Name: 유도 및 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 마이크로-CT 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 배우세요 신생아 마우스에서 대뇌 동굴 같은 기형을 유도하고 마이크로-CT로 병변 부담을 정확하게 측정하는 방법을. 이 기술은 뇌혈관 질환의 분자 기전과 치료법 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자 인정 시설 및 현미경 검사 법 및 시드니의 대학에 Microanalysis (ACMM)에 대 한 시드니 현미경 및 Microanalysis 연구 시설 (AMMRF)와 호주 중심의 과학 및 기술 지원. 이러한 연구는 호주 국민 건강에 의해 지원 되었다 고 의료 연구 위원회 (NHMRC) 프로젝트는 161558 및 APP1124011 (XZ)를 부여 합니다.

모든 동물 윤리 및 프로토콜 시드니 지역 건강 지구 동물 복지 위원회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 천진 의과대학의에 의해 승인 했다. 모든 실험 100 주년 연구소, 시드니 대학, 천진 의과대학의 지침/규정에 따라 실시 했다 1. 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 유도 <ol><li>크로스 Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/플로리다 Ccm2 fl/플로리다와 새끼를 생성 하와 쥐 Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/플로리다 (Ccm2 iECKO) 새끼 및 littermate 컨트롤 (Ccm2 fl/플로리다). Cdh5-CreErt2 및 Ccm2 fl/플로리다 동물 앞에서 설명한 19 되었습니다.</li>
	<li>4HT 100% 에탄올에 녹이 고 30 µ L의 aliquots에서-80 ° C에서 저장 (4HT 농도: 10 mg/mL). 사용 당일, 옥수수 오일 (0.5 mg/mL)에서 aliquoted 4HT 희석.</li>
	<li>Intragastrically 4HT의 50 µ L를 주사 (0.5 mg/mL)는 인슐린 주사기를 사용 하 여 실험 CCM 장애를 유도 하는 p 1에서 신생아 강아지를.</li>
</ol> 2. 마이크로-CT 검사에 대 한 준비를 샘플 <ol><li>이산화탄소 질 식 통해 P8에 신생아 강아지를 안락사.</li>
	<li>마우스 심장의 심 실에 10 mL 주사기에 PBS에 2% paraformaldehyde 3 mL와 29 게이지 바늘을 삽입 하 여 내 심장 관류 수행. 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 착용.</li>
	<li>는가 위를 사용 하 여 본문에서 머리를 분리 합니다. 머리는 위를 사용 하 여 모든 피부를 제거 하 고 껍질 전체 뇌 해 부를 집게를 사용 하 여 두개골을.</li>
	<li>Stereomicroscope와 두뇌의 확대, 1 x 이득, 0.6, 감마와 20 ms 노출 시간 x 7.82에서 촬영할.</li>
	<li>해결 해 부 두뇌 PBS 솔루션에서 4 %paraformaldehyde 하룻밤. 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 착용.</li>
	<li>다음 날에는 집게를 사용 하 여 hindbrains를 분리 하 고 PBS 솔루션 세척.</li>
	<li>Lugol에 hindbrains를 품 어 &#39; 48 h. s 요오드 솔루션</li>
	<li>인큐베이션, 다음 짧게 공기 건조 초과 Lugol 제거 하려면 hindbrains &#39; s 요오드 솔루션.</li>
	<li>는 Lugol 팩 &#39; s 요오드 스테인드 0.65 mL microcentrifuge 튜브에 조직을 수축 ( 그림 2 A)를 피하기 위해 플라스틱 파라핀 영화와 완전히 물개 hindbrains.</li>
	<li>스캔 ( 그림 2 B) 동안 이동에서 그들을 방지 하기 위해 스폰지와 함께 5 mL 플라스틱 튜브에서 microcentrifuge 튜브 장소.</li>
</ol> 3. 쥐의 뇌에서 CCM 마이크로-CT 스캔 <ol><li>수직 마이크로 CT 시스템에서 알루미늄 홀더에 튜브에 포장 hindbrain 탑재.</li>
	<li>540 투영 및 50의 소스 상태 2 s 노출 시간에 검색 매개 변수를 설정할 단층 데이터 집합 (이미지 해상도 9.5 μ m/픽셀)을 얻으려고 kV 및 10 W.</li>
	<li>검사에서 검사는 재건축 자동으로 하드웨어 기반 투영 재구성 소프트웨어 마이크로 CT 시스템을 제공한 16-비트 축 조각의 이미지 시리즈 생산 (&#34; TXM &#34; 파일).</li>
</ol> 4. 마이크로-CT 데이터 집합의 분석 <ol><li>복원된 이미지 파일 (&#34; TXM &#34; 파일) 3 차원 분석 소프트웨어에서 두뇌를 사용 하 여 시각화는 &#34; 볼륨 렌더링 &#34; 함수.</li>
	<li>변환 사용 하 여 원하는 방향 hindbrain는 &#34; 경계 상자 &#34; 및 &#34; 클리핑 평면 &#34; 기능.</li>
	<li>확장된 모드에서 변환 된 이미지를 다시 샘플링 하 고 복 크기 보존.</li>
	<li>만들기 &#34; 새 레이블 필드 편집 &#34; 변환 된 이미지 (4.3)에 hindbrain 스케일 강도 사용 하 여 강조.</li>
	<li>강조 표시 된 영역을 추가 하 고 실행 &#34; 분석 라벨 &#34; 전체 hindbrain (즉, 전체 볼륨 및 지역)의 측정을 얻을. 측정 Excel 파일로 내보내기.</li>
	<li>Hindbrain를 사용 하 여 시각화는 &#34; isosurface 렌더링 &#34; 함수.</li>
	<li>다른 만드는 &#34; 새로운 레이블 필드 편집 &#34; 병 변과 스케일 강도 사용 하 여 변환 된 이미지와 하이라이트 영역에.</li>
	<li>강조 표시 된 영역을 추가 하 고 실행 &#34; 레이블 &#34; hindbrain (즉, 전체 볼륨 및 지역) 내에서 장애의 측정을 얻기 위해 분석. 측정 Excel 파일로 내보내기.</li>
	<li>시각화를 사용 하 여 병 변은 &#34; 표면 생성 &#34; 및 &#34; 보기 표면 &#34; 기능.</li>
	<li>Hindbrain 원하는 방향에서의 이미지를 스냅숏 또는 생성 하는 장애의 3 차원 시각화를 위한 영화.</li>
</ol>

