유도 및 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 마이크로-CT 영상
2017년 9월 4일
이 프로토콜 대뇌 동굴 같은 기형 질병 마우스 모델에서의 유도 및 고 사용 대비 향상 된 병 변 부담을 측정 하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영. 이 방법은 분자 기초 및 대뇌 동굴 같은 기형에 대 한 잠재적인 치료 및 기타 뇌혈관 질병 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.
이 절차의 전반적인 목표는 신생아 마우스에서 뇌 해면상 기형을 유도하고 마이크로 CT를 사용하여 질병 부담을 측정하는 것입니다. 이 방법은 뇌 해면상 기형과 같은 뇌 혈관 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신생아 마우스 모델의 뇌 해면체 기형 질환 부담을 기존 방법에 비해 정확하고 효율적으로 결정할 수 있다는 것입니다.
뇌 해면상 기형의 유도 및 마이크로 CT 분석 단계는 정교한 소프트웨어의 경험과 사용이 필요하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 먼저 4-HT를 100% 에탄올에 10밀리리터당 10밀리그램의 농도로 용해시킵니다. 30 마이크로 리터 알라 쿼드를 준비 한 다음 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
사용 당일에는 옥수수 기름에 4-HT의 알라쿼드를 밀리리터당 0.5밀리그램으로 희석합니다. 그런 다음 인슐린 주사기를 사용하여 50마이크로리터의 4-HT를 P1 신생아 새끼에게 주입하여 실험적 CCM 병변을 유도합니다. 29 게이지 바늘이 장착된 10ml 주사기에 3ml의 2% 파라포름알데히드 및 PBS를 채워 샘플 준비를 시작합니다.
그런 다음 안락사화된 P8 강아지에게 쥐 심장의 심실에 바늘을 삽입하고 파라포름알데히드를 가득 채우는 것을 천천히 주입하여 심장 내 풍성함을 수행합니다. 가위를 사용하여 머리를 분리한 후 머리에서 피부를 제거하고 집게를 사용하여 두개골을 벗겨내어 뇌 전체를 4%의 파라포름알데히드와 PBS로 해부합니다. 후: 섭씨 4-HT도에서 밤새 뇌를 고정합니다.
다음 날, 겸자를 사용하여 뒷뇌를 분리하고 PBS 용액으로 헹굽니다. 그런 다음 Lugol의 요오드 용액에서 뒷뇌를 48시간 동안 배양합니다. 배양 후 뒷뇌를 잠시 자연 건조하여 과도한 Lugol의 요오드 용액을 제거합니다.
그런 다음 Lugol의 요오드로 염색된 뒷뇌를 0.65마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에 포장하고 조직 수축을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀 필름으로 완전히 밀봉합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 스펀지가 있는 5ml 플라스틱 튜브에 넣어 스캔하는 동안 움직이지 않도록 합니다. 뒷뇌가 들어 있는 튜브를 micro-CT 시스템의 알루미늄 홀더에 수직으로 장착합니다.
스캔 매개변수를 설정합니다. 540개의 투영법과 50kV 및 10W의 소스 조건에서 2초의 노출 시간을 사용하여 단층 촬영 데이터셋을 획득합니다. 스캔의 무선 그래프는 마이크로 CT 시스템에서 제공하는 하드웨어 기반 프로젝션 재구성 소프트웨어에 의해 자동으로 재구성되어 16비트 축 슬라이스의 이미지 시리즈를 생성합니다.
Lugol의 요오드 대조 마이크로 CT는 CCM 병변을 충분히 검출했습니다. 스캔된 X-ray 이미지를 재구성하여 쥐 뇌의 3D 이미지를 생성했으며, 이를 통해 뇌 실질의 전체 병변을 다양한 깊이와 방향에서 시각화하고 뇌 병변의 구조를 3D 위치에서 평가할 수 있었습니다. 이 표는 라벨링된 개별 병변의 정량적 출력의 예를 보여줍니다.
개발 후 이 기술은 혈관 질환 분야의 연구자들이 마우스 모델의 뇌 해면상 기형에 대한 메커니즘 및 치료 옵션을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 마우스 모델에서 CCM 병변을 유도하는 방법과 micro-CT 기법으로 CCM 병변 부담을 획득하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 프로토콜은 신생 생쥐에서 뇌 해면상 혈관기형 질환을 유도하고 micro-CT를 활용하여 병변 부하를 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 뇌 해면상 혈관기형 및 기타 뇌혈관 질환의 분자적 기초와 잠재적 치료법에 대한 이해를 증진합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 혈관 생물학
- 마우스 모델
배경
- 뇌 해면상 혈관 기형(CCM)은 심각한 신경학적 문제를 일으킬 수 있는 혈관 병변입니다.
- 마우스 모델에서 질병 부담을 측정하는 기존 방법들은 종종 효율성이 떨어집니다.
- Micro-CT는 병변을 시각화하고 정량화할 수 있는 비침습적인 방법을 제공합니다.
- CCM에 대한 이해는 다른 뇌혈관 질환에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
연구 목적
- 신생 생쥐에서 뇌 해면상 혈관 기형을 유도하기 위함입니다.
