로를 볼 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 가지고 있다는 것입니다.우선, 실험의 1 주 반 전에 섭씨 37 도에서 특별히 설계된 NIH-3T3 세포의 냉동 재고를 해동합니다. 해동된 세포를 3밀리리터의 예열 배지가 들어 있는 25cm 제곱 세포 배양 플라스크로 옮깁니다. 세포를 섭씨 37도로 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 유지합니다.80% 농도에 도달할 때까지 세포를 배양한 다음 세포를 분할합니다. 세포를 분리하려면 섭씨 37도에서 2분 동안 0.25% 트립신으로 트립신화합니다. 짧은 배양 후 트립신을 흡인하고 2ml의 예열 배양 배지로 교체합니다.배지를 피펫으로 주입하여 세포 클러스터를 분리한 다음 플라스크에서 세포의 75%를 제거하고 총 배지 부피를 최대 3ml까지 가져옵니다. 세포 주기의 균질성을 보장하기 위해 실험 전에 세포를 최소 세 번 분할합니다. 실험 이틀 전에 세포를 분할하고 1.5ml의 동일한 배양 배지가 있는 35mm 유리 바닥판에 60-70% 포화도를 도금합니다.그런 다음 실험 하루 전에 원하는 플라스미드로 세포를 화학적으로 transfection합니다. 500-1000 나노그램의 플라스미드를 1 대 2.5 비율로 transfection 시약과 0.25 ml의 환원된 혈청 배지와 30분 동안 항생제 없이 혼합합니다. transfection complex가 형성되면 35mm 유리 바닥 접시에서 배지를 흡인하고 0.25mm transfection 혼합물과 항생제를 사용하지 않은 1.25mm의 추가 환원 혈청 배지로 교체하고 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣습니다.외부에 라벨링된 SSTR3 구조체가 있는 세포의 경우 실험 1시간 전에 유리 바닥 접시에서 배지를 제거합니다. PBS 1ml로 세포를 5회 세척하고 Alexa 647 복합 스트렙타비딘 1마이크로몰로 보충된 환원된 혈청 배지 1ml를 추가합니다. 실험 15분 전까지 유리 바닥 접시에서 배지를 제거하고 1ml의 PBS로 세포를 5회 세척합니다.그런 다음 이미징 버퍼를 1ml의 유리 바닥 접시에 추가합니다. 유리 바닥판을 s에 부착합니다.tage 현미경에서. GFP 필터 세트를 사용하여 GFP Express cell을 찾고 1차 섬모에서 SSTR3-GFP를 적절하게 발현하는 cell을 찾습니다.적합한 세포를 찾으면 1차 섬모 기저부의 NPHP4-mCherry 스폿을 레이저의 단일 포인트 조명에 해당하는 이미징 평면의 위치에 정렬합니다. snap 기능을 사용하여 초점 제어 창의 카메라 탭에서 녹색 형광 단백질로 태그된 NPHP4-mCherry 및 SSTR3 단백질의 상피 형광 이미지를 캡처합니다. 참조 이미지가 얻어지면 20초 동안 1밀리와트 레이저 조명으로 전이 영역을 광표백하여 표지된 단일 분자의 농도를 국부적으로 줄입니다.단일 분자 추적을 준비하려면 Alexa 647로 라벨링된 분자에 대해 레이저 조명 출력을 0.5밀리와트로 줄입니다. 게인과 강도를 최대로 설정하고 프레임 속도를 2밀리초로 설정합니다. 그런 다음 초점 제어 창의 카메라 탭에서 스트림 버튼을 클릭하고 적절한 조명 레이저를 작동시킵니다.광표백되지 않은 표지된 단일 분자가 전이 영역의 광표백 영역을 통해 운반될 때 기록합니다. 그리고 섬모 표류의 영향을 피하기 위해 2분 이하의 비디오를 녹화하는 것을 잊지 마십시오. 단일 분자를 캡처한 후 Gelles 실험실의 Glimpse와 같은 2D 가우스 피팅 알고리즘을 사용하여 비디오를 처리하여 각 단일 분자의 여기점, 확산 함수 및 포괄하는 관심 영역의 중심을 정확하게 국소화합니다.마지막으로, 10나노미터 이상의 정밀도로 모든 단일 분자 위치를 선택하고 2D 가우스 함수와 일치하는 단일 분자 위치의 분포를 기반으로 섬모의 중심을 수정합니다. 이 비디오에 설명된 바와 같이 단일 포인트 조명을 사용하여 NPHP4-mCherry로 표시된 전이 영역을 통해 SSTR3 분자가 태그된 AF647을 추적할 수 있습니다. 데이터 분석 전에 광시야 조명에 단일 분자 비디오를 겹쳐 놓는 것은 레이저가 올바르게 정렬되었는지, 적절한 신호 대 잡음비가 있는지 확인하는 데 유용한 검증 단계입니다.여기에서 이미지화한 것은 염색에 의해 식별된 원발성 섬모가 있는 세포입니다. IFT20은 Arl13b-mCherry로 표시된 1차 섬모 내부의 미세소관을 따라 화물을 운반하는 편모 내 운송 복합체의 구성 요소입니다. 일단 확인되면 속도 현미경 검사를 사용하여 개별 IFT20-GFP 단백질을 추적합니다.다음으로, 2D에서 3D로의 변환 알고리즘을 사용하여 1차원을 따라 일차 섬모 내부 단백질의 공간 확률 밀도 분포를 생성합니다. 이 고밀도 영역은 편모내 수송 경로의 알려진 위치와 일치하는 축삭 미세소관과 공동 국소화될 가능성이 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시스템 오류를 최소화하기 위해 샘플을 레이저와 정확하게 정렬하는 것이 중요합니다.이 동영상을 시청한 후에는 속도 현미경으로 단일 분자 추적을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며 1차 섬모에서 단일 분자 수송 경로를 얻는 방법을 알게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Live Primary Cilium에 고속 초고해상도 SPEED 현미경 적용