<ol><li>Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations%3A+from+CCM+genes+to+endothelial+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis.</a> Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).</li>
<li>Liquori, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+gene+encoding+a+novel+protein+containing+a+phosphotyrosine-binding+domain+cause+type+2+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).</li>
<li>Laberge-le Couteulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+mutations+in+CCM1%2C+encoding+KRIT1%2C+cause+hereditary+cavernous+angiomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas.</a> Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).</li>
<li>Sahoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gene+encoding+KRIT1%2C+a+Krev-1%2Frap1a+binding+protein%2C+cause+cerebral+cavernous+malformations+%28CCM1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1).</a> Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).</li>
<li>Denier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+MGC4607+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).</li>
<li>Bergametti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+programmed+cell+death+10+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).</li>
<li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+cerebral+cavernous+malformations+based+on+the+two-hit+mutation+hypothesis+recapitulates+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease.</a> Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).</li>
<li>Boulday, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+timing+of+CCM2+loss+influences+cerebral+cavernous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).</li>
<li>Chan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+2+distinct+genetic+pathways+result+in+cerebral+cavernous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations+arise+independent+of+the+heart+of+glass+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor.</a> Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).</li>
<li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasudil+decreases+lesion+burden+in+a+murine+model+of+cerebral+cavernous+malformation+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease.</a> Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Gibson, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+identifying+repurposed+drugs+for+the+treatment+of+cerebral+cavernous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation.</a> Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).</li>
<li>Choi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+Imaging+Reveals+Mekk3+Heterozygosity+Prevents+Cerebral+Cavernous+Malformations+in+Ccm2-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice.</a> PLoS One. 11 (8), 0160833(2016).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations+arise+from+endothelial+gain+of+MEKK3-KLF2%2F4+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiol. 9, 11(2009).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), 61(2006).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Procedure+for+Rapid+Imaging+of+Adult+Mouse+Brains+with+MicroCT+Using+Iodine-Based+Contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast.</a> PLoS One. 10 (11), 0142974(2015).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+cerebral+cavernous+malformation+pathway+controls+vascular+stability+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth.</a> Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