- micro-CT를 사용하여 질환 부담을 정확하게 측정하기 위함입니다.
- 뇌혈관 질환 연구 방법론을 개선하기 위함입니다.
사용된 방법
- CCM 유도를 위한 용액 제조를 위해 4-HT를 에탄올에 용해합니다.
- -80 °C 보관을 위한 분주액을 준비합니다.
- 이미징을 위해 조영 증강 마이크로 CT를 활용합니다.
- 유도 및 분석 과정을 시각적으로 시연합니다.
주요 결과
- 이 방법은 CCM 질환 부담을 정확하고 효율적으로 결정할 수 있게 합니다.
- Micro-CT는 마우스 모델에서 병변을 명확하게 시각화합니다.
- 신생 마우스에서 CCM 유도를 성공적으로 달성하였습니다.
- 이 접근 방식은 잠재적 치료법에 대한 추가 연구를 촉진할 수 있습니다.
결론
- 본 프로토콜은 CCM 연구를 위한 마우스 모델의 가치를 높여줍니다.
- Micro-CT는 뇌혈관 질환의 부담을 평가하는 강력한 도구입니다.
- 향후 연구에서는 이 방법론을 기반으로 치료 옵션을 탐색할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
유전자 변형 마우스 모델에서 뇌해면상혈관기형(CCM)의 정량적 마이크로-CT 영상 촬영은 병변 부하의 정밀한 평가를 가능하게 하여, 뇌혈관 질환 연구에서 기전적 리스크 제거 및 타겟 검증을 지원합니다. 이러한 접근 방식은 초기 단계의 치료 가설 검증에 대한 예측 신뢰도를 높이고, 강력하고 재현 가능한 병변 정량화를 제공함으로써 포트폴리오 우선순위 결정에 정보를 제공합니다. 고해상도 영상 촬영과 유전적 질환 모델의 통합은 이 워크플로우를 혈관 생물학 파이프라인의 중개 연속성을 위한 핵심적인 전환점으로 자리매김하게 합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 질환 모델에서 CCM 유전자 기능과 경로 관여도를 엄격하게 조사할 수 있게 합니다.
- 표적 유전자 결손 후 병변 형성을 정량화함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 질환 관련 표현형의 직접적인 측정을 통해 기능적 표적 검증을 제공합니다.
- 추후 연구를 위한 분자 표적의 선택 또는 우선순위 제외에 있어 예측 신뢰도를 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 화합물 스크리닝을 위한 검증된 마우스 모델 및 이미징 프로토콜을 수립합니다.
- 어세이 개발 및 재현성 평가에 적합한 표준화된 정량적 병변 지표를 제공합니다.
- 전임상 단계에서 치료적 개입에 대한 확장 가능한 고처리량 평가를 가능하게 합니다.
- 일관된 이미징 결과물을 통해 실험 조건 간의 신뢰할 수 있는 비교를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 바이오마커 개발을 위해 전임상 모델을 인간 질환 유전학과 일치시킵니다.
- 유전자 발견부터 치료 가설의 전임상 검증까지의 연속성을 보장합니다.
- 질병 진행 및 중재 효능에 대한 정량적 엔드포인트를 제공함으로써 중개 연구의 위험을 줄입니다.
- 임상 중개와 관련된 뇌혈관 병리에 대한 기전적 이해를 강화합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 마우스 모델에서 가설 기반의 유전적 조작과 정량적 표현형 분석을 가능하게 함으로써 초기 발견과 전임상 연구 사이의 가교 역할을 하며, 리드 물질 식별 및 중개 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 발견 생물학: 유전적 병변 유도 및 정량화를 통해 귀무가설 검정과 경로 규명을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 분석 준비 상태 및 화합물 평가를 위해 재현 가능하고 정량적인 영상 출력물을 제공합니다.
- 분석학: 실험군 간의 통계적 비교를 지원하기 위한 부피 및 수치적 병변 데이터를 제공합니다.
- 중개 연구: 전임상 연속성을 위해 유전적 모델과 질병 관련 종말점을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 뇌혈관 연구 프로그램을 위한 재사용 가능한 영상 및 분석 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 타겟 검증에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 병변 정량화 및 이미징 워크플로우를 표준화하여 재현성과 확장성을 확보합니다.
- 전략적 가치: 견고한 전임상 데이터를 제공함으로써 go/no-go 결정에 근거를 제시하고 자본 효율성을 높입니다.
- 포트폴리오 영향: 혈관 질환 프로그램의 위험 조정 우선순위 설정 및 추진을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 유전자 변형 마우스 모델 핸들링 및 micro-CT 영상 촬영 프로토콜에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 고해상도 micro-CT 장비 및 전문 분석 소프트웨어의 사용 권한이 필요합니다.
- 영상 파라미터 및 데이터 해석에 대한 팀 간의 표준화가 필수적입니다.
- 다양한 유전적 배경이나 병변 유형에 따라 프로토콜의 조정이 필요할 수 있습니다.
- 데이터 품질을 보장하기 위해 정밀한 시료 준비 및 영상 촬영 조건에 의존합니다.