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

본 연구에서는 초구조 분석을 위한 전자 현미경 방법과 함께 생체 외 CPEC 섬모의 움직임을 실시간 관찰 및 분석할 수 있도록 상세한 광학 현미경 기술을 최적화했습니다.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.

면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출

여기에 제출된 것은 손상되지 않은 조직에서 초해상도 라이브 세포 이미징을 위한 프로토콜입니다. 우리는 그것의 네이티브 조직 환경에 있는 높게 민감한 성인 줄기 세포 인구를 화상 진찰을 위한 조건을 표준화했습니다. 이 기술은 살아있는 조직에서 생물학적 현상의 직접적인 관찰을 허용하는 시간적 및 공간 해상도의 균형을 포함한다.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

고속 비디오 현미경 분석은 비교적 수행하기 쉽고 빠르며 비용 효율적이며 숙련 된 손에는 원발성 섬모 운동 장애의 첫 번째 라인 진단을위한 상당히 신뢰할 수있는 도구로, 진단 및 중증 폐 질환 치료와 관련된 모든 센터에서 사용할 수 있어야합니다.

원발성 섬모 운동장애의 일선 진단을 위한 고속 비디오 현미경 분석

초고해상도 현미경은 감수 분열의 시냅톤 복합체 내 구성 요소 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 Caenorhabditis elegans synaptonemal 복합체의 개별 단백질을 해결하기위한 프로토콜을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans 생식계열 내 시냅톤 복합체의 초고해상도 현미경

이 방법은 조직 수집에서 섬모 조직 분석에 이르기까지 광물화된 조직의 넓은 영역에 걸쳐 원발성 섬모를 3차원으로 제 자리에서 이미지화하기 위해 ARL13B-CENTRIN-2 형질전환 마우스 모델에서 내인성 신호를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 조직에도 적용될 수 있습니다.

ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

학습하세요 라이브 세포에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경을 이용한 1차 섬모의 단백질 수송 경로 매핑 방법. NIH-3T3 세포를 사용하여 정상 및 기능 장애 섬모의 수송 경로 차이를 분석하고 세포 신호 전달 메커니즘을 규명합니다.

라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

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