CCM은 개인1의 0.5%까지 영향을 미치는 일반적인 혈관 기형입니다. CCM 산발적 또는 가족 형태로 발생할 수 있습니다. 환자 예 후 명확 하지 않습니다 종종 CCM 병 변 원인 뇌졸중 및 기타 신경학 상 결과 예기치 않게 파열 수로. 현재 유일한 치료 옵션은 높은 위험을 동반 하는 병 변 수술로 제거 하는.
인간의 CCM 조건에 재현 되어 최근 동물 모델7,8,,910. 이러한 모델 메커니즘 CCM 질병에 관련 된 조사를 귀중 한 도구를 제공 합니다. 효율적이 고 정확한 양적 분석 방법은 이러한 모델의 전체 가치를 활용 하는 데 도움이 됩니다.
최근 이미지...

CCM는 얇은 벽으로, 뇌의 혈관 기형 인간의 인구1에서 최대 0.5%의 보급으로 크기. CCM 3 개의 유전자 중 하나에 손실의 기능 돌연변이 때문에 지배적인 무질서로 상속 될 수 있습니다: CCM1 (일명 Krit1), CCM2및 CCM3 ( PDCD10라고도 함)2,3,4 ,,56. 이 유전자는 복잡 한 신호에 존재 하는.
CCM7,8,,910에 대 한 책임은 CCM 유전자의 다운스트림 경로 이해 하 고 모델 인간의 CCM 질병에 다양 한 모델 개발 되었습니다. 가장 강력한 모델 조건부로 신생아 강아지8,10p 1에서 tamoxifen을 유도할 수 있는 Cdh5 CreERT2 와 함께 Ccm 유전자 중 하나를 삭제 하는 것입니다. 이 새끼는 이후 P6에서 뇌 병 변 CCM을 개발 하 고 검색 메커니즘에 대 한 전 임상 연구 및 치료제 CCM 질병 치료에 대 한 이상적인 모델이 될 것으로 예상 된다.
쥐의 뇌에서 CCM 병 변 부담 조직학 기반 방법, 매우 시간이 걸리는 하는 방식으로 주로 측정 되었다 하 고 조사에 따라 바이어스10,,1112. MRI 기반 방법 성인 마우스 모델9,13CCM 병 변 부담을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나, 고도로 전문화 된 작은 동물 MRI 계기와 하룻밤 몇 시간의 긴 검색 시간 CCM 병 변 식별에 만족 스러운 해결책을 달성 하기 위해 필요 합니다. 또한, 여부 MRI 신생아 쥐에 있는 CCM 장애 감지를 사용할 수 있는 보고 하지 않은 고 해상도 감도 제한할 수 있습니다.
우리는 최근 이미지 CCM 병 변14,15를 분석 하는 마이크로-CT 기술 개발. 이 고해상도, 시간 및 비용 효율적인 방법을 극적으로 증가 기계 및 치료 연구에 CCM 질병 모델의 값. 대비 향상, 전체 마운트 착 방법 부드러운 조직 및 마우스 배아16,17의 마이크로-CT 영상에 대 한 사용 되었습니다. 이전에 우리는 오스뮴 기반 얼룩을 사용 뇌14병 변 CCM의 마이크로-CT 영상에 대 한 대비 향상. 이 문서에서 우리는 더 적은 독성, 비-파괴적인, 사용 하 고 비용 효율적인 시는 요오드 기반 Lugol의 솔루션, 마이크로-CT 영상에 대 한 대비를 강화 하. 요오드 두뇌에 걸쳐 확산 수 있으며 혈18에 대 한 높은 선호도 있습니다.
자세한 프로토콜은 여기는 이미징 함께 신생아 마우스 모델에서 CCM 변의 유도 및 발표 대비 기반 마이크로 중부와 CCM 장애의 분석 이 마이크로-CT 기반된 메서드 CCM 병 변 양의 양적 글로벌 측정, 수와 쥐의 뇌 병 변 CCM의 3 차원 위치를 정확 하 게 식별 하며 비용을 크게 줄일 수와 시간 표현 형이이 동물 있어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>4-하이드록시 타목시펜</td><td>시그마-알드리치</td><td>H6278</td><td>Cdh5-CreErt2 옥수수 기름을 활성화하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td>C8267-500ML</td><td>4-하이드록시 타목시펜을 희석하기 위해</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>라이카</td><td>M205FA</td><td>거시적 이미지를 촬영하기 위해</td></tr><tr><td>루골의 요오드 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>L6146</td><td>콘트라스트 마이크로 CT</td></tr><tr><td>를 위해 샘플을 염색하기 위해플라스틱 파라핀 필름</td><td>파라 필름</td><td>PM992</td><td>샘플 패키징 마이크로</td></tr><tr><td>CT</td><td>Xradia</td><td>MicroXCT-400</td><td>마이크로 CT</td></tr><tr><td>3D 렌더링 소프트웨어</td><td>FEI 시각화 과학 그룹</td><td>Avizo 3D 이미지 처리 소프트웨어</td><td>마이크로 CT 스캔 분석</td></tr></tbody></table>

유도 및 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 마이크로-ct 영상

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

돌연변이 CCM1 (일명 KRIT1), CCM2, 또는 CCM3 (일명 PDCD10) 유전자는 인간의 대뇌 동굴 같은 기형 (CCM) 일으킬. CCM 질병 마우스 모델 출생 후 동물에서 Ccm 유전자의 tamoxifen 유도 삭제에 의해 설립 되었습니다. 이 마우스 모델 분자 메커니즘 및 CCM 질병에 대 한 치료 접근을 조사 하는 귀중 한 도구를 제공 합니다. 병 변 및 진행을 평가 하는 정확 하 고 양적 방법 이러한 동물 모델의 전체 가치를 활용 하기 위해 필수적 이다. 여기, CCM 질병 마우스 모델에서의 유도 시연 하 고 대비를 사용 하 여 향상 된 마우스 두뇌에서 측정 CCM 병 변 부담 x 선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 메서드. 출생 후 하루 1 (P1), 우리 다니엘 Ccm2의 floxed 대립 유전자를 Cdh5 CreErt2 transgene에서 Cre recombinase 활동을 활성화 하기 위해 4-hydroxytamoxifen (4HT) 사용. 마우스 두뇌 병 변 CCM P8에 분석 되었다. 마이크로-CT, 뇌 조직에 대비 향상을 기반으로 하는 요오드는 Lugol의 솔루션 사용 되었습니다. 우리는 검색 매개 변수를 최적화 하 고 이어질 약 25 µ m의 최소 기능 크기 9.5 µ m의 복 치수를 활용. 이 해결책은 세계적으로 그리고 정확 하 게, CCM 병 변 볼륨 및 수를 측정 하 여 마우스 두뇌 병 변 CCM의 높은-품질 3 차원 매핑을 제공 충분 합니다. 이 메서드는 CCM 및 기타 뇌혈관 질환에 대 한 분자 및 잠재적인 치료 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.

P 1에서 4HT의 단일 주사 소 뇌 병 변 CCM을 유도 하기 충분 했다. Lugol의 요오드 화물 대조 마이크로-CT는 충분히 CCM 장애를 감지 하 고 그것의 양 및 수 정할 수 있습니다. 최적화 된 마이크로-CT를 활용 하 여, 우리 Ccm2iECKO 쥐의 hindbrains 병 변 CCM을 몇 군데. 검사 x-레이 이미지 생산 다른 깊이 방향에 뇌 실질에 전체 장애의 시각화를 허용, 마우스 뇌의 3 차원 이미지 평가의 구조와 병 변 두뇌에서의 3 차원 위치를 재건 했다. 중요 한 것은,이 이미지 데이터 집합 병 변의 크기와 병 변 숫자의 효율적이 고 정확한 정량화에 대 한 또한 사용할 수 있습니다.
그림 1 에서는 CCM 변의 성공적인 유도 Ccm2...

이 프로토콜 대뇌 동굴 같은 기형 질병 마우스 모델에서의 유도 및 고 사용 대비 향상 된 병 변 부담을 측정 하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영. 이 방법은 분자 기초 및 대뇌 동굴 같은 기형에 대 한 잠재적인 치료 및 기타 뇌혈관 질병 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.

유도 및 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 마이크로-CT 영상

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

이 절차의 전반적인 목표는 신생아 마우스에서 뇌 해면상 기형을 유도하고 마이크로 CT를 사용하여 질병 부담을 측정하는 것입니다. 이 방법은 뇌 해면상 기형과 같은 뇌 혈관 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신생아 마우스 모델의 뇌 해면체 기형 질환 부담을 기존 방법에 비해 정확하고 효율적으로 결정할 수 있다는 것입니다.뇌 해면상 기형의 유도 및 마이크로 CT 분석 단계는 정교한 소프트웨어의 경험과 사용이 필요하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 먼저 4-HT를 100% 에탄올에 10밀리리터당 10밀리그램의 농도로 용해시킵니다. 30 마이크로 리터 알라 쿼드를 준비 한 다음 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.사용 당일에는 옥수수 기름에 4-HT의 알라쿼드를 밀리리터당 0.5밀리그램으로 희석합니다. 그런 다음 인슐린 주사기를 사용하여 50마이크로리터의 4-HT를 P1 신생아 새끼에게 주입하여 실험적 CCM 병변을 유도합니다. 29 게이지 바늘이 장착된 10ml 주사기에 3ml의 2% 파라포름알데히드 및 PBS를 채워 샘플 준비를 시작합니다.그런 다음 안락사화된 P8 강아지에게 쥐 심장의 심실에 바늘을 삽입하고 파라포름알데히드를 가득 채우는 것을 천천히 주입하여 심장 내 풍성함을 수행합니다. 가위를 사용하여 머리를 분리한 후 머리에서 피부를 제거하고 집게를 사용하여 두개골을 벗겨내어 뇌 전체를 4%의 파라포름알데히드와 PBS로 해부합니다. 후: 섭씨 4-HT도에서 밤새 뇌를 고정합니다.다음 날, 겸자를 사용하여 뒷뇌를 분리하고 PBS 용액으로 헹굽니다. 그런 다음 Lugol의 요오드 용액에서 뒷뇌를 48시간 동안 배양합니다. 배양 후 뒷뇌를 잠시 자연 건조하여 과도한 Lugol의 요오드 용액을 제거합니다.그런 다음 Lugol의 요오드로 염색된 뒷뇌를 0.65마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에 포장하고 조직 수축을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀 필름으로 완전히 밀봉합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 스펀지가 있는 5ml 플라스틱 튜브에 넣어 스캔하는 동안 움직이지 않도록 합니다. 뒷뇌가 들어 있는 튜브를 micro-CT 시스템의 알루미늄 홀더에 수직으로 장착합니다.스캔 매개변수를 설정합니다. 540개의 투영법과 50kV 및 10W의 소스 조건에서 2초의 노출 시간을 사용하여 단층 촬영 데이터셋을 획득합니다. 스캔의 무선 그래프는 마이크로 CT 시스템에서 제공하는 하드웨어 기반 프로젝션 재구성 소프트웨어에 의해 자동으로 재구성되어 16비트 축 슬라이스의 이미지 시리즈를 생성합니다.Lugol의 요오드 대조 마이크로 CT는 CCM 병변을 충분히 검출했습니다. 스캔된 X-ray 이미지를 재구성하여 쥐 뇌의 3D 이미지를 생성했으며, 이를 통해 뇌 실질의 전체 병변을 다양한 깊이와 방향에서 시각화하고 뇌 병변의 구조를 3D 위치에서 평가할 수 있었습니다. 이 표는 라벨링된 개별 병변의 정량적 출력의 예를 보여줍니다.개발 후 이 기술은 혈관 질환 분야의 연구자들이 마우스 모델의 뇌 해면상 기형에 대한 메커니즘 및 치료 옵션을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 마우스 모델에서 CCM 병변을 유도하는 방법과 micro-CT 기법으로 CCM 병변 부담을 획득하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

induction-micro-ct-imaging-cerebral-cavernous-malformations-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

microCT으로 대비 향상된 작은 동물 혈관 이미징 시리얼에 대한 신속하고 비용 효율 높은 처리량...

MicroCT를 사용하여 대비 향상된 베셀 영상

이 문서에서는, 우리는 수행하기 쉽고 이미지가 성인 마우스 뇌의 혈관 트리를 활용할 수 뇌혈관 캐스팅에 대한 간단한 실용적인 기술을 제시한다.

3D 이미징 및 형태학의 분석을위한 성인 마우스 뇌혈관 캐스팅

출처: Xavier, ALR, et al. 설치류의 수조 마그나에 캐뉼라 이식. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 캐뉼라를 이식하는 절차를 보여줍니다. 이 기술은 바늘에 장착된 캐뉼라를 경막을 통해 거꾸로 된 삼각형 수조 대나로 안내하고 뇌척수액으로 표적으로 전달하기 위해 고정하는 것입니다.

마우스 모델에서 Cisterna Magna에 캐뉼라 이식

이 비디오에서는 loxP 부위와 에스트로겐 수용체에 융합된 Cre 재조합효소 옆에 있는 Ccm2 유전자를 가진 유전자 변형 쥐 강아지가 뇌 해면체 기형(CCM)을 유도하는 데 사용됩니다. 4-하이드록시타목시펜의 투여는 내피 세포에서 Cre를 활성화하여 Ccm2의 결실과 뇌의 CCM 형성으로 이어집니다.

마우스 모델에서 대뇌 해면상 기형의 Cre-LoxP 매개 유도

출처: Choi, J. P.  et al. 마우스 모델에서 대뇌 해면 기형의 유도 및 마이크로 CT 이미징.J. Vis. 특급 (2017)이 비디오는 쥐 뇌에서 대뇌 해면상 기형(CCM) 병변을 시각화하기 위해 마이크로 CT 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 뇌 조직에서 CCM 병변의 밀도와 위치를 평가하기 위해 샘플 준비, 이미징 및 3D 이미지 재구성 단계를 자세히 설명합니다.

마우스 뇌의 대뇌 해면상 기형 병변에 대한 조영제 강화 마이크로 CT 이미징

출처: Kim, D., et. al. 대뇌 혈전색증을 직접 시각화하기 위해 근적외선 형광 이미징과 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 결합했습니다. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 이미징을 사용하여 마우스의 뇌 혈전을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 대뇌 혈전 마우스 모델에는 조영제 역할을 하는 피브린 표적 금 나노 입자가 주입됩니다. 마우스를 마이크로 CT 기계의 침대에 놓고 여러 각도에서 이미지를 획득합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 재구성하고 처리합니다.

Visualization of a Cerebral Thrombus in a Mouse Using Micro-Computed Tomography Imaging(마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미징을 사용한 마우스의 대뇌 혈전 시각화)

이 프로토콜은 대뇌 thromboemboli을 시각화 결합 된 근적외선 형광 (NIRF) 이미징 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술은 혈전 부담과 진화의 정량화 할 수 있습니다. microCT 기술은 금 나노 입자를 사용하여 살아있는 동물 내부 혈전 가시화하면서 NIRF 이미징 기술은 형광 절제 뇌 혈전 표지 가시화.

직접 대뇌 Thromboemboli 시각화를위한 결합 된 근적외선 형광 이미징 및 마이크로 계산 된 단층 촬영

이 기사의 목적은 마이크로 계산 된 단층 촬영 및 전체 선박 세그먼트에 대뇌 vasospasm을 계량 하는 데 사용할 수 있는 볼륨의 결정 후 마우스에서 뇌혈관 나무의 3 차원 재구성을 허용 하는 방법을 제시 하는 것입니다. 거미 막 밑 출혈의 murine 모델입니다.

거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

이 문서에서는 마이크로-CT 영상, 어떤 병 변 양이 정해질 수 있다와 전극 전체 뇌의 맥락에서 높은 정밀도와 위치에 대 한 작은 동물 두뇌를 준비 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

여기에서는 C57BL/6J 마우스에서 경두개 전기응고를 통해 원위 중뇌동맥 폐색(dMCAO) 모델을 확립하고 후속 신경학적 행동 및 조직병리학적 특징을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

원위 중동맥 폐색 기법을 사용한 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 유도

이 프로토콜은 경피적 천자 경로를 통해 종양 세포를 수조 마그나로 주입하여 마우스의 연수막 전이를 강력하게 유도하여 외상 및 두개외 종양 부담을 줄이는 방법을 설명합니다.

마우스의 연수막 전이 연구를 위한 최소 침습적 수조 마그나 주입 모델

배우세요 신생아 마우스에서 대뇌 동굴 같은 기형을 유도하고 마이크로-CT로 병변 부담을 정확하게 측정하는 방법을. 이 기술은 뇌혈관 질환의 분자 기전과 치료법 연구에 필수적인 도구입니다.

유도 및 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 마이크로-CT 영상

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